應(yīng)用DNA 條形碼技術(shù)對(duì)口岸截獲魚(yú)翅物種進(jìn)行鑒定與分析

虞惠貞 趙相鵬 裘慧 張明哲 尹文秀 張荃 沈旭芳 李炎錕 吳姍*

（1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院 浙江杭州 310016；2.中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心）

0 引言

魚(yú)翅，主要為軟骨魚(yú)系鯊魚(yú)翅和某些鰩魚(yú)翅[1]，取自鯊魚(yú)和鰩魚(yú)的背鰭、胸鰭、腹鰭、臀鰭和尾鰭等，富含大量的膠原蛋白， 具有提高免疫力和美容養(yǎng)顏等功效，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[2]。據(jù)報(bào)道，亞洲的魚(yú)翅年進(jìn)口量高達(dá)20 000 t[3]，香港是全球魚(yú)翅貿(mào)易中心[4-5]，市售魚(yú)翅主要為大青鯊、灰鯖鯊、鐮狀真鯊、長(zhǎng)尾鯊等10 多種鯊魚(yú)和鰩魚(yú)[6-8]。鯊魚(yú)和鰩魚(yú)在全球范圍內(nèi)被捕撈，且因其固有的生物學(xué)特性，即生長(zhǎng)速度慢、繁殖力低、成熟期較晚和妊娠期相對(duì)較長(zhǎng)[9-10]，導(dǎo)致生產(chǎn)力相對(duì)較低， 許多鯊魚(yú)和鰩魚(yú)種群被認(rèn)為受到威脅或?yàn)l臨滅絕。在國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）評(píng)估的1 038 種鯊魚(yú)和鰩魚(yú)紅色名錄中， 約20%受威脅物種被歸類為極度瀕危、瀕?；蛞孜Ｎ锓N，另有12%被歸類為近危物種[11]。 此外，《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）附錄Ⅱ列出了真鯊科（2023 年11 月25 日起生效）、長(zhǎng)尾鯊屬、雙髻鯊科、藍(lán)吻犁頭鰩屬、圓犁頭鰩科、犁頭鰩科所有種和其他6 種鯊魚(yú)和鰩魚(yú)[12]。

因此， 必須通過(guò)出口許可制度控制其國(guó)際貿(mào)易（CITES，2023），為嚴(yán)格執(zhí)行《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》，必須采用鑒定技術(shù)在全球鯊魚(yú)產(chǎn)品交易中準(zhǔn)確識(shí)別出這些物種。然而，由于鯊魚(yú)和鰩魚(yú)的種類較多，親緣關(guān)系和形態(tài)特征相似，不易區(qū)分，給海關(guān)監(jiān)管工作帶來(lái)了一定的難度， 故建立快速精準(zhǔn)的魚(yú)翅鑒定技術(shù)對(duì)打擊魚(yú)翅走私、 保護(hù)海洋生物多樣性具有重要意義。

目前，魚(yú)翅的鑒定方法主要包括形態(tài)學(xué)鑒定、理化鑒定和分子生物學(xué)鑒定。完整的、未經(jīng)處理的鯊魚(yú)標(biāo)本通常可以由專業(yè)分類學(xué)家使用形態(tài)學(xué)指標(biāo)在物種層面上進(jìn)行鑒定[13]。通過(guò)非線性復(fù)合濾波器（傅立葉變換）對(duì)完整的干鯊魚(yú)背鰭圖片進(jìn)行處理，可高效地識(shí)別部分魚(yú)翅物種[14]。然而，這些產(chǎn)品類別是特定的，通常不適用于分類物種鑒定或物種組成的確定。穩(wěn)定同位素[15]、紅外光譜[16]和電子顯微鏡分析[17]方法也常被用于干魚(yú)翅的鑒定， 但是這些方法無(wú)法準(zhǔn)確判定魚(yú)翅的物種來(lái)源。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展， 研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多基于DNA 的分析方法來(lái)識(shí)別鯊魚(yú)和鰩魚(yú)物種。 這些方法主要基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）用于擴(kuò)增通用或物種特異性DNA 區(qū)域，主要為特異性PCR、多重PCR、DNA 條形碼和熒光PCR 等方法。特異性PCR 技術(shù)， 即利用鯊魚(yú)的特異性DNA 引物鑒定特定種類的鯊魚(yú)，通過(guò)PCR 產(chǎn)物片段的大小來(lái)確定鯊魚(yú)物種[7]，該方法快速且廉價(jià)，適合在資源有限的情況下常規(guī)使用，僅限于對(duì)少數(shù)物種的檢測(cè)。根據(jù)鯊魚(yú)線粒體的細(xì)胞色素氧化酶I 基因（COI）序列設(shè)計(jì)鯊魚(yú)通用特異性引物， 鯊魚(yú)有效的擴(kuò)增片段大小為228 bp，其他物種則無(wú)片段[18]，該方法可以鑒別魚(yú)翅的真?zhèn)危?但無(wú)法鑒定鯊魚(yú)的種類。 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)，能夠在1 次反應(yīng)中完成雙髻鯊、長(zhǎng)尾鯊、鼠鯊等9 種鯊魚(yú)的高效快速鑒定[19]，該方法的設(shè)計(jì)和條件優(yōu)化成本較高，通用性較差，只能鑒定特異物種。

DNA 條形碼是一種基于測(cè)序的技術(shù)，利用通用引物靶向1 個(gè)短的標(biāo)準(zhǔn)化遺傳區(qū)域來(lái)鑒定物種[20]，通過(guò)DNA 條形碼進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)是種內(nèi)遺傳差異低于種間差異[21]，將未知序列與參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，最終鑒定出物種。 DNA 條形碼也被用來(lái)揭示鯊魚(yú)產(chǎn)品的標(biāo)簽錯(cuò)誤， 以及受威脅和瀕危鯊魚(yú)物種的貿(mào)易。 PAZARTZI 等[22]使用魚(yú)類通用條形碼對(duì)87 份樣品進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)高達(dá)56%的樣品在銷售時(shí)存在標(biāo)簽錯(cuò)誤的問(wèn)題，其中23%的物種被列入CITES 附錄。WARD 等[23]通過(guò)對(duì)來(lái)自澳大利亞水域的210 種鯊魚(yú)和鰩魚(yú)進(jìn)行DNA 條形碼鑒定，驗(yàn)證了COI 條形碼在軟骨魚(yú)類鑒別方面的有效性，以及在解決分類學(xué)問(wèn)題和發(fā)現(xiàn)新物種方面的實(shí)用性。 但是在魚(yú)鰭被加工成魚(yú)翅的過(guò)程中，DNA 會(huì)被降解和高度碎片化[24]，對(duì)鑒定效果產(chǎn)生影響。FIELDS 等[25]開(kāi)發(fā)了一種用于鯊魚(yú)物種識(shí)別的微條形碼分析方法， 該方法針對(duì)全長(zhǎng)COI 條形碼中較短的110～130 bp 區(qū)域， 在100%的加工魚(yú)鰭和62%的魚(yú)翅湯樣本中有效識(shí)別出了鯊魚(yú)的物種或?qū)偎剑?表明在其他高度加工的鯊魚(yú)產(chǎn)品（如鯊魚(yú)軟骨補(bǔ)充劑）中，鯊魚(yú)迷你條形碼分析方法有用于物種鑒定的可能。 ROSALEE 等[26]使用3種不同條形碼對(duì)35 種鯊魚(yú)產(chǎn)品進(jìn)行鑒定，綜合鑒定效率為74.3%，其中鯊魚(yú)微DNA 條形碼的鑒定效率最高（54.3%），哺乳動(dòng)物（45.7%）和魚(yú)類DNA（8.6%）條形碼的鑒定效率較低， 表明可通過(guò)多種引物的聯(lián)合使用增加鑒定準(zhǔn)確性和成功率。

本研究基于16S rRNA 基因和COI 基因作為DNA 條形碼的靶基因，建立快速有效的魚(yú)翅物種鑒定方法，以期打擊魚(yú)翅走私，為魚(yú)翅的真?zhèn)舞b定和保護(hù)海洋魚(yú)類的多樣性提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

魚(yú)翅樣品均為海關(guān)口岸截獲樣品。

1.2 DNA 抽提及濃度測(cè)定

1.2.1 樣品前處理

干魚(yú)翅：用水將10 g 樣本泡發(fā)，取泡發(fā)后的魚(yú)翅2 g， 用振蕩研磨儀 （Bertin Precellys Evolution，Bertin Technologies，法國(guó)）充分研磨成細(xì)末，研磨程序?yàn)椋? 500 r/min，20 s，并重復(fù)4～6 次。

1.2.2 DNA 抽提

使用DNA 抽提試劑盒 （DNeasy merion Food kit），取200 mg 碾磨后的樣本，加入DNA 提取裂解液1 mL，置于恒溫振蕩儀中，60℃振蕩30 min，繼續(xù)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA 抽提， 將抽提后的DNA 溶解于50 μL 水中，測(cè)定DNA 濃度，提取過(guò)程設(shè)置以水替代樣品的提取空白對(duì)照。

1.2.3 DNA 濃度和純度測(cè)定

通過(guò)NanoDrop ND-1000 （Thermo Fisher Scientific， 美國(guó)） 超微量分光光度計(jì)在260 nm 和280 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，將A260nm處的吸光度值換算成DNA 濃度， 用A260nm和A280nm的吸光度比值（A260/280）表示DNA 純度。

1.3 PCR 引物

16S rRNA 基因上游引物16Sar：5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′；下游引物16Sbr：5’-CCG GTCTGAACTCAGATCACGT-3′，引物參考PALUMBI等[27]采用的方法。COI 基因上游引物Fish F1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；下游引物FishR1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’，引物參考WARD 等[23]采用的方法。

1.4 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序

PCR 擴(kuò)增體系為25 μL：2×TaqPCR Max Master Mix 12.5 μL，引物各1 μL（10 μmol/L），DNA 模板2 μL（10～30 ng/μL），ddH2O 8.5 μL。16S rRNA 基因的擴(kuò)增條件是：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。COI 基因的擴(kuò)增條件是：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，53℃退火15 s，72℃延伸15 s，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，送至測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5 序列比對(duì)及分析

測(cè)序結(jié)果通過(guò)SeqMan 軟件進(jìn)行序列校對(duì)和拼接，并刪除兩端引物序列。將處理過(guò)的16S rRNA 序列和COI 序列在GenBank BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。當(dāng)標(biāo)本的同一性與參考序列的差異＜2%時(shí)，就可以被認(rèn)為是在物種水平上識(shí)別的，100%的同一性得分被用作物種鑒定的截止值[28-29]。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)測(cè)序比對(duì)結(jié)果，從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載其他鯊魚(yú)近似種的16S rRNA 和COI 參考序列。 將整理后的擬鯊魚(yú)樣品DNA 序列和從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的16S rRNA 和COI 參考序列， 使用MEGA11軟件進(jìn)行多序列比對(duì)， 用p-distance 的算法構(gòu)建鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)， 選用K2P 替代模型，Bootstrap 自展值設(shè)為1 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對(duì)結(jié)果分析

本研究共獲得16S rRNA 基因序列和COI 基因序列各28 條，將獲得的序列在GenBank BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，物種鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 28 種魚(yú)翅16S rRNA 基因和COI 基因在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of 28 sharks based on 16S rRNA and COI Gene in the NCBI database

16S rRNA 基因比對(duì)結(jié)果顯示， 在成功獲得的28 個(gè)魚(yú)翅樣本的16S rRNA 序列中， 有21 條序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)均能得到準(zhǔn)確鑒定，且鑒定結(jié)果一致，物種序列相似度＞99.8%。 此外，7 號(hào)、9 號(hào)、10號(hào)和16 號(hào)魚(yú)翅出現(xiàn)相似度高的前3 序列均為鐮狀真鯊，物種序列相似度最高為99.32%，初步判定為鐮狀真鯊。 8 號(hào)魚(yú)翅出現(xiàn)相似度高的前3 序列為3種不同的真鯊屬物種，物種序列相似度均＞99.40%；19 號(hào)魚(yú)翅出現(xiàn)相似度高的前3 序列為3 種不同的雙髻鯊屬物種，物種序列相似度均＞98.00%；27 號(hào)魚(yú)翅出現(xiàn)相似度高的前3 序列為3 種不同的真鯊屬物種，物種序列相似度均＜98.00%。

COI 基因比對(duì)結(jié)果顯示，26 個(gè)魚(yú)翅樣本的COI序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)均能得到準(zhǔn)確鑒定，且鑒定結(jié)果一致，物種序列相似度≥99.7%。 此外，將7號(hào)和16 號(hào)魚(yú)翅在BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)， 相似度達(dá)100%的物種有2 種結(jié)果，分別為鐮狀真鯊和短尾真鯊。

綜合分析2 組比對(duì)數(shù)據(jù)的結(jié)果可知，共28 個(gè)魚(yú)翅樣本來(lái)源于13 種鯊魚(yú)物種：1 號(hào)～4 號(hào)及24 號(hào)為尖吻鯖鯊；5 號(hào)、6 號(hào)、13 號(hào)、17 號(hào)以及20 號(hào)～23 號(hào)為無(wú)溝雙髻鯊；7 號(hào)、9 號(hào)、10 號(hào)和16 號(hào)魚(yú)翅為鐮狀真鯊；8 號(hào)魚(yú)翅為長(zhǎng)鰭真鯊；11 號(hào)魚(yú)翅為牛鯊；12 號(hào)魚(yú)翅為黑邊鰭真鯊；14 號(hào)魚(yú)翅為烏翅真鯊；15 號(hào)魚(yú)翅為淺海長(zhǎng)尾鯊；18 號(hào)魚(yú)翅為路氏雙髻鯊；19 號(hào)魚(yú)翅為小眼雙髻鯊；25 號(hào)和26 號(hào)為大青鯊；27 號(hào)為小尾真鯊；28 號(hào)為鼬鯊。從NCBI 中下載與鑒定出的鯊魚(yú)物種相似度達(dá)98%以上的16S rRNA 基因序列49 條，以及COI 基因序列64 條。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 魚(yú)翅16S rRNA 基因序列分析

構(gòu)建77 個(gè)鯊魚(yú)16S rRNA 基因 （28 個(gè)樣本序列和49 條參考序列）的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），可見(jiàn)大部分魚(yú)翅樣本的同一物種的不同個(gè)體基本都能聚合在一起， 且置信度均＞70%，50%以上的置信度被認(rèn)為是可能發(fā)生的關(guān)系[30]，這一結(jié)果與BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果一致。 8 號(hào)魚(yú)翅與真鯊屬多個(gè)物種的相似度達(dá)到98.00%以上， 其中與長(zhǎng)鰭真鯊相似度達(dá)到99.83%，分析樹(shù)顯示8 號(hào)魚(yú)翅與長(zhǎng)鰭真鯊聚合成一支，且置信度為69%，因而可判斷8 號(hào)魚(yú)翅為長(zhǎng)鰭真鯊。 7 號(hào)、9 號(hào)、10 號(hào)和16 號(hào)魚(yú)翅序列BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果為鐮狀真鯊，但在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，4 個(gè)魚(yú)翅雖然與鐮狀真鯊參考序列聚合在一起， 不同個(gè)體與參考序列形成的聚類關(guān)系的置信度并不高，只有59%， 檢測(cè)樣本序列與參考序列之間親源性不夠，可能是造成上述現(xiàn)象，需豐富參考序列信息，擴(kuò)大采樣量。 19 號(hào)魚(yú)翅的16S rRNA 序列與2 種雙髻鯊屬物種的參考序列聚合成在一起，經(jīng)對(duì)應(yīng)的聚類關(guān)系鑒定無(wú)法確定所屬物種。27 號(hào)魚(yú)翅的16S rRNA 序列與真鯊科物種聚合在一起，無(wú)法確定其所屬物種。

圖1 基于16S rRNA 基因片段序列構(gòu)建的魚(yú)翅物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of shark fins based on 16S rRNA gene

圖2 基于COI 基因片段序列構(gòu)建的魚(yú)翅物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of shark fins based on COI gene

2.2.2 魚(yú)翅COI 基因序列分析

構(gòu)建92 個(gè)鯊魚(yú)COI 基因（28 個(gè)樣本序列和64條參考序列）的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示（圖3），大部分魚(yú)翅樣本同一物種的不同個(gè)體基本都能聚合在一起，且置信度均達(dá)到60%以上，這結(jié)果與BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果一致。 7 號(hào)和16 號(hào)魚(yú)翅BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果為鐮狀真鯊和短尾真鯊， 分析樹(shù)顯示這兩種魚(yú)翅與鐮狀真鯊和短尾真鯊聚合在一起， 且置信度達(dá)到86%， 說(shuō)明這2 種真鯊屬物種COI 序列非常相似，在這個(gè)基因區(qū)間無(wú)法區(qū)分。

2.2.3 綜合分析

COI 基因和16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分支拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)總體趨于一致，驗(yàn)證了DNA 條形碼鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。COI 基因在本次試驗(yàn)中無(wú)法有效區(qū)分鐮狀真鯊和短尾真鯊，16S rRNA 基因可以能有效區(qū)分兩組真鯊物種，說(shuō)明在該基因區(qū)間內(nèi)，兩種真鯊的序列差異大；COI 基因鑒定19 號(hào)魚(yú)翅為小眼雙髻鯊和27 號(hào)魚(yú)翅為小尾真鯊，基于16S rRNA 序列無(wú)法鑒定出此樣品的原因在于GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中并沒(méi)有小眼雙髻鯊和小尾真鯊的相關(guān)片段（即缺少該物種16S rRNA 基因片段以及線粒體全基因組序列），通過(guò)已知序列無(wú)法基于16S rRNA 基因?qū)υ擊~(yú)翅樣品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。 基于已確定的COI 基因序列的鑒定結(jié)果可對(duì)16S rRNA 鑒定結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充。CHUN 等[31]在使用16S rRNA 基因序列對(duì)原生動(dòng)物進(jìn)行物種鑒定時(shí)，同樣也出現(xiàn)相關(guān)匹配序列缺少，這是利用16S rRNA 基因鑒定的主要障礙之一。

2.3 已鑒定物種的保護(hù)現(xiàn)狀

鐮狀真鯊，長(zhǎng)鰭真鯊，黑邊鰭真鯊，烏翅真鯊，小尾真鯊，牛鯊，大青鯊和鼬鯊均屬于真鯊科物種；路氏雙髻鯊， 無(wú)溝雙髻鯊和小眼雙髻鯊均屬于雙髻鯊物種；尖吻鯖鯊屬于鼠鯊科物種；淺海長(zhǎng)尾鯊屬于長(zhǎng)尾鯊科物種，以上物種均列入《CITES 公約》附錄II。

2.4 魚(yú)翅物種鑒定方案

本次研究中，16S rRNA 基因和COI 基因?qū)︴忯~(yú)物種鑒定結(jié)果表明，DNA 條形碼技術(shù)能對(duì)絕大多數(shù)鯊魚(yú)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。 目前Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)鯊魚(yú)物種COI 基因的信息較多，涵蓋的物種數(shù)量和種類比較齊全， 相對(duì)來(lái)說(shuō)鯊魚(yú)16S rRNA 基因的信息較少，涵蓋的物種數(shù)量和種類也較少。但根據(jù)本次鑒定結(jié)果，鑒定魚(yú)翅樣本，建議兩種引物聯(lián)合使用，可以相互驗(yàn)證，提高鑒定準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用通用引物擴(kuò)增口岸截獲28 個(gè)魚(yú)翅的線粒體16S 核糖體RNA 基因（16S rRNA）和細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ基因（COI）部分序列進(jìn)行基因庫(kù)比對(duì)和構(gòu)建NJ 分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析， 共鑒定2 目4科6 屬13 種物種，且均列入《CITES 公約》附錄II。基于16S rRNA 基因和COI 基因的DNA 條形碼技術(shù)可以有效應(yīng)用于大部分魚(yú)翅物種的鑒定，2 個(gè)基因?qū)ν环N魚(yú)翅物種的鑒定結(jié)果基本一致， 鑒定有差異部分可以互補(bǔ)鑒定。 因而建議鑒定魚(yú)翅可以先用COI 基因進(jìn)行初次鑒定，16S rRNA 作為補(bǔ)充條形碼基因鑒定。 此外，16S rRNA 目的基因在序列長(zhǎng)度上更短，更適合加工食品。本研究提供的魚(yú)翅物種鑒定方案可對(duì)魚(yú)翅物種進(jìn)行準(zhǔn)確快速的鑒定， 為打擊瀕危鯊魚(yú)走私、 滋補(bǔ)品真?zhèn)问袌?chǎng)監(jiān)督管理和保護(hù)鯊魚(yú)資源提供技術(shù)支持。