外源激素和⁶⁰Co-γ輻射對(duì)苜蓿愈傷組織分化及內(nèi)源激素水平的影響

摘要：為探討外源激素和⁶⁰Co-γ輻射對(duì)苜蓿愈傷組織分化和內(nèi)源激素水平變化的影響，本研究以未輻射和輻射苜蓿種子（輻射劑量600 和 800 Gy）植株葉片誘導(dǎo)的愈傷組織和分化苗為試驗(yàn)材料（標(biāo)記為CK，G600，G800），將愈傷組織在附加2，4-D與6-BA的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，利用高效液相色譜法測(cè)定愈傷組織和分化苗中3種內(nèi)源激素水平的變化。結(jié)果表明：MS培養(yǎng)基附加激素濃度為2.00 mg·L^-12，4-D和1.00 mg·L^-16-BA時(shí)，CK，G600，G800愈傷組織芽點(diǎn)分化率分別為100%，375%，115%，帶芽點(diǎn)愈傷組織在無(wú)激素MS培養(yǎng)基均可分化出根、莖和葉。分化苗CK，G600，G800根、莖和葉的IAA含量均低于愈傷組織，GA₃含量高于愈傷組織，ABA含量在根中最高，IAA/ABA比值在愈傷組織中最高，GA₃/ABA和IAA/GA₃比值在莖中最高。因此，外源和內(nèi)源激素水平的變化可實(shí)現(xiàn)苜蓿愈傷組織芽點(diǎn)產(chǎn)生和再分化，一定劑量輻射處理可促進(jìn)苜蓿愈傷組織再分化，并影響內(nèi)源激素水平的變化。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；⁶⁰Co-γ輻射；愈傷組織；植物激素；再分化

中圖分類號(hào)：S945.45 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2023）07-2162-08

Effects Calli Differentiation of Alfalfa and Endogenous Hormones Levels under Exogenous Hormones and ⁶⁰Co-γ Radiation

REN Zhong-ming， LIU Chang， LI Shan-shan*， LI Bo

（College of Agriculture， Forestry and Life Sciences， Qiqihar University， Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas， Qiqihar， Heilongjiang Provine 161006， China）

Abstract：To discuss effects of ⁶⁰Co-γ radiation on differentiation of alfalfa calli and changes of endogenous level，calli and differentiated seedlings induced from plant leaves of non irradiated and irradiated alfalfa seeds （radiation doses 600 and 800 Gy） were used as experimental materials（marked as CK，G600，G800）. Differentiation culture of calli in MS medium supplemented with 2，4-D and 6-BA and use high-performance liquid chromatography to determine the changes in the levels of three endogenous hormones in calli and differentiated seedlings. The results showed that when the concentration of additional hormones in MS medium is 2.00 mg·L^-1 2，4-D and 1.00 mg·L^-1，the bud differentiation rates of CK，G600，and G800 callus were 100%，375% and 115%，respectively. Calli with bud points can differentiate into roots，stems and leaves in MS medium without hormones. The IAA content in roots，stems and leaves of CK，G600 and G800 differentiated seedlings was lower than that of calli，and the GA₃content of was higher than that of calli. The ABA content was the highest in roots. The IAA/ABA ratio of CK，G600 and G800 was the highest in calli，and the GA₃/ABA and IAA/GA₃ratio was the highest in stems. Therefore，changes in the levels of exogenous and endogenous hormones can achieve buds point generation and redifferentiation of alfalfa calli. A certain dose of radiation treatment can promote the redifferentiation of alfalfa calli and affect the changes in endogenous hormone levels.

Key words：Alfalfa；⁶⁰Co-γ radiation；Callus；Plant hormones；Redifferentiation

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是豆科草本植物，為世界種植面積最廣且經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的豆科牧草之一，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，粗蛋白含量18%以上，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料^[1-2]。但苜蓿的優(yōu)良的種苗較稀少，這使得紫花苜蓿在開(kāi)發(fā)利用的過(guò)程中受到了限制，如何提高紫花苜蓿的產(chǎn)量以及優(yōu)良苜蓿品種選育成為了目前科研工作者的主要研究方向之一。輻射誘變育種是一種較為簡(jiǎn)單、能夠穩(wěn)定變異和有高繁殖效率的育種手段，較傳統(tǒng)育種高效、快速，較轉(zhuǎn)基因育種更為經(jīng)濟(jì)，是產(chǎn)生新品種的有效手段之一^[3-4]。常采用x射線、γ射線、β射線進(jìn)行輻射處理，后代變異率高，變異性狀穩(wěn)定，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得突變體，尤其是⁶⁰Co-γ射線輻射應(yīng)用最廣泛，育種效果最為顯著^[5-6]。在輻射苜蓿種子誘變劑量篩選中，不同輻射劑量對(duì)苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均有影響，高輻射劑量（1 200～1 500 Gy）對(duì)苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的抑制作用高于低輻射劑量（600～900 Gy），且在輻射劑量為600，800和900 Gy時(shí)收獲到第二代種子^[7]。輻射誘變?cè)谲俎Ｍ蛔凅w篩選研究已取得了一定的成果，張學(xué)云等^[8]研究了‘新疆大葉’紫花苜蓿體細(xì)胞胚的輻射誘變及耐鹽性，比較 0～100 Gy輻射劑量在氯化鈉脅迫胚性愈傷組織芽分化率，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，不同輻射劑量處理的芽分化率呈下降趨勢(shì)，苜蓿體細(xì)胞胚的適宜輻射強(qiáng)度為 2～8 Gy，得到了耐鹽性高達(dá) 1.0% 的突變株；馬海燕^[9]對(duì)苜蓿輻射突變體誘導(dǎo)和愈傷組織高效再生的研究，建立了三品種的 17 個(gè)高再生能力的基因型，包括‘新疆大葉’苜蓿6個(gè)、‘新牧 1號(hào)’雜花苜蓿5個(gè)和‘新疆野生’黃花苜蓿6個(gè)，其試管苗移栽在土壤中生長(zhǎng)良好。

在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，激素可以調(diào)節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)及胚性結(jié)構(gòu)的形成，植物基因的表達(dá)、生長(zhǎng)發(fā)育以及植物對(duì)某些環(huán)境刺激的反應(yīng)均受其體內(nèi)多種激素的控制。不同激素配比對(duì)紫花苜蓿幼苗4種外植體愈傷組織誘導(dǎo)效果不同，獲得紫花苜蓿葉最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg·L^-12，4-D +0.75 mg·L^-16-BA^[10]。有關(guān)愈傷組織和分化苗的內(nèi)源激素含量測(cè)定方法常采用高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，郭敏敏等^[11]對(duì)棉花胚性愈傷組織發(fā)生過(guò)程中4種植物內(nèi)源激素進(jìn)行了測(cè)定和分析，包括吲哚-3-乙酸（IAA）、玉米素（ZT）、赤霉素（GA₃）和脫落酸（ABA）；肖關(guān)麗等^[12]對(duì)甘蔗愈傷組織分化綠苗內(nèi)源激素IAA、細(xì)胞分裂素（Cytodinin，CTK）、GA₃進(jìn)行測(cè)定和變化規(guī)律研究，不同外源激素對(duì)愈傷組織內(nèi)源激素影響存在一定的差異，內(nèi)源激素IAA和CTK是分化苗產(chǎn)生的重要因子。本研究利用輻射誘變和植物組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，以輻射苜蓿種子后代篩選獲得的變異植株，對(duì)其葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，分析外源激素和輻射對(duì)苜蓿愈傷組織再分化和內(nèi)源激素水平的變化，為利用愈傷組織實(shí)現(xiàn)苜蓿輻射育種提供基礎(chǔ)材料和理論研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以‘龍牧806’苜蓿3組愈傷組織（CK，G600，G800）為材料，其中CK為對(duì)照，G600和G800為⁶⁰Co-γ射線輻射種子后代變異植株獲得的材料。

⁶⁰Co-γ射線輻射和未輻射的‘龍牧806’苜蓿種子由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院提供，輻射種子于 2017 年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能利用研究所進(jìn)行輻射處理。對(duì)輻射和未輻射苜蓿種子種植在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院試驗(yàn)基地，收獲后獲得二代苜蓿種子。將輻射和對(duì)照（Control，CK）的二代苜蓿種子用 35 ℃溫水浸泡 2 h，播種于營(yíng)養(yǎng)土∶珍珠巖= 2∶1育苗盆中，每盆播 30 粒種子，每個(gè)劑量 10 盆，置于溫室內(nèi)培養(yǎng) 75 d后標(biāo)記變異植株。其中G600 和G800 分別為輻射劑量 600 和 800 Gy苜蓿變異植株的高株葉片誘導(dǎo)愈傷組織^[13]，CK為未輻射苜蓿植株葉片愈傷組織。

1.2 方法

1.2.1 苜蓿愈傷組織繼代培養(yǎng) 將前期CK，G600和G800植株的葉片誘導(dǎo)的愈傷組織分別切成 0.5 cm³左右小塊，接種在MS+1.0 mg·L^-12，4-D+0.75 mg·L^-1 6-BA+30 g·L^-1蔗糖的固體培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織繼代培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度 25 μmol·m^-2·s^-1，光照周期16 h光/ 8 h暗，在溫度 25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 苜蓿愈傷組織再分化 將CK，G600和G800愈傷組織分別切成 0.5 cm³左右小塊，轉(zhuǎn)接在愈傷組織芽分化培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織芽分化培養(yǎng)。愈傷組織芽分化培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的2，4-D和6-BA，2，4-D濃度為 1.00和2.00 mg·L^-1，6-BA濃度為 0.25，0.50，0.75和1.00 mg·L^-1，兩種激素進(jìn)行組合配比，每個(gè)組合接種3～4瓶愈傷組織，共接種22～27塊愈傷組織，統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化的綠色芽點(diǎn)數(shù)，計(jì)算愈傷組織芽點(diǎn)分化率。愈傷組織在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為25 μmol·m^-2·s^-1，光照周期為16 h光/8 h暗，培養(yǎng)溫度為 25 ℃。

將CK，G600和G800愈傷組織切成 0.5 cm³左右小塊，接種在篩選的最佳愈傷組織芽分化培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織芽點(diǎn)分化培養(yǎng)，然后將帶有芽點(diǎn)的愈傷組織小塊轉(zhuǎn)接在無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行愈傷組織莖、葉和根的分化培養(yǎng)。

1.2.3 內(nèi)源激素含量的測(cè)定 流動(dòng)相、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與最優(yōu)檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

流動(dòng)相配制：用超純水配制1% 乙酸和80%色譜純甲醇，將兩者按照52∶48的比例混合，用 0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后超聲脫氣 30 min，除去流動(dòng)相混合液中的氣體，密封保存?zhèn)溆?

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精密稱取IAA，GA₃和ABA標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg，分別用流動(dòng)相溶液溶解，定溶于50 mL的容量瓶中作為母液，分別吸取上述3種標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5，1.0，3.0和5.0 ml配制成混合溶液，定容到10 mL，其濃度分別為5，10，30和50 μg·mL^-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;

最優(yōu)檢測(cè)波長(zhǎng)確定：將上述溶液配制成系列濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)（200～400 nm）掃描，通過(guò)空白和樣品掃描后得光譜圖，確定IAA，GA₃和ABA最優(yōu)紫外吸收波長(zhǎng)。

樣品的制備與分析方法

樣品制備：稱取 1 g愈傷組織（繼代15 d）和分化苗（60 d）的根、莖、葉，加入 5 mL 80% 甲醇在冰浴下研磨成勻漿，4 ℃浸提過(guò)夜。10 000 rpm下4 ℃離心 15 min，殘?jiān)眉状紤腋。俅坞x心，合并上清液定至 8 mL，棄殘?jiān)?

上清液過(guò)C-18固相萃取柱萃?。?0% 甲醇沖洗平衡柱→上樣→去除樣品→去離子水洗柱→80% 甲醇洗脫柱（循環(huán)此過(guò)程 3次）。將過(guò)柱后的樣品轉(zhuǎn)入5 mL離心管中，真空濃縮至干燥，除去提取液中的甲醇，用流動(dòng)相液定容至 1.5 mL，經(jīng) 0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析;

HPLC分析：利用Agilent Technologies 1 290 Infinity II高效液相色譜儀，采用二極陣列（DA）檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)，色譜柱為ZORBA×RRHD EClipse plus C18，1.8 μm，柱體積 2.1×50 mm，流動(dòng)相為甲醇∶1% 乙酸水溶液=48∶52，流速0.5 mL·min^-1，進(jìn)樣量1.0 μL，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為確定最優(yōu)檢測(cè)波長(zhǎng)。

式中：X為樣品中激素含量（μg·g^-1），A2為樣品峰面積（mAU*S），C為樣品標(biāo)準(zhǔn)液濃度（μg·mL^-1），V為樣品體積（L），A1為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積（mAU*S），W為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS 21.0 分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素和輻射對(duì)苜蓿愈傷組織再分化的影響

愈傷組織分化受激素水平和比例的調(diào)控，CK，G600和G800愈傷組織綠色芽點(diǎn)分化狀況見(jiàn)圖1和表1。2，4-D與6-BA兩種激素的不同濃度配比影響了3組愈傷組織綠色芽點(diǎn)的分化，在2，4-D濃度為1.00和2.00 mg·L^-1與6-BA濃度為 0.25，0.50，0.75和1.00 mg·L^-1配比均可誘導(dǎo)3組愈傷組織分化出綠色芽點(diǎn)，但在綠色芽點(diǎn)分化率上產(chǎn)生很大的差異，輻射促進(jìn)愈傷組織綠色芽點(diǎn)的分化，G600和G800愈傷組織綠色芽點(diǎn)分化率顯著高于CK。

在2，4-D和6-BA濃度均為1.00 mg·L^-1時(shí)，CK，G600和G800愈傷組織綠色芽點(diǎn)分化率分別為77.78%，237.50%和150.00%，當(dāng)2，4-D和6-BA濃度分別為2.00和1.00 mg·L^-1時(shí)，CK，G600和G800愈傷組織綠色芽點(diǎn)分化率分別為100.00%，375.00% 和115.38%。除G600的2.00 mg·L^-12，4-D和1.00 mg·L^-16-BA組合綠色芽點(diǎn)分化率低于1.00 mg·L^-12，4-D和1.00 mg·L^-16-BA配比外，其他各激素濃度配比的愈傷組織綠色芽點(diǎn)分化率均為2，4-D濃度 2.00 mg·L^-1高于1.00 mg·L^-1。3組愈傷組織綠色芽點(diǎn)分化率大小為G600愈傷組織＞G800愈傷組織＞CK愈傷組織，輻射促進(jìn)苜蓿愈傷組織綠色芽點(diǎn)的分化。

對(duì)愈傷組織芽點(diǎn)分化率進(jìn)行外源激素和輻射劑量的雙因素方差分析，在考慮雙因素的交互效應(yīng)時(shí)，把激素看成因素A，輻射劑量看成因素B，因素A和因素B對(duì)愈傷組織芽點(diǎn)分化率的可重復(fù)雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)，因素A、因素B和交互效應(yīng)A×B對(duì)苜蓿愈傷組織芽點(diǎn)分化率影響極顯著（P＜0.01）（表2）。因素B的F值與臨界值差值大于因素A的F值與臨界值差值，說(shuō)明因素B對(duì)愈傷組織芽點(diǎn)分化率的影響最顯著，其次是因素A，而A和B對(duì)苜蓿愈傷組織芽點(diǎn)分化率影響存在交互作用。

苜蓿愈傷組織在不同濃度的2，4-D與6-BA配比下，3組愈傷組織均有大量的綠色芽點(diǎn)分化，且CK、G600和G800愈傷組織在2，4-D 1.00或 2.00 mg·L^-1與6-BA 1.00 mg·L^-1組合的固體培養(yǎng)基上綠色綠色芽點(diǎn)分化率均最高，將3組帶有綠色芽點(diǎn)的愈傷組織小塊轉(zhuǎn)接在無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基中，均可分化出帶有根芽的苜蓿分化苗（圖2），實(shí)現(xiàn)愈傷組織的再分化。

2.2 苜蓿愈傷組織和分化苗的內(nèi)源激素含量及比值的變化

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)和回歸方程確定 將3種激素標(biāo)準(zhǔn)溶液在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)（200～400 nm）掃描，結(jié)果表明在206 nm附近三者吸光度均較大，均衡3種激素的檢測(cè)效果，最終選擇206 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

依據(jù)3種激素標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度梯度溶液，按所選擇的色譜條件進(jìn)樣1.0 μL，獲得不同濃度IAA，GA₃和ABA的峰面積，建立峰面積y與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度x（μg·mL^-1）之間的關(guān)系，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3，各激素的線性相關(guān)性均較好。

2.2.2 內(nèi)源激素含量的變化 在去除外源激素后苜蓿愈傷組織及分化苗各器官中3種內(nèi)源激素含量的變化見(jiàn)圖3。CK和輻射愈傷組織（G600，G800）的IAA含量均高于分化苗的各器官，GA₃和ABA含量均低于分化苗的各器官，除G600和G800的愈傷組織與分化苗莖的ABA含量差異不顯著外，其他各組分化苗的根、莖和葉的IAA，CA₃和ABA含量與其愈傷組織比較均差異顯著（P＜0.05）。

在3組愈傷組織的3種內(nèi)源激素含量變化中，除G600愈傷組織的IAA含量略低于其CK外，G600和G800愈傷組織的IAA，GA₃和ABA含量均高于其CK（圖3A-3C）。G600愈傷組織的IAA，GA₃和ABA含量分別為其CK的0.99，1.14和1.07倍，G800愈傷組織的IAA，GA₃和ABA含量分別為其CK的1.28，1.29和1.26倍。IAA含量為G800＞CK＞G600，GA₃和ABA含量為G800＞G600＞CK，一定輻射處理可促進(jìn)愈傷組織3種內(nèi)源激素水平的提升。

在3組分化苗各器官的3種內(nèi)源激素含量變化中，莖和葉的IAA和GA₃含量均高于根，ABA含量均低于根，莖的IAA和GA₃含量最高，根的ABA含量最高（圖3A-3C）。G800分化苗各器官的IAA和GA₃含量高于G600，但與CK比較變化不一，G800分化苗的根、莖和葉的IAA含量分別為其CK的1.82，0.90和0.86倍，GA₃含量分別為其CK的1.05，1.09和0.92倍；除G800分化苗根的ABA含量高于G600外，G600分化苗的莖和葉的ABA含量均低于G800，G800分化苗的根、莖和葉的ABA含量分別為其CK的0.90，0.57和0.84倍。輻射處理對(duì)分化苗的根、莖和葉的3種內(nèi)源激素水平產(chǎn)生不同的影響。

2.2.3 苜蓿愈傷組織和分化苗內(nèi)源激素比值的變化 去除外源激素后，苜蓿愈傷組織及分化苗各器官的3種內(nèi)源激素比值不同（圖4）。CK和輻射愈傷組織（G600、G800）的IAA/ABA和IAA/GA₃比值均高于分化苗的各器官，GA₃/ABA比值均低于分化苗的各器官。除CK和G600分化苗莖與葉間的IAA/ABA比值、G600和G800分化苗根、莖與葉間的IAA/GA₃比值外，其他各分化苗的根、莖與葉間激素比值差異均顯著（P＜0.05）。

在3組愈傷組織的內(nèi)源激素比值變化中，除G600愈傷組織的IAA/ABA低于CK外，G600和G800愈傷組織的IAA/ABA和GA₃/ABA比值均高于其CK（圖4A，4B），IAA/GA₃比值均低于其CK（圖4C）。G600愈傷組織的IAA/ABA，GA₃/ABA和IAA/GA₃比值分別為其CK的0.94，1.09和0.87倍，G800愈傷組織的IAA/ABA，GA₃/ABA和IAA/GA₃比值分別為其CK的1.01，1.03和0.98倍，輻射處理對(duì)愈傷組織的3種內(nèi)源激素比值的產(chǎn)生不同影響。

3組苜蓿分化苗的各器官內(nèi)源激素比值變化中，CK，G600和G800分化苗莖的IAA/ABA，GA₃/ABA和IAA/GA₃比值均高于其葉和根（圖4A，4B，4C）。苜蓿分化苗的IAA/ABA比值為G800＞CK＞G600，G600分化苗根、莖和葉的IAA/ABA比值分別為其CK的2.00，1.58和1.02倍；除G600分化苗葉的GA₃/ABA比值外，輻射組分化苗根、莖、葉的GA₃/ABA比值均高于其CK，G800分化苗根、莖和葉的GA₃/ABA比值分別為其CK的1.16，1.92和1.10倍；除G800分化苗根的IAA/GA₃比值略高于其CK外，輻射組分化苗各器官的IAA/GA₃比值均低于其CK，G800分化苗根、莖和葉的IAA/GA₃比值分別為其CK的1.73，0.82和0.93倍。一定輻射處理提高分化苗的根、莖和葉的IAA/ABA和GA₃/ABA比值，降低IAA/GA₃比值。

3 討論

3.1 愈傷組織分化與激素關(guān)系

植物外植體的脫分化和愈傷組織的再分化受外源激素發(fā)育信號(hào)的刺激作用，而其作用的效果與外植體及愈傷組織自身的內(nèi)源激素種類和水平關(guān)系密切，外源激素附加及比值只有在一定范圍內(nèi)才能引起內(nèi)源激素水平的變化，從而促進(jìn)細(xì)胞分化，外源激素通過(guò)內(nèi)源激素才能發(fā)揮作用^[14]。紫花苜蓿愈傷組織的誘導(dǎo)需要外源激素為高濃度的 2，4-D，而體細(xì)胞胚的形成則要降低 2，4-D濃度，否則胚性愈傷組織無(wú)法形成體細(xì)胞胚或再生植株^[15]。本研究發(fā)現(xiàn)在2，4-D誘導(dǎo)的苜蓿愈傷組織繼代培養(yǎng)5～6次后可以產(chǎn)生帶有芽點(diǎn)的愈傷組織，愈傷組織的芽自身合成的內(nèi)源生長(zhǎng)素滲入到無(wú)激素的MS培養(yǎng)基中，由于內(nèi)源生長(zhǎng)素的作用，進(jìn)而形成的芽極易再分化出根^[16]。肖關(guān)麗等^[17]研究?jī)?nèi)源激素變化與甘蔗愈傷組織分化綠苗也得到了同樣的結(jié)果。

植物的生長(zhǎng)過(guò)程是植物內(nèi)源各激素水平間的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，內(nèi)源激素對(duì)植物愈傷組織生長(zhǎng)和分化有調(diào)控作用^[18-19]。蔡陽(yáng)光等^[20]研究魔芋愈傷組織和叢生芽的分化，內(nèi)源細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的總比值應(yīng)維持在相對(duì)適宜的水平，各種激素協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。在對(duì)苜蓿愈傷組織和分化苗的內(nèi)源激素研究發(fā)現(xiàn)，愈傷組織階段的IAA含量最高，是胚性愈傷組織形成和提高體細(xì)胞胚胎發(fā)生不可缺少的因子，且一定濃度的ABA和GA₃可維持細(xì)胞胚性結(jié)構(gòu)不被破壞，并具有一定的促進(jìn)作用^[21]。從各內(nèi)源激素比值分析，IAA/ABA和IAA/GA₃均在愈傷組織階段保持在一個(gè)相對(duì)較高水平，豐富的內(nèi)源激素是體細(xì)胞脫分化并分化形成胚性細(xì)胞和保持胚胎發(fā)生能力不可缺少的因子，而GA₃/ABA在分化苗，特別是分化苗的莖中水平最高，說(shuō)明GA₃/ABA的比值對(duì)芽體的伸長(zhǎng)有重要的影響。

3.2 輻射對(duì)愈傷組織分化的影響

植物組織培養(yǎng)技術(shù)與輻射誘變相結(jié)合可在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量突變體，以加速創(chuàng)造牧草新種質(zhì)資源^[22-23]。植物材料的不同部位對(duì)輻射敏感度不同，生長(zhǎng)最旺盛的分生組織最為敏感，而利用愈傷組織直接進(jìn)行輻射處理會(huì)抑制愈傷組織的生長(zhǎng)和再分化^[24]。孟祥茹^[25]對(duì)⁶⁰Co-γ射線對(duì)人參愈傷組織的輻射效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)隨著輻射劑量的增加，延長(zhǎng)了人參愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)的時(shí)間，減緩愈傷組織的增值速率。張學(xué)云等^[21]研究‘新疆大葉’紫花苜蓿胚性愈傷組織芽分化率的影響，比較0～100 Gy輻射劑量分別在0%～1.0% 鹽濃度脅迫1～3個(gè)月下的胚性愈傷組織芽分化率，發(fā)現(xiàn)隨著鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng)，不同輻射劑量處理的芽分化率均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。本研究結(jié)果的芽分化率有所不同，可能與輻射處理的對(duì)象有關(guān)，多數(shù)研究者利用愈傷組織直接進(jìn)行輻射處理，而本研究對(duì)苜蓿種子進(jìn)行輻射，對(duì)變異植株葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，種子的耐輻射能力更強(qiáng)，可耐輻射劑量更高，增加了對(duì)后代的選擇性。

3.3 激素和輻射互作與對(duì)愈傷組織分化

外源激素水平變化會(huì)影響愈傷組織芽點(diǎn)產(chǎn)生，同時(shí)輻誘變處理可導(dǎo)致IAA，GA₃和ABA等內(nèi)源激素水平的改變，進(jìn)而影響愈傷組織再分化。趙云龍等^[26]研究⁶⁰Co-γ射線輻射對(duì)大白杜鵑的矮化效應(yīng)，20～60 Gy輻射處理后IAA和GA₃、玉米素核苷（ZR）含量降低，ABA含量增加，較高水平的ABA含量有利于植株的矮化。本研究發(fā)現(xiàn)⁶⁰Co-γ輻射導(dǎo)致愈傷組織IAA，GA₃和ABA含量增加，使愈傷組織階段的內(nèi)源激素水平維持在一定范圍內(nèi)，盡而影響了3種內(nèi)源激素的比值，促使愈傷組織綠色芽點(diǎn)分化和根芽再分化；在愈傷組織的分化苗中，一定的輻射劑量可以提高IAA，GA₃和ABA水平，但600和800 Gy輻射劑量的分化苗各器官的3種激素水平變化存在差異，影響了IAA/ABA，GA₃/ABA和IAA/GA₃比值，說(shuō)明在不同內(nèi)源激素和輻射劑量互作下影響了愈傷組織的再分化。

4 結(jié)論

CK，G600和G800苜蓿愈傷組織在MS+2.00 mg·L^-12，4-D+6-BA 1.00 mg·L^-1可實(shí)現(xiàn)綠色芽點(diǎn)分化，輻射促進(jìn)苜蓿愈傷組織綠色芽點(diǎn)分化；愈傷組織在MS培養(yǎng)基上不添加外源激素可直接分化成苗；愈傷組織中IAA含量、IAA/ABA和IAA/GA₃比值最高，GA₃含量和GA₃/ABA在莖中最高，ABA含量在根中最高。輻射處理影響了愈傷組織和分化苗3種激素水平和比值變化。內(nèi)源激素IAA，GA₃和ABA是分化苗產(chǎn)生的重要因子，通過(guò)外源激素和內(nèi)源激素誘導(dǎo)可實(shí)現(xiàn)愈傷組織的綠色芽點(diǎn)產(chǎn)生和再分化過(guò)程。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）