基于EST-SSR標(biāo)記的60份葦狀羊茅遺傳多樣性分析

摘要：葦狀羊茅（Festuca arundinacea Schred）是多年生冷季型禾草，作為草坪草、牧草、生態(tài)修復(fù)草種在溫帶有著廣泛的應(yīng)用。本研究以60份不同來源的葦狀羊茅種質(zhì)為材料，利用表達(dá)序列標(biāo)簽-簡(jiǎn)單序列重復(fù)（EST-SSR）引物對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析，對(duì)其構(gòu)建指紋圖譜，對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定與評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：20對(duì)EST-SSR引物共擴(kuò)增出173條帶，多態(tài)性條帶163條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率94.220%；所有引物均可識(shí)別種質(zhì)，不同的引物組合可以區(qū)分60份種質(zhì)；聚類結(jié)果與地理區(qū)劃有一定的關(guān)聯(lián)，但不明顯；60份參試材料最佳亞群數(shù)為3。研究結(jié)果表明：60份種質(zhì)的遺傳多樣性處于中等水平；SSR標(biāo)記可以有效地鑒定葦狀羊茅種質(zhì)并評(píng)價(jià)其遺傳差異，為葦狀羊茅核心種質(zhì)的構(gòu)建、新品種的選育奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：葦狀羊茅；EST-SSR；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號(hào)：Q311 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2023）07-2041-08

Genetic Diversity Analysis of 60 Tall Fescue Varieties Based on EST-SSR Markers

YI Ran， WANG Zi-yue， LIU Ling-yun， CHANG Zhi-hui*

（College of grassland science， Beijing Forestry University， Beijing 10083， China）

Abstract：Tall fescue （Festuca arundinacea Schred） is a perennial cool-season grass with a wide range of applications in temperate zones as a turfgrass，forage grass，and ecological restoration grass. In this study，60 tall fescue varieties from different sources were analyzed for genetic diversity using expressed sequence tag-simple sequence repeat （EST-SSR） primers，and fingerprint profiles were constructed to identify and evaluate the germplasm resources. The results showed that a total of 173 bands were amplified by 20 EST-SSR primers，163 of which were polymorphic bands，with a percentage of 94.220%;all primers identified varieties and different primer combinations can identify 60 varieties;the clustering results were correlated with geographic regions，but was not obvious;and three subgroups were determined to be the optimal number for the 60 participating materials. The results indicated that the genetic diversity of the 60 varieties was at a medium level，and the SSR markers can effectively identify tall fescue varieties and evaluate its genetic differences，laying the foundation for the construction of core tall fescue varieties and the selection and breeding of new varieties of tall fescue.

Key words：Festuca arundinacea;EST-SSR;Genetic diversity;Cluster analysis

葦狀羊茅（Festuca arundinacea Schred）是禾本科（Gramineae）羊茅屬（Festuca）的多年生冷季型草本植物，廣泛種植于溫帶地區(qū)^[1]。葦狀羊茅具有發(fā)達(dá)的根系，成坪快，抗逆性強(qiáng)，且對(duì)重金屬有一定的吸收耐受能力，在牧草生產(chǎn)、草坪綠化、生態(tài)修復(fù)等多方面應(yīng)用^[2-4]。

種質(zhì)資源是生物品種改良工作的基礎(chǔ)，種質(zhì)資源數(shù)量及質(zhì)量是實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo)的關(guān)鍵，因此對(duì)優(yōu)良種質(zhì)的廣泛搜集、鑒定評(píng)價(jià)工作尤為重要^[5]。葦狀羊茅的種質(zhì)資源豐富^[6]，但由于其為異源六倍體（2n=6x=42），且具有異花授粉、高度自交不親和的特性^[7]，形態(tài)標(biāo)記等傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法很難對(duì)其進(jìn)行差異比較，評(píng)估其種質(zhì)特性^[8]。因此，不受環(huán)境影響的DNA分子標(biāo)記可以為葦狀羊茅的遺傳育種研究提供了一種準(zhǔn)確、有效的方法^[9]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記，具有共顯性遺傳、多態(tài)性高、易檢測(cè)、特異性好、通用性高及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種中^[10]。SSR可根據(jù)其來源，分為基因組SSR和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（EST-SSR）。相比于基因組SSR，來源于編碼區(qū)的EST-SSR可以從根本上表現(xiàn)出植物基因組功能的信息。春蘭（Cymbidium goeringii）^[11]、苔草屬（Carex L.）^[12]等多種植物的遺傳多樣性分析中得到了廣泛的應(yīng)用。

目前，葦狀羊茅EST-SSR標(biāo)記已被開發(fā)并應(yīng)用于遺傳多樣性分析。Cuyue等^[13]利用15個(gè)EST-SSR引物和毛細(xì)管電泳對(duì)161份羊茅屬植物的遺傳多樣性進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)顯示葦狀羊茅具有豐富的遺傳多樣性。Fu等^[9]對(duì)19份牧草型和2份草坪型葦狀羊茅進(jìn)行了EST-SSR標(biāo)記，將21份葦狀羊茅分為6個(gè)主要類群，并通過結(jié)構(gòu)分析將21份葦狀羊茅分為3個(gè)亞枝。王子玥等^[14]將EST-SSR標(biāo)記與種子表型特征相結(jié)合，研究36份葦狀羊茅種質(zhì)的遺傳多樣性，結(jié)果表明36份材料的異質(zhì)性高，可被分為3類及1個(gè)混合群體。盡管已有相關(guān)研究，但大部分研究涉及的葦狀羊茅種質(zhì)數(shù)量較少，多為20～30種。不僅如此，國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究還多以商業(yè)品種為材料，對(duì)于不同地理來源種質(zhì)遺傳多樣性的研究鮮有報(bào)道。

相較于國(guó)外，我國(guó)草育種工作開展較晚。1998—2019年我國(guó)審定的葦狀羊茅品種有16，其中自育品種僅有5個(gè)，且均通過常規(guī)育種技術(shù)進(jìn)行培育^[1]。常規(guī)育種技術(shù)育種程序慢，周期長(zhǎng)，且性狀遺傳穩(wěn)定性差^[15]。因此，需要利用更為快速、便捷且準(zhǔn)確性高的技術(shù)手段對(duì)葦狀羊茅遺傳多樣性進(jìn)行研究，對(duì)其進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)，有針對(duì)性地進(jìn)行育種工作，以滿足當(dāng)前對(duì)葦狀羊茅的利用需求。為了解不同地理來源的葦狀羊茅的遺傳多樣性及種質(zhì)間的親緣關(guān)系，本研究利用EST-SSR標(biāo)記對(duì)60份葦狀羊茅種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，通過遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析，以期對(duì)60份材料的遺傳差異進(jìn)行研究，為葦狀羊茅種質(zhì)評(píng)價(jià)及新品種選育工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 種質(zhì)資源的收集

試驗(yàn)主要以全國(guó)畜牧總站提供的52份葦狀羊茅種質(zhì)為材料，分別來自于3大洲9個(gè)國(guó)家：北美洲[加拿大（3）、美國(guó)（4）]、歐洲[丹麥（2）、俄羅斯（1）、捷克（1）、葡萄牙（1）、匈牙利（1）]、亞洲[中國(guó)（36）、日本（3）]。其中中國(guó)的36份材料分別來自北京、甘肅、貴州、江蘇、寧夏、山西、陜西、四川、新疆、云南和重慶。同時(shí)，為探究以上52份種質(zhì)潛在的優(yōu)良特性，試驗(yàn)以8份商業(yè)品種（表1）為參考，對(duì)兩者進(jìn)行聚類分析。8份商業(yè)品種均來自美國(guó)，由百綠國(guó)際草業(yè)有限公司、北京正道種業(yè)提供。為方便后續(xù)試驗(yàn)，對(duì)60份材料進(jìn)行重新編號(hào)（表2）。

1.2 基因組DNA提取和EST-SSR標(biāo)記

每份供試材料選取15顆種子，在2021年8月12日放置在培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)與預(yù)培養(yǎng)[25℃/20℃，16 h/8 h（光照/黑暗），光強(qiáng)24 000 lx，濕度65%]。一周后，將發(fā)芽盒中的植株移栽至花盆中，花盆放置在三頃園苗圃（40°00′24″ N，116°19′60″ E）。生長(zhǎng)45天后進(jìn)行取樣，每份種質(zhì)隨機(jī)選擇5顆單株，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的嫩葉混合，液氮充分研磨。利用Omega試劑盒提取DNA，使用Nanodrop 2000檢測(cè)所提DNA濃度，60份材料的OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.7～2.0之間。使用2%瓊脂糖電泳凝膠檢測(cè)濃度后，將試樣濃度稀釋至30 ng·μL^-1，-20℃保存，用于后續(xù)的PCR反應(yīng)。

試驗(yàn)所利用的引物是從Saha等^[16]設(shè)計(jì)的157對(duì)引物中隨機(jī)挑選的27對(duì)（由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成），選擇其中擴(kuò)增效果良好的20對(duì)引物（表3）。10 μL PCR反應(yīng)體系為5 μL 2×Taq Master Mix（北京睿博興科生物技術(shù)有限公司），0.2 μmol·L^-1正、反向引物，2 μL樣品DNA和2.6 μL無菌水。利用Bio-Rad T100 PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?4℃初變性3 min，94℃變性30 s，60℃～64℃特定退火溫度30 s和72℃延伸60 s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，之后72℃延伸10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行8%聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳，通過銀染法顯現(xiàn)，照燈拍照保存，用于后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

由于葦狀羊茅多為六倍體且取樣為多單株混合取樣，標(biāo)記的一個(gè)位點(diǎn)可能在3個(gè)亞基因組中出現(xiàn)多條條帶，無法按照二倍體共顯性標(biāo)記，對(duì)基因型進(jìn)行記錄。因此，在某一位點(diǎn)上的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按“有”“無”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有條帶的記為“1”，反之記為“0”。遺傳距離、聚類分析及其結(jié)果的相關(guān)性檢驗(yàn)利用NTSYS軟件分析。觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon信息指數(shù)（I）等遺傳信息利用POPGEN 32計(jì)算。引物的多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）計(jì)算公式為：PICi=1-∑ⁱ_jP²_ij^[12]（其中P_i，P_j分別為群體中第i，j個(gè)等位基因頻率）。種群結(jié)構(gòu)利用STRUCTURE 2.3.4軟件分析，設(shè)置K值從1～10，每個(gè)K值進(jìn)行5次獨(dú)立運(yùn)算，burn-in設(shè)置為100 000次，MCMC（馬爾科夫鏈蒙特卡羅）迭代設(shè)置為1 000 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增所得條帶

利用表3中的20對(duì)引物對(duì)60份葦狀羊茅種質(zhì)進(jìn)行EST-SSR擴(kuò)增，每對(duì)引物均可擴(kuò)增出清晰且多態(tài)性高的條帶，共擴(kuò)增出173條帶，不同引物擴(kuò)增出的條帶在4（NFA088）～14（NFA001）之間；其中多態(tài)性條帶163條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增8.15多態(tài)性條帶，多態(tài)性位點(diǎn)百分率94.220%。

2.2 指紋圖譜

對(duì)所擴(kuò)增條帶進(jìn)行“0”“1”規(guī)則讀數(shù)，對(duì)比讀數(shù)結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，所有引物均可鑒別種質(zhì)；NFA001，NFA006，NFA012，NFA029可鑒別超過20份種質(zhì)，其中NFA012所鑒別種質(zhì)最多，可達(dá)36份。對(duì)引物的鑒別結(jié)果進(jìn)行分析，不同的引物組合可以區(qū)分60份種質(zhì)，例如NFA001和NFA029引物組合。

2.3 遺傳多樣性分析

對(duì)60份葦狀羊茅種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。60份種質(zhì)多態(tài)性信息Na，Ne，H，I的平均值分別為1.932，1.424，0.259，0.401（表4）。Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)是反映作物種質(zhì)資源間多樣性的的主要指標(biāo)，其數(shù)值越大，說明種質(zhì)資源遺傳多樣性越豐富。結(jié)果表明，參試的60份葦狀羊茅種質(zhì)之間的遺傳多樣性水平高。60份種質(zhì)的平均遺傳距離為0.258。不同引物的PIC值在0.111（NFA088）～0.417（NFA073）之間，平均值為0.259，這表明所用引物有較高的多態(tài)性。

2.4 UPGMA聚類分析

對(duì)60份葦狀羊茅種質(zhì)EST-SSR分子標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行UPGMA聚類分析（圖2）。對(duì)聚類結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，其相關(guān)性系數(shù)為r=0.813，說明聚類結(jié)果可靠。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，60份種質(zhì)在遺傳相似系數(shù)在0.71處可分為4類和1個(gè)混合群體；當(dāng)遺傳相似系數(shù)在0.75處，可進(jìn)一步將第Ⅰ類分為4亞類。T2和T42遺傳相似系數(shù)最高，為0.89。

2.5 主成分分析

對(duì)60份種質(zhì)按其地理來源分類，其中Pop1為北美洲種質(zhì)，Pop2為歐洲種質(zhì)，Pop3為亞洲種質(zhì)；之后對(duì)其進(jìn)行主成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前三個(gè)主成分貢獻(xiàn)率依次為12.14%，9.58%，8.64%，占總遺傳變異的30.35%。60份不同來源的種質(zhì)混合在一起，并未有明顯的分類，說明參試種質(zhì)之間存在基因交流。

2.6 種群結(jié)構(gòu)分析

利用STRUCTURE結(jié)構(gòu)軟件進(jìn)一步分析60份材料的結(jié)構(gòu)，確定其最佳亞群數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K=3時(shí)，ΔK出現(xiàn)最大峰值（圖4），因此確定60份材料的最佳亞群數(shù)為3（圖5）。

3 討論

經(jīng)過近十年的發(fā)展，我國(guó)已初步建立了完整的草種業(yè)體系，但仍存在已育成草類植物的新品種少，難以滿足我國(guó)對(duì)草種多功能、多區(qū)域的需求的難題^[17]。我國(guó)草類植物種質(zhì)資源豐富，對(duì)其遺傳背景進(jìn)行多角度的分析評(píng)價(jià)，挖掘其中的優(yōu)異基因，可幫助我們培育更適合我國(guó)需求的新品種。目前我國(guó)對(duì)葦狀羊茅遺傳多樣性的分析仍不足，且多利用商業(yè)品種進(jìn)行研究。因此，急需針對(duì)我國(guó)葦狀羊茅種質(zhì)遺傳背景的相關(guān)研究。本研究以60份來自9個(gè)國(guó)家的種質(zhì)為材料，其中36份為我國(guó)葦狀羊茅種質(zhì)，從地理區(qū)劃、EST-SSR標(biāo)記兩方面來探究種質(zhì)資源間的差異。

本研究中，Shannon信息指數(shù)平均值為0.401，低于王子玥等^[14]的0.420。出現(xiàn)以上結(jié)果可能是由于王子玥等的研究所使用的種質(zhì)以野生種居多，而本研究中的種質(zhì)多為引進(jìn)種；相較于野生種，引進(jìn)種可能由于來源相同或相近，種內(nèi)基因交流較種間交流多，導(dǎo)致其遺傳多樣性水平較該研究低。60份參試材料的遺傳相似系數(shù)為0.524～0.880，說明參試種質(zhì)的遺傳多樣性處于中等水平。60份種質(zhì)之間相似系數(shù)變化低于王子玥等^[14]的研究結(jié)果，但高于Fu等^[9]的研究結(jié)果。Fu等所使用材料為商業(yè)品種，21份材料的育種起源相近，故而其相似系數(shù)變化較??；但王子玥等所使用的材料來自于17個(gè)國(guó)家，其遺傳背景可能因此更為豐富。

除此之外，在本研究中，PIC最高的引物是NFA073，這與王子玥等^[14]的結(jié)果也有不同。在該研究中，PIC值最高的是NFA021；該引物在本研究中的PIC值處于中等水平，這可能是種質(zhì)來源不同導(dǎo)致的。鄧紹勇等^[18]利用EST-SSR標(biāo)記對(duì)10個(gè)梔子（Gardenia jasminoides）品種構(gòu)建指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)不同引物組合可以完成梔子所有品種的區(qū)分；張俊超等^[19]也利用不同EST-SSR引物組合對(duì)52份老芒麥（Elymus sibiricus）材料進(jìn)行區(qū)分。本研究對(duì)60份種質(zhì)構(gòu)建指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同引物組合可以對(duì)種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分，說明EST-SSR分子標(biāo)記可以有效、便捷地對(duì)葦狀羊茅進(jìn)行區(qū)分，為其識(shí)別工作提供幫助。

了解物種間的親緣關(guān)系是種質(zhì)創(chuàng)新的基礎(chǔ)^[20]。親本的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)則有更大可能獲得雜種優(yōu)勢(shì)，但雜交成功率也會(huì)隨之減低^[21]。經(jīng)聚類分析，60份種質(zhì)可被分為4類和1個(gè)混合群體。將聚類結(jié)果與地理區(qū)劃相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)本研究中的UPGMA聚類結(jié)果與地理區(qū)劃有一定的關(guān)聯(lián)，但不明顯。例如，來自亞洲的T11，T12，T40，T34，T17被聚為一類，歐洲群體的T4，T6聚為一類。

對(duì)北美洲、歐洲、亞洲的種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，亞洲種質(zhì)的遺傳多樣性最高，其遺傳相似系數(shù)變化為0.32；其次為北美洲種質(zhì)，遺傳相似系數(shù)變化為0.22；歐洲種質(zhì)的遺傳多樣性最小，僅為0.16。一個(gè)物種在其起源中心的遺傳多樣性最為豐富^[22]；葦狀羊茅原產(chǎn)于歐洲大部分地區(qū)、地中海地區(qū)^[23]，我國(guó)新疆、貴州等地亦有葦狀羊茅的分布^[24]。在本研究中，亞洲種質(zhì)的遺傳多樣性最高，一方面是由于新疆、貴州等地有葦狀羊茅的自然分布，另一方面可能是引進(jìn)種在當(dāng)?shù)嘏c野生種進(jìn)行了基因交流，增加了種質(zhì)的遺傳多樣性。盡管歐洲為葦狀羊茅的起源中心，但在本研究中歐洲種質(zhì)的遺傳多樣性最低，出現(xiàn)這種情況可能是由于6份種質(zhì)均從俄羅斯引進(jìn)，已經(jīng)過相似的自然與人工選擇，拉近了其遺傳多樣性。本研究中，北美洲種質(zhì)的遺傳多樣性為中等水平，這可能是多次從不同地區(qū)引種導(dǎo)致的。

針對(duì)其中的中國(guó)種質(zhì)，相同區(qū)域的種質(zhì)并沒有完全聚為一類。葛大朋等^[25]對(duì)西藏石榴（Punica granatum）進(jìn)行UPGMA聚類劃分，所得結(jié)果與地理來源有一定的關(guān)聯(lián)，但并不完全一致；陳志祥等^[26]發(fā)現(xiàn)多數(shù)不同地理來源的木豆（Cajanus cajan）種質(zhì)并未聚為一類；Liu等^[27]對(duì)中國(guó)鱷梨（Persea americana）進(jìn)行研究，也有同樣發(fā)現(xiàn)。這與本研究所得結(jié)果相同。相同來源的種質(zhì)緊密聚類，表明其遺傳具有特異性；同一區(qū)域的種質(zhì)被分在不同分支中，表明其的進(jìn)化來源可能不同。葦狀羊茅具有異花授粉，高度自交不親和的特征。因此這樣的聚類結(jié)果，可能也與國(guó)內(nèi)葦狀羊茅的引種、種間雜交而造成的基因交流有關(guān)。與其他種植遺傳相似系數(shù)最低的T23，相較于其他種質(zhì)，可能存在與其它物種進(jìn)行基因交流較多的情況。

另外，本研究選擇了8份特征類型不同的商業(yè)品種，與其聚為一類的種質(zhì)，可能存在同源或具有相似的優(yōu)良性狀，可在未來為該利用類型育種計(jì)劃提供新的種質(zhì)來源。例如與牧草型葦狀羊茅品種‘法恩’聚為一類的T28，可能具有抗旱耐熱、產(chǎn)量高的優(yōu)良性狀；與草坪型葦狀羊茅品種‘鈦極’緊密聚類的T5，可能更為耐蔭抗旱。

核心種質(zhì)能以最小數(shù)量，最大程度地代表全部資源的遺傳多樣性^[28]，這有利于種質(zhì)資源的保存、提高利用效率^[29]。對(duì)參試材料進(jìn)行初步篩選，發(fā)現(xiàn)T21，T22，T29，T37所包含的等位基因最多，具有核心種質(zhì)的潛力，可進(jìn)一步擴(kuò)充種質(zhì)資源庫(kù)，利用不同算法對(duì)葦狀羊茅種質(zhì)構(gòu)建核心種質(zhì)。

4 結(jié)論

對(duì)60份葦狀羊茅進(jìn)行地理區(qū)劃、EST-SSR標(biāo)記等不同角度的遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地理區(qū)劃與分子標(biāo)記結(jié)果有所差異，參試種質(zhì)遺傳多樣性處于中等水平，但仍可為葦狀羊茅育種計(jì)劃提供新材料。篩選發(fā)現(xiàn)T21，T22，T29，T37所包含的等位基因最多，具有核心種質(zhì)潛力。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）