毒害草入侵擴散對滇西北亞高山草甸土壤微生物多樣性的影響

摘要：為探明毒害草入侵對滇西北亞高山草甸土壤微生物的影響。本研究以香格里拉市國家草原固定監(jiān)測樣地為研究對象，以樣地內的草地早熟禾（Poa pratensis）（設為對照）、大狼毒（Euphorbia jolkinii）、網(wǎng)脈橐吾（Ligularia dictyoneura）斑塊為取樣單元，開展毒害草入侵擴散對亞高山草甸土壤微生物多樣性的影響研究。結果表明：與早熟禾斑塊相比，大狼毒和網(wǎng)脈橐吾斑塊土壤細菌、真菌和放線菌菌群密度，土壤細菌和真菌總OTU數(shù)量、特有OTU數(shù)量、α多樣性和β多樣性均顯著增加（P＜0.05）。在細菌門水平上，酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）相對豐度降低，變形菌門（Proteobacteria）相對豐度增加。在真菌門水平上，擔子菌門（Basidiomycota）相對豐度降低，子囊菌門（Ascomycota）相對豐度增加。在屬水平上，古根菌屬（Archaeorhizomyces）相對豐度降低，濕傘屬（Hygrocybe）相對豐度增加。綜上，大狼毒和網(wǎng)脈橐吾的入侵擴散增加了土壤微生物菌群密度及OTU數(shù)量，改變了微生物物種組成及多樣性，促進了土壤微生物的生長繁殖。

關鍵詞：大狼毒；網(wǎng)脈橐吾；入侵擴散；土壤微生物

中圖分類號：S154.3 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2023）07-1996-09

Effect of Invasion and Diffusion of Poisonous Weeds on Soil Microbial Diversity in Subalpine Meadow in Northwest Yunnan

NIU Qiong-mei^1#， SHAN Gui-lian^1#， LUO Qin1， LIU Yang²， LIU Jia³， XIE Yong⁴， DENG Shen-cai1， YANG Xin1， CHU Xiao-hui^1*

（1. Department of Grassland Science， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan Province 650201， China; 2. Forestry and Grassland Bureau of Yunnan Province， Kunming， Yunnan Province 650224， China; 3. Shangri La Forestry and Grassland Bureau， Diqing， Yunnan Province 674499， China; 4. Kunming Municipal Animal Disease Prevention and Control Center， Kunming， Yunnan Province 650223， China）

Abstract：To explore the effect of poisonous weeds invasion on soil microorganisms in subalpine meadow in northwest Yunnan，the fixed monitoring site of shangri-La was selected as the research object，and three patches，which are dominated by Poa pratensis（set as control），Euphorbia jolkinii and Ligularia dictyoneura， were chosen as the sampling units，and the effect of poisonous weeds invasion and diffusion on soil microbial diversity of subalpine meadow was investigated in this study. The results showed as follows：compared with what in Poa pratensis patch，the density of soil bacteria，fungi and actinomycetes，the total OTUs and endemic OTUs，the α diversity and β diversity of soil bacteria and fungi were significantly increased in E. jolkinii patch and L. dictyoneura patch （Plt;0.05）. At the level of bacterial phyla，the relative abundance of Acidobacteriota and Chloroflexi decreased，while that of Proteobacteria increased. At the fungal phylum level，the relative abundance of Basidiomycota decreased，while that of Ascomycota increased. At the genus level，the relative abundance of Archaeorhizomyces decreased，while that of Hygrocybe increased contrarily. In conclusion，the invasion and diffusion of E. jolkinii and L. dictyoneura increased the density of soil microbial flora and the number of OTUs，changed the composition and diversity of microbial species，and promoted the growth and reproduction of soil microorganisms.

Key words：Euphorbia jolkinii；Ligularia dictyoneura；Invasion and diffusion；Soil Microbial

云南省是我國草原大省，草地面積居全國第七位^[1]。在云南省西北部，分布著大面積連片的亞高山草甸^[2]。然而，在過去數(shù)十年里，在人為和自然因素的影響下，滇西北亞高山草甸退化加劇，草地上出現(xiàn)了大狼毒（Euphorbia jolkinii）、網(wǎng)脈橐吾（Ligularia dictyoneura）、綿毛橐吾（Ligularia vellerea）、狼毒（Stellera chamaejasme）、西南鳶尾（Iris bulleyana Dykes）等多種毒害草，嚴重影響了當?shù)夭莸匦竽翗I(yè)的可持續(xù)發(fā)展^[1，3]。

毒害草是草地退化的指示植物^[4-5]。毒害草的擴散蔓延會對草地植被、土壤養(yǎng)分、土壤微生物等帶來顯著影響^[3，5]。就草地生態(tài)系統(tǒng)而言，土壤微生物與土壤中有機質的分解、轉化和積累等過程密切相關，并介導有機質形成過程，間接改變植物養(yǎng)分的獲得量，影響植物生產(chǎn)力和多樣性^[6-8]。毒害草入侵擴散會對草地土壤生物學活性、菌群密度、微生物多樣性等產(chǎn)生有利影響^[9-11]。有毒植物醉馬芨芨草（Achnatherum inebrians）根際微生物數(shù)量顯著高于伴生植物針茅（Stipa capillata）和硬質早熟（Poa sphondylodes）^[9]。隨著大狼毒種群覆蓋度由5.4%增加到45.4%，土壤中細菌、真菌、放線菌的數(shù)量顯著增加^[10]。細葉亞菊（Ajania tenuifolia）和黃帚橐吾（Ligularia virgaurea）的入侵會顯著提高土壤細菌豐度^[11]。也有學者研究發(fā)現(xiàn)毒害草入侵擴散會降低土壤微生物豐度及多樣性或對土壤微生物無顯著影響^[11-13]。與無狼毒區(qū)相比，狼毒發(fā)生區(qū)真菌的物種多樣性降低^[12]。黃帚橐吾入侵對土壤真菌沒有顯著影響^[11，13]，肅馬先蒿（Pedicularis kansuensis）的入侵會顯著降低土壤細菌豐度^[13]。

大狼毒、網(wǎng)脈槖吾等是滇西北退化亞高山草甸普遍分布的毒害草^[1，3]，它們的入侵擴散會對草地植被^[3]、土壤養(yǎng)分、微生物數(shù)量^[1，10]產(chǎn)生顯著影響，其分泌的次生代謝物質還會對伴生植物的萌發(fā)生長產(chǎn)生化感抑制作用^[14-15]。大狼毒、網(wǎng)脈槖吾等毒害草在滇西北亞高山草甸的入侵擴散是否會對土壤微生物群落物種組成及多樣性產(chǎn)生影響，檢索資料發(fā)現(xiàn)前人尚未開展過相關研究，未見研究報道。基于此，本研究選取位于滇西北香格里拉市拖木南小組的國家級草原固定監(jiān)測樣地為研究對象，根據(jù)毒害草在樣地中呈斑塊狀分布的特點，以監(jiān)測樣地內的草地早熟禾（Poa pratensis）、大狼毒、網(wǎng)脈橐吾3個植物斑塊為取樣單元，開展毒害草入侵擴散對滇西北亞高山草甸土壤微生物群落物種組成及多樣性的影響研究，研究成果可為滇西北毒害草型退化草地管理對策的制定提供指導。

1 材料與方法

1.1 研究樣地自然概況

研究區(qū)域地處青藏高原南緣香格里拉市小中甸鎮(zhèn)。在研究區(qū)域，選取位于拖木南小組的市林業(yè)與草原局國家級草原固定監(jiān)測樣地為研究對象。該樣地地處27°29′0″N，99°52′16″E，海拔3 240 m，屬低緯度高海拔地區(qū)，氣候類型屬寒溫帶山地季風氣候，氣溫偏低，年均溫5.8℃，年均降水量647 mm，年日照時數(shù)2 168 h，≥10℃年積溫2 006.9℃^[2]。

研究樣地植被類型為亞高山草甸，土壤類型為亞高山草甸土。該樣地于2012年11月圍封禁牧，封育之前自由放牧，放牧強度約為每公頃3頭藏豬和 0.5頭牦牛^[10]，樣地主要植物為草地早熟禾、西南委陵菜（Potentilla fulgens）、大狼毒、網(wǎng)脈橐吾等，且大狼毒、網(wǎng)脈槖吾等毒害草在樣地中呈斑塊狀分布。

1.2 試驗設計

在研究樣地內，根據(jù)毒害草斑塊狀分布的特點，結合各斑塊的優(yōu)勢物種，將樣地進一步劃分為草地早熟禾斑塊（Z）、大狼毒斑塊（D）、網(wǎng)脈橐吾斑塊（T）3個取樣單元。每一取樣單元重復5次。各取樣單元草地早熟禾、大狼毒、網(wǎng)脈橐吾重要值見表1。

1.3 土壤樣品的采集

2022年8月，在每一取樣地各選取5個0.5 m×0.5 m的樣方除去地上植被及地表的腐殖質，用滅菌土鉆按梅花形采集0～15 cm土層的土壤樣品，去除雜質，將同一樣地采集的土壤樣品均勻混合，后分為3份即重復3次，過2 mm土壤篩后分成2份，一份裝入凍存管，干冰保存送至北京百邁克生物科技有限公司測定微生物種類及多樣性，一份放入滅菌袋，裝入便攜式低溫箱（4℃）帶回實驗室，測定微生物菌群密度。

1.4 土壤樣品的測定

1.4.1 土壤微生物菌群密度的測定 以4℃保存的新鮮土壤樣品為材料，采用平板計數(shù)法測定土壤細菌、真菌及放線菌菌群密度。細菌采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，真菌采用馬丁孟加拉紅（虎紅）培養(yǎng)基，放線菌采用改良高氏一號培養(yǎng)基。稱取保存于4℃冰箱的新鮮土壤10 g于錐形瓶內加入90 mL無菌水，放入恒溫震蕩機內震蕩1 h，在無菌條件下配以10為單位的稀釋液，稀釋梯度為10^-2，10^-3，10^-4。取稀釋的土壤懸液各50 μL接種，每個濃度3次，放置于恒溫箱中培養(yǎng)3—4天記錄數(shù)據(jù)。

1.4.2 土壤微生物多樣性的測定 土壤微生物多樣性委托北京百邁克生物科技有限公司測定。使用TGuide S96磁珠法對土壤基因組DNA進行提取，使用酶標儀對提取的核酸進行濃度檢測，之后進行PCR擴增，使用濃度為1.8%的瓊脂糖凝膠電泳對擴增后的PCR產(chǎn)物進行完整性檢測。利用VAHTSTM Universal DNA Library Pren Kit試劑盒構建文庫，文庫通過Qsep-400進行片段質檢，使用Qubit3.0進行文庫濃度的定量，對于構建好的文庫使用illumina novaseq6000進行上機測序。測序使用試劑盒NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit。細菌引物序列為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）擴增區(qū)間為16SrNAV3-V4區(qū)。真菌引物序列為ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′）擴增區(qū)間為ITS1區(qū)。PCR反應體系：擴增體系10 μL，其中基因組DNA5-50 ng，上游引物（10 μM）和下游引物（10 μM）各0.3 μL，KOD FX Neo Buffer5 μL，dNTP（2 mM each）2 μL，KOD FX Neo0.2 μL，ddH₂O補充至10 μL。PCR反應條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 40 s，72℃ 7 min，4℃ ∞ 25個循環(huán)。

1.5 指標計算與數(shù)據(jù)處理

1.5.1 指標計算 α多樣性指數(shù)包括Chao1指數(shù)，Ace指數(shù)，辛普森指數(shù)（Simpson index），香農指數(shù)（Shannon index）其中。

Chao1=Sobs+n1（n1-1）/2（n2+1）

式中：Sobs表示樣本中觀察到OTU數(shù)目；n1是樣本中數(shù)量只為1的OTU數(shù)目；n2是樣本中數(shù)量只為2的OTU數(shù)目。Ace指數(shù)同Chao1指數(shù)一樣：評估樣本中物種組成的豐富度和均勻度值越高代表群落物種越豐富。

式中：Sobs為實際測出的OTU數(shù)目；Pi為種i的個體在群落中的比例；Pi2表示隨機取2個個體為同種的概率。

1.5.2 數(shù)據(jù)處理 運用SPSS 17.0對微生物數(shù)量測定數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并使用LSD法進行多重比較，采用Origin2022 作圖。測序數(shù)據(jù)先通過QIIME2 2020.6 ^[16]軟件過濾，去除低質量的序列，依據(jù)97%相似度將序列聚集為OTU（操作分類單元，Operational Taxonomic Unit）。以SILVA為參考數(shù)據(jù)庫使用樸素貝葉斯分類器對每個OTU的序列做物種注釋，得到對應的物種信息和豐度信息，再利用R語言和Origin2022繪制樣品各分類學水平下的群落結構圖。土壤微生物群落的α多樣性和β多樣性分析采用QIIME2 2020.6^[16]，利用R語言和Origin2022繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同斑塊土壤微生物菌群密度及OTU數(shù)量

由圖1可知，與Z相比，D和T土壤細菌、真菌、放線菌菌群密度顯著增加（Plt;0.05）。T土壤細菌、真菌、放線菌菌群密度分別增加了7.7%，18.8%和9.6%，D分別增加了7.7%，16.7%和17.4%。就D和T斑塊 3大類微生物菌群密度差異性來看，土壤細菌、真菌菌群密度在兩斑塊間無顯著差異，放線菌菌群密度以D顯著高于T（Plt;0.05）。

由圖2（A）可知，Z，D，T土壤細菌的OTU數(shù)量分別為5 294，5 819，6 162，占比為35.1%，38.6%，40.9%，其中3個斑塊特有的細菌OTU數(shù)量分別為4 041，4 615，4 822，占比分別為26.8%，30.6%，32%，其中3斑塊共有的細菌OTU數(shù)量為613個，占比為4.1%；由圖2（B）可知，Z，D，T土壤真菌的OTU數(shù)量分別為1 583，1 854，1 880，占比為36.2%，42.4%，43%，其中3個斑塊特有的真菌OTU數(shù)量分別為1 053，1 313，1 291，占比分別為24.1%，30.0%，29.5%，其中3斑塊共有的真菌OTU數(shù)量為224個，占比為5.12%。

2.2 不同斑塊土壤微生物群落物種組成

本研究注釋到細菌門39個、綱104個、目273個、科535個、屬915個、種1 053個。真菌門13個、綱48個、目114個、科225個、屬452個、種582個。圖3，圖4展示相對豐度最高的10個門和屬，其余合并顯示為others。

由圖3（A）可知，在門水平上，Z，D，T土壤細菌的優(yōu)勢菌門（相對豐度gt;10%）以酸桿菌門（Acidobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）為主，它們在3個斑塊的占比分別為67.6%，66.7%和65.4%。就優(yōu)勢菌門在各斑塊的相對豐度來看，酸桿菌門為Z（32.5%）gt;T（31.03）gt;D（28.7%），變形菌門為Z（20.1%）lt;T（23.0%）lt;D（25.6%），綠彎菌門為Z（14.4%）gt;T（12.7%）gt;D（11.2%）。

由圖3（B）可知，在門水平上，Z，D，T土壤真菌的優(yōu)勢菌門為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），它們在3個斑塊的占比分別為94.6%，94.8%，93.6%。就優(yōu)勢菌門在各斑塊的相對豐度來看，子囊菌門為T（69.3%）gt;D（64.7%）gt;Z（63.8%），擔子菌門為Z（30.7%）gt;D（28.9%）gt;T（25.5%）。

由圖4（A）可知，在屬水平上，Z，D，T斑塊土壤細菌的優(yōu)勢菌屬（相對豐度gt;5%）以未分類酸桿菌屬（unclassified_Acidobacteriales）為主，占比為T（7.2%）gt;Z（7.1%）gt;D（5.6%）。

由圖4（B）可知，在屬水平上Z，D，T斑塊土壤真菌的優(yōu)勢菌屬（相對豐度gt;10%）為未分類子囊菌門（unclassified_Ascomycota）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）、濕傘屬（Hygrocybe），此3類真菌在Z，T，D斑塊的占比分別為61.2%，67.2%和70.9%。其中未分類子囊菌門在3個斑塊優(yōu)勢度最大，占比為Z（33.5%）gt;T（32%）gt;D（32%）。古根菌屬次之，占比為Z（21.5%）gt;T（20.2%）gt;D（20.1%）。濕傘屬最小，占比為Z（6.2%）lt;T（15.1%）lt;D（18.8%）。

2.3 不同斑塊土壤微生物多樣性

2.3.1 α多樣性 α多樣性反映的是單個樣品的物種多樣性^[17]。由圖5（A）可知，與Z相比，T土壤細菌Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均顯著增加（Plt;0.05），D土壤細菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著增加（Plt;0.05），ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)有一定程度的增加，但與Z差異不顯著。由圖5（B）可知，與Z相比，D，T土壤真菌Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)均顯著增加（Plt;0.05），表明大狼毒、網(wǎng)脈槖吾的入侵擴散會顯著增加高寒草甸土壤細菌、真菌的多樣性。

2.3.2 β多樣性 非度量多維尺度（NMDS）分析表明，Z，D，T斑塊土壤樣品在排序空間中形成了不同的聚類（圖6）。各土壤樣品分布的差異表明，同一斑塊個樣品間距離較近，相似性較高，不同斑塊距離較遠，相似性較低。表明3個斑塊間土壤細菌和真菌群落差異顯著。

3 討論

土壤微生物作為生態(tài)系統(tǒng)中的分解者，積極參與生態(tài)系統(tǒng)中物質循環(huán)和能量流動，在維持生態(tài)系統(tǒng)的結構與功能方面起著十分重要的作用^[9，18]。毒害草入侵到草地生態(tài)系統(tǒng)中，可能通過多種方式改變入侵地生態(tài)系統(tǒng)結構和功能，同時影響土壤微生物群落組成和酶活性的變化^[19-22]，進而引起土壤微生物功能和多樣性的變化^{[9，11-13，23-24]}。本研究表明，大狼毒和網(wǎng)脈橐吾的入侵擴散有利于細菌和真菌的生長繁殖，與草地早熟禾斑塊相比，大狼毒和網(wǎng)脈槖吾斑塊土壤細菌、真菌、放線菌菌群密度顯著增加，土壤細菌和真菌總OTU數(shù)量、特有OTU數(shù)量增加，這與趙英偉^[27]、黃璽等^[9]、林會娜等^[25]在瑞香狼毒等毒害草上的研究結果一致。分析原因為大狼毒等毒害草生物量較大^[3]，它們的入侵擴散增加了生態(tài)系統(tǒng)凋落物的輸入，大量的凋落物可為微生物的生長提供更多營養(yǎng)物質，由此促進微生物菌群密度及OTU數(shù)量增加^[26-27]。

針對毒害草入侵對土壤微生物物種組成的影響，前人開展了一些研究，但并未取得一致結論。JIN等^[28]、程濟南等^[29]研究發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒根際土壤細菌以酸桿菌門（Acidobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）為主要優(yōu)勢菌門。而周攀^[30]研究發(fā)現(xiàn)在狼毒根際土壤中占優(yōu)勢地位的真菌是擔子菌門（Basidiomycota），而在非根際土壤中占優(yōu)勢地位的為子囊菌門（Ascomycota）。HE等^[31]研究發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒入侵地叢枝菌根真菌（AMF）的相對豐度較低，但病原真菌的相對豐度較高。劉詠梅等^[32]研究發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒擴散蔓延增加了真菌的優(yōu)勢度、但降低了真菌的豐富度。CHEN等^[33]研究發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭根系會選擇性的富集少部分分布于根際周圍的梭菌屬（Clostridium）和腸桿菌屬（Enterobacter），這種富集作用導致根際的優(yōu)勢菌門從擬桿菌門（Bacteroidetes ）變?yōu)樽冃尉T。馬建國等^[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃帚橐吾（Ligularia virgaurea）等5種有毒植物顯著影響了土壤細菌豐度，但對土壤真菌豐度沒有顯著影響。ADE等^[23]研究指出黃帚橐吾和箭葉橐吾（Ligularia sagitta）入侵后顯著影響了土壤細菌的相對豐度。本研究顯示，在細菌門水平上，大狼毒和網(wǎng)脈橐吾入侵降低了酸桿菌門、綠彎菌門相對豐度，增加了變形菌門相對豐度。在真菌門水平上，大狼毒和網(wǎng)脈橐吾入侵增加了子囊菌門相對豐度，降低了擔子菌門相對豐度。說明毒害草種類不同，土壤優(yōu)勢菌門及其相對豐度存在差異。分析原因為植物與微生物的物種組成息息相關，植物在生物和化學作用下向土壤中輸入光合物質和化感物質，這些物質在酶和微生物的作用下，有利于調控和誘導著微生物物種組成向更穩(wěn)定的方向發(fā)展，使植物和微生物之間形成了一個相對穩(wěn)定的環(huán)境條件^[9，34]；其次是毒害草的擴散增加了凋落物的輸入，凋落物中的木質素等難分解的高分子聚和物需要更多的微生物分解^[35]。

關于毒害草擴散對土壤微生物多樣性的影響，劉詠梅等^[32]研究發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒的入侵擴散降低了土壤真菌的α多樣性，顯著增加了β多樣性。HE等^[31]研究發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒入侵地真菌的α多樣性較低。石國璽等^[36]研究表明黃帚橐吾的擴散蔓延提高了微生物的代謝活動，但對土壤微生物的Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)無顯著影響。LU等^[23]研究發(fā)現(xiàn)箭葉橐吾入侵擴散對土壤細菌α多樣性無顯著影響，而黃帚橐吾的入侵擴散顯著影響了土壤細菌的α多樣性。本研究結果表明，大狼毒和網(wǎng)脈橐吾的入侵提高了土壤細菌、真菌多樣性，分析原因為毒害草對養(yǎng)分的競爭能力極強^[37-38]，入侵擴散后會產(chǎn)生“肥島效益”^{[10，13，39]}，并會通過增加微生物類群來促進養(yǎng)分循環(huán)。

綜上，大狼毒和網(wǎng)脈橐的擴散蔓延會引起滇西北亞高山草甸土壤微生物菌群密度、OTUs、物種組成及多樣性的改變，進而可能會影響大狼毒和網(wǎng)脈橐吾種群擴散蔓延區(qū)凋落物分解及土壤養(yǎng)分循環(huán)，其相關性有待進一步研究。

4 結論

與草地早熟禾斑塊相比，大狼毒和網(wǎng)脈橐吾入侵擴散顯著增加了土壤細菌、真菌和放線菌菌群密度，細菌、真菌的OTU數(shù)量及物種多樣性。就微生物物種組成來看，在門水平上，大狼毒和網(wǎng)脈橐吾的入侵擴散降低了優(yōu)勢菌門酸桿菌門、綠彎菌門和擔子菌門的相對豐度，增加了變形菌門和子囊菌門的相對豐度。在屬水平上，大狼毒和網(wǎng)脈橐吾的入侵擴散降低了古根菌屬的相對豐度，增加了濕傘屬的相對豐度。

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（責任編輯 劉婷婷）