青貯發(fā)酵產(chǎn)物—角鯊烯抑制β-胡蘿卜素?fù)p失的機(jī)理探究

摘要：為篩選和鑒定出抑制β-胡蘿卜素?fù)p失的青貯發(fā)酵產(chǎn)物，本研究探討了溫度（低溫3℃～20℃和30℃）和貯藏時(shí)間（10，20，40和70 d）對(duì)紫花苜蓿（Medicago sativa L.）青貯發(fā)酵品質(zhì)和β-胡蘿卜素?fù)p失的影響，鑒定了β-胡蘿卜素?fù)p失低的紫花苜蓿青貯飼料中的主要特異性青貯發(fā)酵產(chǎn)物，揭示了其降低β-胡蘿卜素?fù)p失的機(jī)制。結(jié)果表明：與低溫貯藏相比，30℃貯藏70 d的紫花苜蓿青貯飼料丁酸含量高，發(fā)酵品質(zhì)差，但β-胡蘿卜素?fù)p失少，含有5種特異性青貯發(fā)酵產(chǎn)物。其中角鯊烯含量最高，可抑制乳酸和揮發(fā)性脂肪酸對(duì)β-胡蘿卜素的破壞，且抑制乙酸和丁酸破壞β-胡蘿卜素的效果優(yōu)于乳酸和丙酸。因此，本研究發(fā)現(xiàn)了抑制β-胡蘿卜素?fù)p失的角鯊烯，揭示了其在青貯過(guò)程中降低β-胡蘿卜素?fù)p失的機(jī)制。

關(guān)鍵詞：青貯發(fā)酵產(chǎn)物；角鯊烯；β-胡蘿卜素

中圖分類號(hào)：S512.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2023）07-1988-08

Investigation on β-Carotene Loss Inhibition Mechanism by Silage Fermentation Products-Squalene

WU Ai-li1， XIAO Yu1， SHAO Tao1， ZONG Cheng1， HUANG Zhong-yong1， WU Jin-xin1， LIU Qin-hua^1*，RONG Hui²

（1. College of Agro-grassland Science， Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu Province 210095， China;2. Zhengzhou Zhengda Feed Co.， LTD.， Zhengzhou， Henan Province 450003， China）

Abstract：To screen and identify silage fermentation products that inhibit β-carotene loss during the fermentation process，the effects of temperature （low temperature，3℃～20℃;30℃） and storage time （10，20，40，and 70 d） on the fermentation quality and β-Carotene loss of alfalfa silage were investigated. The main specific fermentation products in alfalfa silage with low β-carotene loss was identified and the mechanism for reducing β-carotene loss was revealed. The results showed that alfalfa silage stored at 30℃ had high butyric acid content and poor fermentation quality but had less β-carotene loss compared with the low temperature. Furthermore，alfalfa silage stored at 30℃ contained 5 specific silage fermentation products，and squalene content was the highest among them，which can inhibit the β-carotene destruction by lactic acid and volatile fatty acids. The inhibition effect of squalene on β-carotene destruction by acetic acid and butyric acid was better than that of lactic acid and propionic acid. Thus，it was squalene that was found out to have a function to inhibit β-carotene loss in the alfalfa silage，which revealed the mechanism of reducing β-carotene loss during ensiling of alfalfa.

Key words：Silage fermentation products;Squalene;β-Carotene

收稿日期：2023-02-28；修回日期：2023-05-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31971765），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（XUEKEN2022020）資助

作者簡(jiǎn)介：

吳艾麗（1996-），女，漢族，安徽六安人，碩士研究生，主要從事飼草調(diào)制加工與貯藏研究，E-mail：wal1115@163.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：liuqinhua@njau.edu.cn

青貯飼料是現(xiàn)代集約化舍飼奶牛養(yǎng)殖的必備飼料，占日糧組成的50%以上^[1]。β-胡蘿卜素因其異戊二烯雙鍵和β-紫羅酮環(huán)結(jié)構(gòu)而有抗氧化活性。青貯飼料中的β-胡蘿卜素含量豐富，在提高家畜免疫力、抗氧化應(yīng)激能力、繁殖性能和提高畜產(chǎn)品中的維生素A含量等方面發(fā)揮著重要作用，是家畜必需的生物活性物質(zhì)^[2-4]。然而，β-胡蘿卜素在遇氧氣、光熱和強(qiáng)酸的情況下容易氧化降解。此外，植物氧化還原酶如脂氧合酶和過(guò)氧化物酶能氧化降解β-胡蘿卜素生成過(guò)氧化氫物^[5]。飼草上附生的好氧性細(xì)菌、腸桿菌、酵母菌和霉菌等微生物也會(huì)破壞β-胡蘿卜素結(jié)構(gòu)^[6]。因此β-胡蘿卜素在青貯過(guò)程中易受損失，最高可達(dá)70%^[5-7]。目前，養(yǎng)殖企業(yè)在配制日糧時(shí)常?；ㄙM(fèi)大量資金購(gòu)買維生素A添加劑，造成成本上升。因此，調(diào)制低β-胡蘿卜素?fù)p失的優(yōu)質(zhì)青貯飼料，滿足畜牧產(chǎn)業(yè)需求，具有重要意義。

溫度與發(fā)酵時(shí)間對(duì)飼草的青貯品質(zhì)產(chǎn)生重要影響，歸根結(jié)底是產(chǎn)生了不同的青貯發(fā)酵產(chǎn)物，且引起β-胡蘿卜素不同程度的損失^[8-9]。飼草在青貯過(guò)程中β-胡蘿卜素?fù)p失較少^[10]，原因可能是β-胡蘿卜素?fù)p失受到了抑制^[11]。研究發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素?fù)p失與氨態(tài)氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。在青貯過(guò)程中，微生物和植物蛋白水解酶使蛋白質(zhì)降解，產(chǎn)生氨態(tài)氮的同時(shí)也會(huì)生成其他青貯發(fā)酵產(chǎn)物，這些發(fā)酵產(chǎn)物具有抑制β-胡蘿卜素的損失的潛能，但目前尚未對(duì)此進(jìn)行挖掘研究，且青貯發(fā)酵產(chǎn)物抑制β-胡蘿卜素?fù)p失機(jī)理尚不明確。

本研究以紫花苜蓿（Medicago sativa L.）為試驗(yàn)材料，旨在從不同溫度和發(fā)酵時(shí)間處理的紫花苜蓿青貯飼料中篩選出β-胡蘿卜素?fù)p失少的青貯飼料，從中分離和鑒定出抑制β-胡蘿卜素?fù)p失的青貯發(fā)酵產(chǎn)物；解析其與β-胡蘿卜素結(jié)合的熒光強(qiáng)度及受到青貯飼料中的乳酸和揮發(fā)性脂肪酸影響的程度，為探明青貯發(fā)酵產(chǎn)物抑制β-胡蘿卜素?fù)p失的機(jī)理、減少飼草青貯過(guò)程中β-胡蘿卜素?fù)p失提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜蓿種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)試驗(yàn)基地（120°02′E，32°86′N），于初花期刈割。試驗(yàn)所用試劑均為分析純級(jí)，β-胡蘿卜素購(gòu)于上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；乙腈購(gòu)于美國(guó)天地公司；乳酸購(gòu)于南京化學(xué)試劑有限公司；乙酸購(gòu)于上海申博化工有限公司；丙酸和丁酸購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；乙醇購(gòu)于廣東光華科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)兩個(gè)青貯溫度：AT組室內(nèi)低溫（3℃～20℃）和BT組30℃；4個(gè)貯藏時(shí)間10，20，40和70天，每個(gè)處理設(shè)置4組重復(fù)。在每個(gè)貯藏時(shí)間開(kāi)窖取樣，測(cè)定發(fā)酵品質(zhì)及β-胡蘿卜素含量。

分離和鑒定青貯發(fā)酵產(chǎn)物后，選擇其中一種主要青貯發(fā)酵產(chǎn)物，模擬青貯飼料中不同比例混合的有機(jī)酸影響其保護(hù)β-胡蘿卜素效果。試驗(yàn)設(shè)3種β-胡蘿卜素-乙腈濃度：A組（1%）；B組（5%）；C組（10%）。A、B、C組分別加入不同量的角鯊烯：X組（5%）；Y組（10%）；Z組（20%）。所得9組溶液分別加入混合有機(jī)酸：a組（8%乳酸，0.5%乙酸，0.5%丙酸和0.5%丁酸）；b組（8%乙酸，0.5%乳酸，0.5%丙酸和0.5%丁酸）；c組（8%丙酸，0.5%乙酸，0.5%乳酸和0.5%丁酸）；d組（8%丁酸，0.5%乙酸，0.5%丙酸和0.5%乳酸），每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青貯飼料的調(diào)制 將紫花苜蓿切短至1～2 cm，混勻后稱取700 g裝入1 L聚乙烯實(shí)驗(yàn)室青貯窖壓實(shí)密封。AT組置于室內(nèi)低溫（3℃～20℃），BT組置于30℃培養(yǎng)箱，避光貯藏。

1.3.2 發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析 干物質(zhì)含量采用烘干法測(cè)定，105℃殺青2 h后，65℃烘干48 h。水溶性碳水化合物含量采用蒽酮—硫酸比色法測(cè)定^[12]。粗蛋白含量采用凱氏定氮法測(cè)定^[13]。中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質(zhì)素含量采用范氏纖維分析法測(cè)定^[14]。緩沖能采用鹽酸-氫氧化鈉滴定法測(cè)定^[15]。pH值采用pH 211型精密pH計(jì)（意大利HANNA公司）測(cè)定^[16]。氨態(tài)氮含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定^[17]。有機(jī)酸含量采用高效液相色譜儀測(cè)定^[17]。色譜條件：Agilent高效液相色譜儀；色譜柱：Carbomix^? H-NP5；流動(dòng)相：2.5 mmol·L^-1 H₂SO4；流速：0.7 mL·min^-1；柱溫：55℃；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器，30℃。

微生物計(jì)數(shù)采用平板培養(yǎng)法，好氧性細(xì)菌采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)（有氧，37℃）；酵母菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)（有氧，30℃）；乳酸菌采用MRS瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)（厭氧，37℃）。

1.3.3 β-胡蘿卜素含量測(cè)定 將樣品放入冷凍干燥機(jī)，在-55℃條件下冷凍干燥72 h后粉碎成凍干草粉。稱取1 g凍干草粉，依次加入15 mL 10%維生素C溶液、15 mL甲醇、35 mL無(wú)水乙醇、10 mL KOH水溶液（質(zhì)量∶體積=1∶1），80℃遮光水浴皂化30 min。冷卻至室溫后取35 mL皂化液，加入3 mL庚烷和1 mL蒸餾水搖勻，3 500 rpm條件下4℃離心5 min，再加入3 mL庚烷搖勻，3 500 rpm條件下4℃離心5 min，吸取1 mL上清液待檢測(cè)。β-胡蘿卜素含量用高效液相色譜儀來(lái)檢測(cè)。色譜條件：Agilent高效液相色譜儀；色譜柱：Inersil ODS-4；流動(dòng)相：90%甲醇+10%乙腈；流速：2 mL·min^-1；柱溫：45℃；檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm^[18]。

1.3.4 發(fā)酵產(chǎn)物的分離和測(cè)定 稱取20 g樣品加入80 mL蒸餾水，4℃浸提24 h后過(guò)濾得到浸提液。組分分離前，將C-18 SPE硅膠柱預(yù)處理：吸取6 mL 95%乙腈水溶液于C-18 SPE柱中，再吸取6 mL 5%乙腈水溶液于C-18 SPE柱中。吸取6 mL浸提液于C-18 SPE柱中，再加入6 mL 5%乙腈水溶液洗脫，吸取6 mL 95%乙腈水溶液于C-18 SPE柱中，再次洗脫。收集1 mL液體待檢測(cè)。

1.3.5 差異性物質(zhì)檢測(cè)方法 采用高效液相色譜儀檢測(cè)差異性物質(zhì)。色譜條件：Agilent高效液相色譜儀；色譜柱：Inertsil ODS-4；柱溫：45℃；流動(dòng)相：80%乙腈水溶液；流速：1 mL·min^-1；檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)為15 min，進(jìn)樣量為20 uL。

1.3.6 差異性物質(zhì)鑒定 采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)差異性物質(zhì)。色譜條件：Bruker 320-MS氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀；色譜柱為VP-ODS（250 mm×4.6 mm），載氣為氦氣，進(jìn)樣1 uL，1∶20分流比，進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測(cè)器溫度為320℃，掃描離子50～600 amu。升溫程序：50℃持續(xù)2 min，以20℃·min^-1升溫至240℃后持續(xù)2 min，再以1.5℃·min^-1速度升溫至320℃后持續(xù)15 min，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)為5 min。

1.3.7 β-胡蘿卜素?zé)晒鈴?qiáng)度測(cè)定 吸取200 uL溶液至96孔黑色酶標(biāo)板中，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，同一濃度三個(gè)重復(fù)。熒光強(qiáng)度采用酶標(biāo)儀（Infinte M200 pro型；瑞士TECAN公司）測(cè)定，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)486 nm、發(fā)射波長(zhǎng)516 nm，選擇頂部測(cè)量，選定孔中的樣品自動(dòng)計(jì)算Gain值，每孔讀取5次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 17.0（IBM SPSS 20. 0 for Windows）統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)和β-胡蘿卜素含量等指標(biāo)采用雙因素方差分析，對(duì)β-胡蘿卜素-乙腈溶液熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)其余混合溶液熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，并采用Tukey’s多重比較來(lái)分析數(shù)據(jù)平均值之間的差異，Plt;0.05，采用GraphPad軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿鮮樣化學(xué)成分

表1可知，青貯前紫花苜蓿鮮樣pH值為6.01，干物質(zhì)含量為279 g·kg^-1FW，β-胡蘿卜素含量為122 mg·kg^-1 DM，粗蛋白含量為229 g·kg^-1 DM，水溶性碳水化合物含量為84.3 g·kg^-1 DM，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量分別為346和231 g·kg^-1 DM。緩沖能較高，為594 mEq·kg^-1 DM。附著乳酸菌為3.40 lg cfu·g^-1 FW；好氧性細(xì)菌和酵母菌較多，數(shù)量超過(guò)5.00 lgcfu·g^-1 FW。

2.2 溫度與貯藏時(shí)間對(duì)紫花苜蓿青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)及β-胡蘿卜素的影響

表2可知，貯藏時(shí)間顯著影響了pH值、乙酸、丙酸、丁酸和β-胡蘿卜素含量（Plt;0.05），溫度顯著影響了pH值、丙酸和β-胡蘿卜素含量（Plt;0.05），溫度與貯藏時(shí)間的交互作用顯著影響了pH值、丙酸、丁酸和β-胡蘿卜素含量（Plt;0.05）。

在整個(gè)青貯過(guò)程中，與AT組相比，BT組pH值低（Plt;0.05），丁酸和β-胡蘿卜素含量高（Plt;0.05）。在AT和BT組中，隨著貯藏時(shí)間的增加，乳酸和乙酸含量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高（Plt;0.05）。在BT組中，丁酸含量和β-胡蘿卜素含量在貯藏70天后最高。

2.3 高效液相色譜結(jié)果分析

圖1可知，與AT組貯藏70天青貯飼料d2分離液相比，BT組貯藏70天青貯飼料d2分離液中的青貯發(fā)酵產(chǎn)物在第4.52和4.86分鐘呈現(xiàn)出兩個(gè)特異性色譜峰。

2.4 氣相色譜/質(zhì)譜結(jié)果分析

表3可知，相似度和相對(duì)含量最高的五種青貯發(fā)酵產(chǎn)物分別為：酪氨酸、香葉基香葉醇、金合歡醇、己酸和角鯊烯。其中角鯊烯相似度93.1%，相對(duì)含量28.6%。

2.5 β-胡蘿卜素溶液與角鯊烯溶液的熒光強(qiáng)度

圖2可知，不同濃度β-胡蘿卜素溶液間的熒光強(qiáng)度差異顯著（Plt;0.05），B濃度組和C濃度組熒光強(qiáng)度顯著高于A濃度組（Plt;0.05）。

2.6 β-胡蘿卜素-角鯊烯溶液的熒光強(qiáng)度

圖3可知，β-胡蘿卜素與角鯊烯濃度均顯著影響了混合液的熒光強(qiáng)度（Plt;0.05）。熒光強(qiáng)度均隨β-胡蘿卜素濃度上升而顯著提高（Plt;0.05）。A濃度組熒光強(qiáng)度隨角鯊烯濃度上升而顯著提高（Plt;0.05），并且其余濃度組熒光強(qiáng)度隨角鯊烯濃度上升而表現(xiàn)出升高趨勢(shì)。

2.7 混合有機(jī)酸對(duì)β-胡蘿卜素和角鯊烯混合溶液熒光強(qiáng)度的影響

表4可知，角鯊烯濃度顯著影響了所有β-胡蘿卜素濃度組熒光強(qiáng)度（Plt;0.05），混合有機(jī)酸濃度顯著影響了β-胡蘿卜素B和C濃度組的熒光強(qiáng)度（Plt;0.05），而角鯊烯濃度和混合有機(jī)酸濃度兩者之間的交互作用顯著影響了所有β-胡蘿卜素濃度組熒光強(qiáng)度（Plt;0.05）。當(dāng)β-胡蘿卜素濃度相同、混合有機(jī)酸種類也相同時(shí)，隨著角鯊烯濃度的提高，熒光強(qiáng)度上升。Ab、Bb、Bc及所有d濃度組熒光強(qiáng)度隨角鯊烯濃度上升而顯著提高（Plt;0.05），并且其余濃度組熒光強(qiáng)度隨角鯊烯濃度上升呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。BZ濃度組中，a和c濃度組熒光強(qiáng)度顯著低于b和d濃度組（Plt;0.05）。

3 討論

3.1 溫度和貯藏時(shí)間對(duì)青貯發(fā)酵品質(zhì)和β-胡蘿卜素含量的影響

溫度和貯藏時(shí)間是影響青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要因素^[19-20]。本試驗(yàn)中，雖然BT組乳酸含量在多數(shù)時(shí)間點(diǎn)比AT組高，但并未抑制丁酸發(fā)酵，丁酸含量高，發(fā)酵品質(zhì)比AT組差。這是由于梭菌在30℃的活性比3℃～20℃強(qiáng)，人們常常在30℃貯藏的青貯飼料中檢測(cè)到高含量的丁酸^[21-22]。另外，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，丁酸梭菌沒(méi)有呈現(xiàn)大幅度降解蛋白質(zhì)和增加氨態(tài)氮含量的現(xiàn)象，氨態(tài)氮含量保持在100～135 g·kg^-1 N，其原因可能是這些丁酸梭菌多數(shù)屬于只利用糖類型的梭菌，而不是既利用糖又降解蛋白質(zhì)的梭菌^[23]。

與紫花苜蓿原材料相比，所有處理組的β-胡蘿卜素含量均下降，這與Liu等^[10]的研究結(jié)果一致。BT組青貯70天時(shí)β-胡蘿卜素?fù)p失較少，其含量接近苜蓿原材料，原因可能青貯產(chǎn)生了某些發(fā)酵產(chǎn)物，抑制了β-胡蘿卜素^[10-12]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該青貯飼料中含有特異性色譜峰，且鑒定出了的五種青貯發(fā)酵產(chǎn)物，其中角鯊烯的相似度和相對(duì)含量最高，可能具有抑制β-胡蘿卜素?fù)p失的潛力。

角鯊烯分子式C₃₀H₅₀，為萜類化合物，具有多種生理活性。在代謝方面，角鯊烯不僅是合成甾醇、激素、維生素等復(fù)雜次級(jí)代謝產(chǎn)物的前體，而且能夠在微生物的好氧和厭氧發(fā)酵中作為碳源^[18]。因此，在青貯厭氧發(fā)酵過(guò)程中，作為微生物碳源之一，角鯊烯可能促進(jìn)了產(chǎn)β-胡蘿卜素微生物的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而降低了β-胡蘿卜素的損失。另外，許多抗氧化劑是類異戊二烯類物質(zhì)或具有類異戊二烯尾部，還有一部分具有抗氧化特性的化合物包括維生素A、D、E和β-胡蘿卜素都需要戊烯基才能合成。角鯊烯具有6個(gè)異戊二烯雙鍵結(jié)構(gòu)，能夠提高活性，清除自由基，抗氧化能力強(qiáng)^[24]，因此角鯊烯具有保護(hù)β-胡蘿卜素不被氧化，從而抑制其損失的潛能。一些乳酸菌、好氧性細(xì)菌、酵母菌和霉菌會(huì)降解β-胡蘿卜素，造成其損失^[25-26]。角鯊烯可作為殺菌劑使用，具有殺菌能力^[27]，可能對(duì)青貯發(fā)酵過(guò)程中的有害細(xì)菌產(chǎn)生影響，抑制其活性。

3.2 角鯊烯抑制β-胡蘿卜素?fù)p失的機(jī)理探究

β-胡蘿卜素溶液熒光強(qiáng)度隨其濃度上升逐漸提高^[28]，原因在于β-胡蘿卜素具有熒光基團(tuán)^[29]。不同濃度角鯊烯溶液的熒光強(qiáng)度無(wú)顯著差異，溶液熒光強(qiáng)度與角鯊烯濃度無(wú)關(guān)，其原因是角鯊烯沒(méi)有熒光吸收基團(tuán)。分子結(jié)構(gòu)是影響物質(zhì)熒光強(qiáng)度的重要因素，至少具有一個(gè)芳香基環(huán)或具有多個(gè)共軛雙鍵的有機(jī)化合物可產(chǎn)生熒光，稠環(huán)化合物可產(chǎn)生熒光，飽和的或只有一個(gè)雙鍵的化合物也可產(chǎn)生顯著的熒光，因此，乙腈、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、角鯊烯沒(méi)有熒光，可排除其對(duì)熒光強(qiáng)度產(chǎn)生影響。隨著角鯊烯添加量的提高，β-胡蘿卜素溶液的熒光強(qiáng)度均上升，原因可能是角鯊烯具有6個(gè)異戊二烯雙鍵結(jié)構(gòu)，能夠清除自由基，抑制了β-胡蘿卜素的氧化^[24]。β-胡蘿卜素與酪氨酸結(jié)合形成納米復(fù)合物后使β-胡蘿卜素?zé)晒饣鶊F(tuán)發(fā)生猝滅，熒光強(qiáng)度降低^[30]，這與本試驗(yàn)中添加角鯊烯后溶液熒光強(qiáng)度的變化結(jié)果不一致，原因在于角鯊烯未與β-胡蘿卜素結(jié)合形成復(fù)合物，首先吸收自由基，保護(hù)β-胡蘿卜素不被氧化。在模擬青貯飼料中不同比例混合的有機(jī)酸影響其保護(hù)β-胡蘿卜素效果試驗(yàn)中，β-胡蘿卜素濃度相同和混合有機(jī)酸比例不變時(shí)，隨著角鯊烯濃度的提高，熒光強(qiáng)度上升，說(shuō)明角鯊烯保護(hù)了β-胡蘿卜素不受青貯飼料中有機(jī)酸的破壞，其原因可能是角鯊烯與β-胡蘿卜素結(jié)合成的高活性混合物，降低了有機(jī)酸中氫離子對(duì)β-胡蘿卜素的攻擊。在BZ組中，a濃度組和c濃度組熒光強(qiáng)度顯著低于b濃度組和d濃度組；而且在所有β-胡蘿卜素濃度條件下，b濃度組和d濃度組熒光強(qiáng)度隨角鯊烯濃度上升而提高的程度均顯著高于a濃度組和c濃度組，說(shuō)明角鯊烯保護(hù)β-胡蘿卜素不受乙酸和丁酸破壞的效果優(yōu)于乳酸和丙酸，其原因可能與二者的碳原子數(shù)量和結(jié)構(gòu)有關(guān)。

4 結(jié)論

從β-胡蘿卜素?fù)p失低的紫花苜蓿青貯飼料中篩選出了抑制β-胡蘿卜素?fù)p失的青貯發(fā)酵產(chǎn)物—角鯊烯。角鯊烯能夠保護(hù)β-胡蘿卜素不被乳酸和揮發(fā)性脂肪酸破壞功能基團(tuán)，抑制了其在青貯過(guò)程中的損失，并且角鯊烯保護(hù)β-胡蘿卜素不受乙酸和丁酸破壞的效果優(yōu)于乳酸和丙酸。

參考文獻(xiàn)

[1] 張彩云，何立寧，高慶輝，等. 青貯飼料及其在奶牛養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 今日畜牧獸醫(yī)，2022，38（6）：9-10

[2] 呂仁龍，丁蘭蘭，李茂，等. β-胡蘿卜素在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2019，31（9）：8

[3] MOGENSEN L，KRISTENSEN T，SEGAARD K，et al. Alfa-tocopherol and beta-carotene in roughages and milk in organic dairy herds[J]. Livestock Science，2012，145（1-3）：44-54

[4] CHEN J，CHEN J，ZHANG Y，et al. Effects of maternal supplementation with fully oxidised β-carotene on the reproductive performance and immune response of sows，as well as the growth performance of nursing piglets[J]. British Journal of Nutrition，2021，125（1），62-70

[5] KALACˇ P. Carotenoids，ergosterol and tocopherols in fresh and preserved herbage and their transfer to bovine milk fat and adipose tissues：a review[J]. Journal of Agrobiology，2012，29（1）：1-13

[6] LIU Q H，SHAO T，BAI Y F. The effect of fibrolytic enzyme，Lactobacillus plantarum and two food antioxidants on the fermentation quality，alpha-tocopherol and beta-carotene of high moisture napier grass silage ensiled at different temperatures[J]. Animal Feed Science and Technology，2016，221：1-11

[7] XZA B，XSGA B，F(xiàn)HLA B，et al. Antioxidant，flavonoid，α-tocopherol，β-carotene，fatty acids，and fermentation profiles of alfalfa silage inoculated with novel lactiplantibacillus plantarum and pediococcus acidilactici strains with high-antioxidant activity[J]. Animal Feed Science and Technology，2022.115301

[8] 郝俊峰，于浩然，賈玉山，等. 青貯密度和青貯時(shí)間對(duì)紫花苜蓿發(fā)酵品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分的影響[J]. 草地學(xué)報(bào)，2022，30（9）：2492-2496

[9] 劉秦華，李湘玉，李君風(fēng)，等. 溫度和添加劑對(duì)象草青貯發(fā)酵品質(zhì)、α-生育酚和β-胡蘿卜素的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（7）：116-122

[10]LINDQVIST H，NADEAU E，JENSEN S K. Alpha-tocopherol and beta-carotene in legume-grass mixtures as influenced by wilting，ensiling and type of silage additive[J]. Grass Forage Science，2012，67（1）：119-128

[11]RENLONG L V，EL-SABAGH M，OBITSU T，et al. Effects of nitrogen fertilizer and harvesting stage on photosynthetic pigments and phytol contents of Italian ryegrass silage[J]. Animal Science Journal，2017，88（10）：1513-1522

[12]MOSELHY M A，BORBA J P，BORBA A E S. Improving the nutritive value，in vitro digestibility and aerobic stability of Hedychium gardnerianum silage through application of additives at ensiling time[J]. Animal Feed Science and Technology，2015，206：8-18

[13]NADEAU E，JOHANSSON B，JENSEN S K，et al. Vitamin content of forages as influenced by harvest and ensiling techniques[J]. Grassland Science in Europe，2004，9：891-893

[14]MüLLER C E，MOLLER J，JENSEN S K，et al. Tocopherol and carotenoid levels in baled silage and haylage in relation to horse requirements[J]. Animal Feed Science and Technology，2007，137：182-197

[15]CHEN L，GUO G，YU C，et al. The effects of replacement of whole-plant corn with oat and common vetch on the fermentation quality，chemical composition and aerobic stability of total mixed ration silage in Tibet[J]. Animal Science Journal，2015，86（1）：69-76

[16]劉秦華，張建國(guó)，盧小良. 乳酸菌添加劑對(duì)王草青貯發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（4）：7

[17]BRODERICK G A，KANG J H. Automated simultaneous determination of ammonia and total amino acids in ruminal fluid and in vitro media[J]. Journal of Dairy Science，1980，63（1）：64-75

[18]GHIMIRE G P，THUAN N H，KOIRALA N，et al. Advances in Biochemistry and Microbial Production of Squalene and Its Derivatives[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2016，26（3）：441-451

[19]柴繼寬，趙桂琴，琚澤亮. 添加不同乳酸菌對(duì)燕麥低溫青貯發(fā)酵的影響[J]. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（3）：923-928.

[20]陳三冬，鞏海強(qiáng)，尹國(guó)麗，等. 青貯玉米有氧暴露過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及細(xì)菌群落多樣性[J]. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（2）：388-395

[21]ZHANG J G，KAWAMOTO H，CAI Y M. Relationships between the addition rates of celluLase or glucose and silage fermentation at different temperatures[J]. Animal Science Journal，2010，81（3）：325-330

[22]LIU Q H，LI X Y，LI J F，et al. Effect of temperature and additives on fermentation and α-tocopherol and β-carotene content of Pennisetum purpureum silage[J]. Acta Prataculturae Sinica，2015，24（7）：116-12

[23]衡文，葉光斌，鄒偉. 酪丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁酸研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)調(diào)味品，2021（2）：186-190

[24]李頌，劉洋，王春玲. 角鯊烯的健康功效及應(yīng)用[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2016，37（14）：206-209

[25]PANDA S H，RAY R C. Lactic acid fermentation of beta-carotene rich sweet potato （Ipomoea batatas L.） into lactojuice[J]. Plant Foods for Human Nutrition，2007，62（2）：65-70

[26]ZORN H，LANGHOFF S，SCHEIBNER M，et al. Cleavage of β，β-carotene to flavor compounds by fungi[J]. Applied Microbiology Biotechnology，2003，62：331-336

[27]劉純友，馬美湖，靳國(guó)鋒，等. 角鯊烯及其生物活性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2015，15（5）：147-156

[28]AHMAD N，SALEEM M，MANZOOR B A，et al. Characterization of Desi Ghee Extracted by Different Methods Using Fluorescence Spectroscopy[J]. Journal of Fluorescence，2019，29（6）：1411-1421

[29]張怡欣，何勝華，唐海珊，等. β-胡蘿卜素/酪蛋白納米復(fù)合物的形成β-CE的生物利用率[J]. 食品工業(yè)科技，2016，37（5）：68-71

[30]MARTIN A，MATTEA F，GUTIERREZ L，et al. Co-precipitation of carotenoids and biopolymers with the supercritical antisolvent process[J]. Journal of Supercritical Fluids，2007，41：138-147

（責(zé)任編輯 彭露茜）