基于羅丹明B酰肼的化合物銅離子絡(luò)合能力測定的新方法

陳健敏, 朱丹虹, 蔡小真, 劉思彎

(莆田學(xué)院 1. 藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院; 2. 藥物分析與檢驗醫(yī)學(xué)福建省高校重點(diǎn)實驗室, 福建 莆田 351100)

銅是人體必需的微量元素之一,它在多種酶和蛋白質(zhì)的功能中發(fā)揮著重要的生理作用[1]。具體而言,銅離子作為酶的輔因子參與神經(jīng)遞質(zhì)生物合成、細(xì)胞呼吸、組織成熟和活性氧(ROS)清除等多種細(xì)胞過程[2]。與酶和肽結(jié)合的銅離子大多是人體必需的,而過剩的游離銅離子的累積會促進(jìn)ROS的生成,從而產(chǎn)生毒性[3],讓人患上神經(jīng)退行性疾病,包括Wilson病、Menkes綜合征、阿爾茨海默病和帕金森病等[4]。臨床上使用銅離子絡(luò)合劑是治療機(jī)體銅離子過?；蛘{(diào)節(jié)其失調(diào)的一種很有潛力的方法,但目前銅離子絡(luò)合劑只局限于Wilson病的治療[5]。臨床用于治療Wilson病的銅離子絡(luò)合劑只有D-青霉胺、三丁糖和四硫代鉬酸鹽3種[6],然而這些藥物會引起嚴(yán)重的副作用,如誘發(fā)免疫復(fù)合物腎炎、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、嚴(yán)重結(jié)腸炎、貧血和白細(xì)胞減少等[7-9]。因此,研究一種能夠測定化合物銅離子絡(luò)合能力的方法,用于篩選更加安全和有效的新型銅離子絡(luò)合劑具有必要性。

測定化合物銅離子絡(luò)合能力的方法一般都是基于銅離子的分析技術(shù)。近年來出現(xiàn)了許多檢測銅離子的分析技術(shù),包括離子選擇電極(ISE)、表面等離子體共振光譜(SPRS)、原子吸收光譜(AAS)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AE)和電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)[10-11]。但這些技術(shù)均需要復(fù)雜、精密的儀器來完成分析過程,不適合現(xiàn)場監(jiān)測和高通量檢測[12]。此外,這些技術(shù)大多只能測定總銅離子(結(jié)合型和游離型的銅離子)含量[13],而不能直接測定游離銅離子的含量,所以這些技術(shù)并不適合直接用于測定化合物銅離子絡(luò)合能力。因此,有待開發(fā)一種不需要復(fù)雜的精密儀器,就能直接檢測游離銅離子的檢測方法,以評估化合物銅離子絡(luò)合能力。

傳統(tǒng)的紫外-可見分光光度法用于測定化合物銅離子絡(luò)合能力簡單方便,主要是以鄰苯二酚紫(PV)為探針,檢測400～900 nm處的吸光度變化來評價化合物的絡(luò)合能力[14]。雖然目前大多數(shù)研究仍采用這種方法,但一些實驗因素易對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大影響,如反應(yīng)時間、反應(yīng)介質(zhì)的pH值和試劑的濃度等[15],導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。因此,本研究擬開發(fā)一種基于羅丹明B酰肼的測定化合物絡(luò)合能力的新方法,并優(yōu)化反應(yīng)條件,為神經(jīng)退行性疾病潛在藥物的篩選提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

羅丹明 B、水合肼、硫酸銅、楊梅素、曲酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、甲醇、乙二醇、正丙醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、異丙醇、甘油、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、1,2-丙二醇、乙腈、磷酸二氫鈉·二水、磷酸氫二鈉·十二水、N-(2-羥乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)鈉鹽、TRIS 鹽酸鹽、濃鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硝酸銅、醋酸銅、氯化銅、硫酸鐵、硫酸鈷·七水、硫酸鋁·十八水、硫酸鉻·水合、硫酸鋅、硫酸鉛、氯化鈉、硫酸鉀、氯化鎘·無水、硫酸鎳·六水合物、硫酸錳·一水、氯化汞(購于上海晶純生化科技股份有限公司)均為分析純或藥用級。

分析天平(上海卓精電子科技有限公司,BSM);紫外-可見分光光度計(日本津島,UV-2500);熒光-可見分光光度計(日本 Hitachi,IF-4600);核磁共振儀(德國布魯克,Bruker Avance 500);循環(huán)水式多用真空泵(鄭州特爾儀器設(shè)備有限公司,SHZ-D Ⅲ);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海央申科技儀器公司,RE-52);真空干燥箱(德國VACUUBRAND公司,MD 4C ND);數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,KQ2200DE);超純水發(fā)生器(德國賽多利斯,Milli-Q-Plus)。

1.2 研究方法

1.2.1 羅丹明B酰肼的合成

羅丹明B酰肼的合成參考文獻(xiàn)[16]中的方法并做一些調(diào)整。將2.22 g羅丹明B溶于30 mL乙醇中,在冰浴中攪拌30 min,加入10 mL水合肼(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%),溶液在60 ℃下冷凝回流,直至粉紅色消失。將溶液冷卻并倒入水中,用乙酸乙酯分別萃取3次,旋蒸除去溶劑,置于真空下干燥,得粉紅色固體1.54 g,產(chǎn)率69%。采用核磁共振分析確證,結(jié)果如下:1H NMR (DMSO-d6): δ, 1.07 (t, 12H, NCH2CH3), 3.32 (q, 8H, NCH2CH3), 4.27 (s, 2H, NH2), 6.32-6.37 (d, 6H, xanthene-H), 6.98 (m, 1H, ArH), 7.45 (m, 2H, ArH), 7.76 (m, 1H, ArH)。確認(rèn)所得產(chǎn)物為羅丹明B酰肼,合成路線和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 羅丹明B酰肼的合成路線Figure 1 Synthetic scheme of rhodamine B hydrazide

圖2 分析方法與設(shè)計原理Figure 2 Schematic of the analytical method and principle

1.2.2 化合物銅離子絡(luò)合能力測定步驟與設(shè)計原理

采用羅丹明B酰肼作為探針檢測銅離子的方法已有報道[16],原理是銅離子能夠誘導(dǎo)羅丹明B酰肼水解,生成羅丹明B而使溶液即刻呈現(xiàn)粉紅色和熒光特征。因此,本研究假設(shè)誘導(dǎo)羅丹明B酰肼的銅離子只能為游離銅離子,那么在反應(yīng)介質(zhì)中加入待測化合物,與部分銅離子形成絡(luò)合物,只有剩余的游離銅離子能與羅丹明B酰肼反應(yīng);該化合物的絡(luò)合能力越強(qiáng),剩余的游離銅離子越少,生成的羅丹明B就越少,溶液顏色就越淺,儀器檢測的信號就越弱。這樣就可以通過檢測溶液的顏色或吸光度的變化來測定被測化合物的銅離子絡(luò)合能力。

1.2.3 銅離子分析方法的優(yōu)化

因化合物銅離子絡(luò)合能力測定方法是基于銅離子分析方法,所以先對銅離子分析方法進(jìn)行優(yōu)化。為獲得最佳分析條件,研究了溶劑、羅丹明B酰肼濃度、銅離子濃度及來源、pH值、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度對分析方法性能的影響。實驗條件:取100 μL銅離子溶液(10 mmol/L)置于試管中,并將1 mL羅丹明B酰肼溶液(使用乙腈作為溶劑)和1 mL水加入試管中充分混合;溶液反應(yīng)一定時間后,在400～800 nm波長范圍內(nèi)記錄紫外-可見光譜。特殊實驗條件將在結(jié)果與討論中體現(xiàn)。

1.2.4 化合物銅離子絡(luò)合能力測定方法

得到銅離子分析方法的最佳條件后,便可設(shè)計測定化合物的銅離子絡(luò)合能力的方法與步驟。將100 μL待測化合物(sample)與100 μL銅離子溶液(2 mmol/L)混合并反應(yīng)10 min。然后向混合物中加入1 mL羅丹明B酰肼溶液(2 mmol/L,乙腈為溶劑)和1 mL水,充分混勻。所得溶液反應(yīng)一定時間后,記錄溶液的紫外-可見吸光度(D557 nm)。以溶解待測化合物的溶劑作為空白對照(control)代替待測化合物溶液,按上述步驟操作。銅離子絡(luò)合能力(%)可根據(jù)以下公式計算:

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溶劑與緩沖溶液對測定方法的影響

為了選擇最佳的反應(yīng)溶劑,考察不同溶劑(甲醇、乙二醇、正丙醇、DMF、異丙醇、甘油、乙醇、DMSO、1,2-丙二醇和乙腈)對分析方法的影響。在考察不同溶劑的影響時,羅丹明B酰肼溶液的濃度始終保持1 mmol/L不變。首先,溶劑不能影響羅丹明B的紫外-可見吸收,且溶劑自身不能使羅丹明B酰肼水解,因此記錄各溶劑溶解羅丹明B酰肼后的紫外-可見光譜,結(jié)果如圖3A所示。除了乙二醇(ethylene glycol)外,其他溶劑在400～800 nm波長范圍內(nèi)均無明顯吸收,不干擾生成的羅丹明B信號的檢測。上述結(jié)果表明,除乙二醇外,羅丹明B酰肼在所有試驗溶劑中均穩(wěn)定。當(dāng)在這些溶液中加入銅離子,水解羅丹明B的信號強(qiáng)弱如圖3B所示。雖然不同溶劑可引起吸光度的變化,但羅丹明B的峰值波長基本維持在557 nm,因此其可作為紫外-可見信號的檢測波長。乙腈(acetonitrile)作為溶劑時,產(chǎn)生的吸光度最大,是甘油(glycerol)的2倍多,說明乙腈最有利于羅丹明B酰肼的水解;反應(yīng)后產(chǎn)生的吸光度越高,方法的靈敏度越高。因此,確定乙腈作為羅丹明B酰肼的溶劑。

A.不同溶劑中羅丹明B酰肼自身水解;B.不同溶劑中銅離子誘導(dǎo)羅丹明B酰肼水解;C.不同緩沖溶液中羅丹明B酰肼自身水解;D.不同緩沖溶液中銅離子誘導(dǎo)羅丹明B酰肼水解A. Spontaneous hydrolysis of rhodamine B hydrazide in different solvents; B. Copper ion-catalyzed hydrolysis of rhodamine B hydrazide in different solvents; C. Spontaneous hydrolysis of rhodamine B hydrazide in different buffer solutions; D. Copper ion-catalyzed hydrolysis of rhodamine B hydrazide in different buffer solutions.圖3 不同溶劑和緩沖溶液中羅丹明B酰肼的自發(fā)水解和銅離子誘導(dǎo)水解Figure 3 Spontaneous hydrolysis and copper ion-induced hydrolysis of rhodamine B hydrazide in different solvents and buffer solutions

硫酸銅為離子化合物,所以無法使用純乙腈作為溶劑。因此,考察水和不同緩沖溶液體系(HEPES、PBS和Tris-HCl)對羅丹明B酰肼水解的影響,結(jié)果如圖3C(體系不加銅離子)和3D(體系加入銅離子)所示。從圖3C可以看出,在Tris-HCl緩沖體系下,羅丹明B酰肼不穩(wěn)定,自身發(fā)生了水解,因此不能選擇該緩沖體系;而水、HEPES和PBS體系下羅丹明B較為穩(wěn)定,幾乎沒有發(fā)生自身水解的現(xiàn)象。圖3D結(jié)果顯示,在羅丹明B的特征峰557 nm處,水比其他3種緩沖溶液體系的信號更強(qiáng)。結(jié)合以上實驗結(jié)果,同時考慮檢測方法的成本、簡便和環(huán)保等因素,最終確定水作為硫酸銅的溶劑。因此,結(jié)合前面溶劑試驗結(jié)果,確定了本研究的檢測方法采用水-乙腈混合溶劑體系。

2.2 水相pH值對測定方法的影響

通過加入少量的HCl或NaOH(0.1 mol/L)獲得不同pH值的水相,考察了水相pH值對羅丹明B酰肼水解的影響,結(jié)果如圖4所示。圖4A顯示了在不同pH值下,羅丹明B酰肼自身水解情況。酸性條件下,羅丹明B酰肼大量水解,pH值越小水解程度越高;堿性條件下,羅丹明B酰肼少量水解,也呈現(xiàn)pH值越大水解程度越高的規(guī)律;在pH中性條件下,羅丹明B酰肼最穩(wěn)定,幾乎沒有發(fā)生自身水解的現(xiàn)象。有研究表明,酰肼的水解隨著pH值的降低而逐漸增加,而在中性介質(zhì)中未觀察到可測量水解情況[18],與本實驗研究結(jié)果相符。不僅如此,本實驗研究同時發(fā)現(xiàn)pH值高于7也在一定程度促進(jìn)了酰肼的水解。以上研究結(jié)果表明羅丹明B酰肼在酸性或堿性溶液中均不穩(wěn)定。進(jìn)一步考察了不同pH值條件下,加入銅離子誘導(dǎo)羅丹明B酰肼水解的情況,結(jié)果如圖4B所示,表明銅離子在中性和弱酸性介質(zhì)中比其他pH值下更能明顯誘導(dǎo)羅丹明B酰肼的水解,在綜合考慮檢測方法的簡易程度后,確定了實驗pH值為7.0。

A.不同pH條件下羅丹明B酰肼自發(fā)水解反應(yīng)的變化規(guī)律;B.不同pH條件下銅離子誘導(dǎo)羅丹明B酰肼水解反應(yīng)速率的變化趨勢A.Under different pH conditions, the pattern of spontaneous hydrolysis of rhodamine B hydrazide molecules changes; B. Under different pH conditions, the rate of copper ion-catalyzed hydrolysis of rhodamine B hydrazide shows a changing trend.圖4 pH值對羅丹明B酰肼自發(fā)水解和銅離子誘導(dǎo)水解的影響Figure 4 Effect of pH on spontaneous hydrolysis and copper ion induced hydrolysis of rhodamine B hydrazide

2.3 反應(yīng)時間與溫度對測定方法的影響

考察了不同反應(yīng)時間(1、3、5、7、10、15、20、25和30 min)對羅丹明B酰肼水解程度的影響。于設(shè)定的不同時間,記錄反應(yīng)溶液在557 nm波長處的吸光度,繪制時間-吸光度曲線,如圖5A所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn),銅離子與羅丹明B酰肼反應(yīng)十分迅速,在1 min時吸光度接近0.8,隨后3、5和7 min內(nèi)吸光度緩慢增加,到10 min后基本達(dá)到最大值,再隨著時間的延長,吸光度沒有明顯變化。這一結(jié)果與現(xiàn)有的報道一致[17-18],銅離子可高效的促進(jìn)酰肼進(jìn)行不可逆的水解反應(yīng)。因此,綜合考慮信號穩(wěn)定和方法的簡易性,本研究方法確定反應(yīng)時間為10 min?？疾炝瞬煌磻?yīng)溫度(15、25、37和50 ℃)對羅丹明B酰肼水解程度的影響,結(jié)果如圖5B所示,發(fā)現(xiàn)在15～50 ℃范圍內(nèi)溫度對方法的影響不顯著,考慮到方法的簡易性,將反應(yīng)溫度設(shè)為室溫(25 ℃)。

A:反應(yīng)時間對銅離子誘導(dǎo)羅丹明B酰肼水解的影響;B:溫度對銅離子誘導(dǎo)羅丹明B酰肼水解的影響A: The effects of reaction time on the copper ion-catalyzed hydrolysis of rhodamine B hydrazide; B: temperature on the copper ion-catalyzed hydrolysis of rhodamine B hydrazide圖5 反應(yīng)條件對銅離子誘導(dǎo)羅丹明B酰肼水解的影響Figure 5 Effect of reaction conditions on the copper ion-induced hydrolysis of rhodamine B hydrazide

2.4 試劑濃度對測定方法的影響

研究了銅離子和羅丹明B酰肼濃度對分析方法的影響,記錄反應(yīng)溶液在400～800 nm的紫外-可見光譜,結(jié)果如圖6所示。圖6A表明,反應(yīng)溶液的吸光度隨著銅離子濃度的增加而增加;當(dāng)銅離子濃度達(dá)到10 mmol/L時,在557 nm處的吸光度為3.025;銅離子濃度為2 mmol/L時,吸光度則為0.92。當(dāng)吸光度高于1時,濃度與吸光度的關(guān)系將偏離Lambert Beer定律[19]。因此,本分析方法確定銅離子濃度為2 mmol/L。羅丹明B酰肼濃度對分析方法的影響如圖6B所示。反應(yīng)溶液的吸光度與羅丹明B酰肼濃度呈正相關(guān),羅丹明B酰肼濃度在4 mmol/L時在557 nm處的吸光度為1.031,而在2 mmol/L時為0.825。因此,出于同樣的考慮,確定羅丹明B酰肼的濃度為2 mmol/L。

A.不同濃度銅離子的吸光度變化;B.不同濃度羅丹明B酰肼的吸光度變化A. Absorbance changes of copper ion at different concentrations; B. Absorbance changes of Rhodamine B hydrazide at different concentrations.圖6 銅離子和羅丹明B酰肼不同濃度下的吸光度Figure 6 Absorbance of copper ion and rhodamine B hydrazide at varying concentrations

2.5 銅離子源及其他金屬離子對測定方法的影響

考察不同銅離子的來源(濃度均為2 mmol/L)對羅丹明B酰肼水解的影響,結(jié)果見圖7A。發(fā)現(xiàn)不同的銅離子來源對誘導(dǎo)羅丹明B酰肼的水解有一定的影響,以羅丹明B特征吸收峰557 nm作為判斷依據(jù),誘導(dǎo)能力依次為硫酸銅(cupric sulfate)>硝酸銅(cupric nitrate)>醋酸銅(cupric acetate)>氯化銅(cupric chloride),結(jié)果表明硫酸銅更適合于該分析方法。同時還考察了其他12種金屬離子(濃度均為2 mmol/L)對羅丹明B酰肼水解的情況(圖7B)。結(jié)果表明,大部分金屬離子不能誘導(dǎo)羅丹明B酰肼的水解。能夠誘導(dǎo)的金屬離子的水解能力依次為Fe3+>Hg2+>Al3+>Cu2+>Cr2+。這表明本研究建立的方法同樣可用于測試化合物與這些金屬離子的絡(luò)合能力。另外,當(dāng)測試過程中混入這些金屬離子,也會對此方法的分析測試結(jié)果產(chǎn)生影響。

A.不同銅離子源對羅丹明B酰肼水解的影響;B.不同金屬離子對羅丹明B酰肼水解的影響A. Effect of different copper ion sources on the hydrolysis of rhodamine B hydrazide; B. Effect of different metal ions on the hydrolysis of rhodamine B hydrazide圖7 不同金屬離子誘導(dǎo)羅丹明B酰肼水解的比較Figure 7 Comparation on the hydrolysis of Rhodamine B hydrazide induced by different metal ions

2.6 測定方法的可行性驗證

為了驗證該分析方法的可行性,選擇了常見的銅離子絡(luò)合劑曲酸(kojic acid)和EDTA作為模型化合物。利用該方法測試不同濃度的曲酸(0～20 mmol/L)和EDTA(0～20 mmol/L)的銅離子絡(luò)合能力,結(jié)果見圖8A和8B。從圖8A可以看出,557 nm處的吸光度隨著曲酸濃度的增加而逐漸降低,表明曲酸對銅離子的絡(luò)合作用導(dǎo)致促進(jìn)羅丹明B酰肼水解的游離銅離子數(shù)量減少。同樣隨著EDTA濃度的增大,557 nm處的吸光度也呈現(xiàn)下降趨勢,而且下降程度比曲酸更大(圖8B)。結(jié)果表明,在相同濃度下EDTA對銅離子的絡(luò)合強(qiáng)度更大,使得游離銅離子數(shù)量減少更多,表明EDTA對銅離子的絡(luò)合能力強(qiáng)于曲酸。根據(jù)方法部分提及的公式可計算銅離子絡(luò)合能力(%),進(jìn)而繪制得到絡(luò)合能力-濃度曲線,如圖8C和8D所示。對曲線進(jìn)行擬合后,可計算得到引起50%最大效應(yīng)的化合物濃度(EC50)。曲酸和EDTA的EC50值分別為11.92和1.11 mmol/L,表明EDTA對銅離子的絡(luò)合能力是曲酸的10倍多。上述結(jié)果表明,該分析方法能夠有效定量測定并比較化合物的銅離子絡(luò)合能力。

2.7 楊梅素的銅離子絡(luò)合能力測定

楊梅素(myricetin)是一種黃酮醇類化合物,主要存在于楊梅、山茶等植物中,具有抗氧化、抗衰老等生理活性,對預(yù)防神經(jīng)退行性疾病也有一定的作用[20-21]。體內(nèi)銅離子過剩容易引起神經(jīng)退行性疾病,因此研究楊梅素是否具有絡(luò)合銅離子的特性,以探究其是否能夠在預(yù)防神經(jīng)退行性疾病方面發(fā)揮作用。采用上述分析方法對楊梅素的銅離子絡(luò)合能力進(jìn)行測定,結(jié)果見圖9。首先記錄楊梅素與羅丹明B酰肼混合體系的紫外光譜圖,考察楊梅素是否使羅丹明B酰肼水解,及楊梅素是否在羅丹明B紫外可見吸收處有吸收(如有,可設(shè)計空白實驗給予校正);結(jié)果如圖9A所示,楊梅素本身不會使羅丹明B酰肼水解,而且在相關(guān)波長范圍內(nèi)無紫外吸收,因此不干擾測定。楊梅素絡(luò)合能力的測試結(jié)果如圖9B所示,在557 nm處的吸光度隨著楊梅素濃度的增加而有所降低,但楊梅素濃度大于1.25 mmol/L后,吸光度變化趨于平穩(wěn),證明楊梅素絡(luò)合銅離子已達(dá)到飽和,濃度的進(jìn)一步提高無法再提高絡(luò)合能力。將絡(luò)合能力-濃度曲線進(jìn)行擬合后,可計算得到楊梅素EC50值0.89 mmol/L,表明其絡(luò)合銅離子的能力比EDTA(1.11 mmol/L)更強(qiáng)。結(jié)果表明,楊梅素對預(yù)防神經(jīng)退行性疾病有一定的作用。通過對楊梅素的銅離子絡(luò)合能力的測定分析,進(jìn)一步證明了該分析方法能夠有效地用于評價化合物的銅離子絡(luò)合能力。

A:不同濃度的曲酸對銅離子的絡(luò)合作用;B:不同濃度的EDTA對銅離子的絡(luò)合作用;C:曲酸與銅離子絡(luò)合能力關(guān)系;D:EDTA與銅離子絡(luò)合能力關(guān)系A(chǔ): The complexing effect of kojic acid at different concentrations on copper ion; B: The complexing effect of EDTA at different concentrations on copper ion; C: Relationship between kojic acid and copper ion complexing ability; D: Relationship between EDTA and copper ion complexing ability圖8 曲酸與EDTA絡(luò)合銅離子能力的比較Figure 8 A comparison of the copper ion complexing abilities of kojic acid and EDTA

A:楊梅素與羅丹明B酰肼混合液的吸收光譜;B:楊梅素對銅離子誘導(dǎo)羅丹明B酰肼水解的影響A: Absorption spectra of myricetin mixed with rhodamine B hydrazide solutions; B: Effect of myricetin on the copper ions induced hydrolysis of rhodamine B hydrazide圖9 楊梅素對羅丹明B酰肼及其銅離子誘導(dǎo)水解的影響Figure 9 The effect of myricetin on rhodamine B hydrazide and its copper ion-induced hydrolysis

3 討論

本研究提出一種以羅丹明B酰肼和銅離子為探針,測定化合物絡(luò)合銅離子能力的方法,對影響分析方法的各種實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化,最終確定分析的最佳條件如下:反應(yīng)體系采用乙腈和水體積比1∶1混合溶劑,pH=7,銅離子及羅丹明B酰肼的濃度均為2 mmol/L,反應(yīng)時間為10 min,反應(yīng)溫度為25℃,體系中應(yīng)避免混入Fe3+,Hg2+,Al3+和Cr2+。以典型的銅離子絡(luò)合劑曲酸和EDTA作為模型化合物,證明了該分析方法的可行性。在此基礎(chǔ)上,又利用該方法對楊梅素預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)楊梅素的銅離子絡(luò)合能力高于EDTA,表明其有可能通過清除體內(nèi)過剩的銅離子而起到預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的作用。

理論上,EDTA為六齒配體,與銅離子形成較穩(wěn)定的六齒鋸齒構(gòu)型的六配位配合物;曲酸為五齒配體,與銅離子形成比較穩(wěn)定的五齒鋸齒構(gòu)型的五配位配合物;而楊梅素分子中含有鄰位羥基,能與銅離子形成較穩(wěn)定的四配位平面構(gòu)型配合物。根據(jù)配位數(shù)與配合物構(gòu)型的差異,3種配體與銅離子的絡(luò)合能力順序應(yīng)為EDTA>曲酸>楊梅素。

然而,本研究結(jié)果卻顯示楊梅素的銅離子絡(luò)合能力高于EDTA,這似乎與理論預(yù)測相反?？赡苁且驗闂蠲匪胤肿咏Y(jié)構(gòu)中除鄰位羥基外,還含有5個羥基,這些羥基可以通過氫鍵等與水分子及其他小分子相互作用,這有利于楊梅素與體內(nèi)其他配位體的相互作用,增強(qiáng)其與銅離子的絡(luò)合能力。不過,楊梅素表現(xiàn)出更高銅離子絡(luò)合能力的真正原因,還需要進(jìn)一步探究。

綜上,本研究所開發(fā)的測定化合物銅離子絡(luò)合能力的方法簡單實用,能用于篩選銅離子絡(luò)合劑并探索治療神經(jīng)退行性疾病藥物作用機(jī)制的研究。

作者貢獻(xiàn)聲明

陳健敏:負(fù)責(zé)研究設(shè)計、數(shù)據(jù)分析及論文撰寫;朱丹虹:參與實驗操作及論文修改;蔡小真、劉思彎:完成實驗操作及結(jié)果分析。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。