AAMDC激活mTOR通路促進肝細胞癌轉(zhuǎn)移

周宣辰, 胡麗玲, 李鈺瑩, 石富金, 鄭丹丹, 施心雨, 張志毅, 孟坤,3*, 田秋紅*

(1. 南昌大學 第一附屬醫(yī)院 腫瘤科, 江西 南昌 330006; 2. 暨南大學 生命科學技術(shù)學院,腫瘤分子生物學教育部重點實驗室, 廣東 廣州 510632; 3. 暨南大學 附屬第一醫(yī)院 科研科, 廣東 廣州 510630)

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是人類最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率高居癌癥死亡第三[1]。Global Cancer Observatory數(shù)據(jù)顯示,2020年全球肝癌新發(fā)病例數(shù)為905 677和410 038, 死亡病例數(shù)為830 180和391 152。在我國60歲以下男性中,肝癌是發(fā)病率最高的癌癥類型,嚴重威脅國人的健康[2]。臨床上80%以上原發(fā)性肝癌是肝細胞性肝癌。由于HCC的高復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率,患者的預后較差,五年生存率不足20%。且其早期癥狀隱匿導致多數(shù)患者確診時已發(fā)展為遠端轉(zhuǎn)移,錯過了最佳治療時機,因此探索肝癌的發(fā)生、發(fā)展機制為肝癌診斷和治療提供分子標記物和靶點具有重要的臨床意義。

脂肪形成相關(guān)Mth938結(jié)構(gòu)域蛋白(AAMDC),又名C11orf67、PTD015,該基因位于11號染色體,編碼由122個氨基酸組成的蛋白質(zhì),目前還未有文獻明確報道其生物學功能。針對AAMDC的早期研究結(jié)果顯示,該蛋白可能參與脂肪形成過程,并且參與多個代謝調(diào)控環(huán)節(jié)。已有研究表明,AAMDC作為癌基因,促進了雌激素受體陽性乳腺癌的進展[3]。同時在另一項研究中顯示,龍葵堿的抑癌作用與阻斷AAMDC/MYC/ATF4/Sesn2介導的自噬途徑相關(guān),并且AAMDC的過表達能夠逆轉(zhuǎn)龍葵堿對自噬和胃癌的抑制作用[4]。

目前尚未有AAMDC在HCC中的相關(guān)研究?；谝陨闲畔?本課題組前期查閱了相關(guān)數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)在HCC樣本中AAMDC與多個臨床指標高度相關(guān),本研究旨在以AAMDC為研究對象,采用蛋白質(zhì)相互作用組學及轉(zhuǎn)錄組學的技術(shù)方法揭示其生物學功能的分子機制,以及其在HCC中的細胞器定位和表達水平,探討AAMDC對HCC細胞遷移、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 細胞株

人正常肝細胞L02,人肝細胞癌細胞系Huh7、HepG2、HCCLM3、PLC8024、SNU387由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基(# C11995500BT)、RPMI培養(yǎng)基(#C11875500BT)、Opti-MEM培養(yǎng)基(#31985070)、磷酸鹽緩沖液(#C10010500BT)、0.25 %胰蛋白酶(#2520056)、胎牛血清(#A3160802)均購自美國Gibco公司;細胞凍存管(#375418PK)和Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(#L3000008)均購自美國Thermo Scientific公司;Transwell小室(#353097)、Transwell 24孔板(#353034)和Matrigel膠(#356234)均購自美國Corning公司;AAMDC抗體(NBP2-34040)購自美國Novus Biologicals公司;PVDF膜(#SLHVR33RB)購自美國Millipore公司;山羊抗兔二抗、免疫熒光二抗、IP裂解液(#P0013J)、DAPI(#C1002)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;mTOR抗體(#2983)、p-mTOR抗體(#5536)、β-actin抗體(#4970S)和Tubulin抗體(#2146S)均購自美國Cell Signaling Technology公司;熒光定量PCR試劑盒(#11201ES08)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(#11123ES60)和無核酶水(#10601ES76)均購自上海翌圣生物科技股份有限公司;氯仿(#GD10)、異丙醇(#HC16)、無水甲醇(#SA01)和無水乙醇(#HB15)均購自廣州化學試劑廠;EDTA修復液(#ZLI-9067)、免疫組化二抗(#PV-6000)、免疫組化筆(#ZLI-9305)、Triton-X 100(#ZLI-9308)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Rapamycin(#AY-22989)購自美國Selleck生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

移液器(德國Eppendorf公司);PCR儀(蘇州東勝興業(yè)科技有限公司);-80 ℃冰箱和冷凍離心機(美國Thermo Scientific公司);細胞培養(yǎng)箱(上海普和希健康醫(yī)療器械有限公司);普通倒置顯微鏡(浙江舜宇光學科技有限公司);生物安全柜(上海力康公司);Western blot電泳套裝(美國Bio-Rad公司);恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);水平搖床(其林貝爾TS-200)。

1.2 研究方法

1.2.1 生物信息學分析

本研究采用的生物信息學分析的數(shù)據(jù)庫主要包括:GTEx(https://gtexportal.org/home/);The human protein atlas數(shù)據(jù)庫(HPA,https://www.proteinatlas.org/);Gene expression profiling interactive analysis數(shù)據(jù)庫(GEPIA2,http://gepia2.cancer-pku.cn/#index);The cancer genome atlas數(shù)據(jù)庫(TCGA,https://www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Cancer-Genome-Atlas)。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

L02和SNU387使用RPMI1640+10%胎牛血清+1%青/鏈霉素培養(yǎng),Huh7、HepG2、HCCLM3、PLC8024用高糖DMEM+10%胎牛血清 +1%青/鏈霉素培養(yǎng)。

1.2.3 免疫組織化學實驗

石蠟切片65 ℃烘箱中烤片4 h;將切片放入含有環(huán)保透明劑的缸中進行脫蠟,依次放入無水乙醇以及95%、80%、50%的乙醇和蒸餾水中各1 min;將切片置于pH 8.0的EDTA修復液中,用微波爐中高火和中火加熱各5 min。微波修復結(jié)束后,等待切片冷卻至室溫;用免疫組化筆在組織周圍畫圈,滴加H2O2孵育50 min,在4缸PBST中依次漂洗。甩干PBST后使用封閉液封閉1 h,并清洗。滴加AAMDC一抗工作液(體積比為1∶200),放入4 ℃冰箱孵育過夜,清洗4次,滴加二抗于37 ℃孵箱孵育20 min,使用PBST清洗二抗。滴加DAB顯色,蘇木素復染10 s,流水沖洗,鹽酸乙醇分化3 s后蒸餾水水洗,將切片放入烘箱65 ℃,封片,鏡檢評分。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測

提取細胞總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過熒光定量PCR檢測AAMDC的相對表達。AAMDC的上游引物序列為:5’-TCAGGTGTTCATGTCAGGGC-3’, 下游引物序列為:5’-AGGTGACTCATTGCCAGCTC-3’。β-actin的上游引物序列為:5’-ACGTGGACAT-CCGCAAAG-3’, 下游引物序列為:5’-GACTCGTCATACTCC-TGCTTG-3’。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗

制備樣品,使用SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用5%的牛奶室溫封閉1.5 h,敷上一抗置于4 ℃水平搖床上過夜孵育。TBST清洗3次,每次10 min。清洗完后二抗室溫下孵育1～2 h;TBST洗膜3次,每次10 min。將ECL發(fā)光液的A液與B液等體積混合置于避光EP管中。將PVDF膜放入顯影儀中,加入適量顯影液,進行曝光。

1.2.6 免疫熒光

將細胞鋪板在共聚焦培養(yǎng)皿,培養(yǎng)過夜。PBS清洗兩遍,加入4%的多聚甲醛固定細胞。 PBS 清洗3次,加入0.2% Triton-X的PBS常溫靜置透化細胞10 min,棄去透化液,用PBS清洗細胞3次,每次5 min。使用5% BSA于室溫封閉1 h,加入200 μL一抗,4 ℃孵育過夜。用PBST清洗細胞3次,每孔加入200 μL二抗,室溫避光孵育1 h。加入DAPI溶液 200 μL,室溫避光孵育10 min;激光共聚焦觀察并拍照。

1.2.7 Transwell實驗

在24孔板下室加入600 μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基,將小室放入Transwell孔板上,消化細胞,用PBS清洗2遍,無血清培養(yǎng)基重懸。細胞計數(shù)后,取15萬細胞加入小室的上室(侵襲實驗需要提前在每個小室上室中央垂直懸空加入基質(zhì)膠100 μL)。到達觀測時間后取出小室,使用甲醇固定30 min,結(jié)晶紫染色20 min后使用純水清洗小室并用棉簽擦拭小室的上室,晾干。使用顯微鏡拍照,ImageJ等軟件進行計數(shù)。

1.2.8 免疫共沉淀

預冷的PBS清洗細胞2次,加入1 mL的IP裂解液。轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中裂解細胞;在4 ℃,12 000 g條件下離心,將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中并置于冰上。取1 mg蛋白加入1.5 μg抗體,另一組加入1.5 μg IgG;4 ℃旋轉(zhuǎn)儀上緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過夜;次日加入40 μL Protein A/G瓊脂糖珠捕獲抗原抗體復合物,4 ℃條件下緩慢旋轉(zhuǎn)孵育4 h。在4 ℃,2 500 r/min條件下離心5 min,去除上清,用預冷的PBS清洗復合物3遍,每次加入500 μL;最后一次吸干凈液體,加50 μL裂解液,到上述沉淀中并混勻;將樣品煮沸后收集上清進行蛋白質(zhì)電泳。

1.2.9 銀染

將膠條放入盛有固定液的容器中,置于水平搖床孵育過夜;倒掉固定液,加入敏化液室溫下放置30 min;倒掉敏化液,加入H2O放于水平搖床清洗3次,每次10 min。棄掉H2O后避光加入銀染液,置于搖床上避光銀染30 min;倒掉銀染液,用H2O清洗膠條3次,每次30 s。清洗結(jié)束后加入顯色液,觀察膠條的顯色情況;待膠條的條帶清晰可見時,倒掉顯色液,并加入終止液終止10 min;用H2O清洗膠條,去除過多的銀離子,然后掃膠備用。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 AAMDC在泛癌中表達的生物信息學分析

為了探索泛癌中AAMDC在腫瘤組織和癌旁組織中的表達情況,分析了GEPIA2數(shù)據(jù)庫中AAMDC的表達水平,結(jié)果顯示AAMDC在彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC)、多形成膠質(zhì)細胞瘤(GBM)、腦低級別膠質(zhì)瘤(LGG)、肝細胞癌(HCC)、胰腺癌(PAAD)及胸腺癌(THYM)等腫瘤組織顯著高表達,而在急性髓細胞樣白血病(LAML)和睪丸癌(TGCT)腫瘤組織中表達顯著降低(圖1A)。隨后對AAMDC在泛癌中的表達量和腫瘤患者的預后進行分析,結(jié)果顯示AAMDC的高表達水平與腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)、腎嫌色細胞癌(KICH)患者總生存期縮短相關(guān),而與腎透明細胞癌(KIRC)以及LGG患者總生存期延長相關(guān)(圖1B-F)。無疾病生存分析結(jié)果顯示,AAMDC與腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)、HCC及肺鱗癌(LUSC)患者無疾病生存期縮短相關(guān)(圖1G-J)。綜上,AAMDC在多個癌癥類型中表達失調(diào),并與腫瘤患者的生存時間密切相關(guān),提示其可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展,可作為潛在的預后因子指導腫瘤患者的診斷和治療。本研究關(guān)注到AAMDC在HCC患者的腫瘤組織中表達異常升高,且和HCC患者的總生存預后以及無疾病生存期密切相關(guān),提示AAMDC參與HCC的發(fā)生發(fā)展。

A: AAMDC在多種腫瘤和癌旁中組織的差異表達; T為腫瘤組織,N為癌旁中組織。1)P<0.05; B: AAMDC的表達和泛癌的預后相關(guān)性熱圖,高亮部分表示AAMDC表達可以作為預后預測癌種;C-F:AAMDC的表達和預后可預測癌種腫瘤患者的預后生存圖;G: AAMDC的表達和泛癌的無疾病生存期相關(guān)性熱圖,高亮部分表示AAMDC表達可以作為無疾病生存期的預測癌種;H-J:AAMDC的表達和生存期可預測腫瘤患者的無病生存預后生存圖。A: AAMDC is expressed differently in a variety of tumors and adjacent para-cancerous tissue; T: tumor, N:non-tumor. 1)P<0.05. B: Heat map of the prognostic correlation between AAMDC expression and pan-carcinoma, and the highlighted part indicates that AAMDC expression can be used as a prognostic predictor; C-F: Survival plot of the association between AAMDC expression and prognosis in tumor patients; G:Heat map of the correlation between the expression of AAMDC and disease-free survival for pan-carcinoma, and the expression of AAMDC in the highlighted part can be used as a prediction of disease-free survival prognosis. H-J: Prognostic survival plot of the correlation between AAMDC expression and disease-free survival in tumor patients.圖1 AAMDC在泛癌中的表達Figure 1 Expression of AAMDC in pan-carcinoma

2.2 AAMDC在HCC中的高表達與HCC不良預后相關(guān)

基于以上研究結(jié)果,于是檢測了多株人源HCC細胞及人類正常肝細胞L-02中AAMDC的表達,qRT-PCR(圖2A)和Western blot(圖2B)顯示AAMDC在HCC細胞株中表達顯著升高。采用免疫組化對多例HCC組織樣本中的AAMDC表達水平進行檢測,探究了其蛋白表達水平與預后相關(guān)性,結(jié)果顯示AAMDC高表達水平與HCC患者較短的無疾病生存期相關(guān)(圖2C),3例代表性染色結(jié)果如圖2D所示。隨后,用共聚焦熒光顯微鏡檢測AAMDC在HCC細胞株中的定位,結(jié)果顯示野生型以及外源過表達的AAMDC蛋白主要定位于HCC細胞的細胞質(zhì)中(圖2E)。

2.3 AAMDC對HCC的遷移和侵襲促進作用

HepG2細胞中過表達AAMDC,通過Western blot驗證了其過表達效果(圖3A),Transwell遷移和侵襲的結(jié)果顯示,過表達AAMDC后能夠促進HepG2細胞的遷移和侵襲(圖3A)。此外,在PLC8024細胞株中也具有相同的效應,過表達AAMDC能夠使PLC8024細胞的遷移和侵襲能力增強(圖3B)。本研究選擇AAMDC表達水平較高的HCC細胞SNU387和Huh7細胞敲低了AAMDC,qRT-PCR驗證AAMDC的敲低效果,隨后的Transwell結(jié)果表明,干擾AAMDC表達能夠抑制SNU387(圖3C)和Huh7(圖3D)兩株HCC細胞的遷移和侵襲能力。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)是指由上皮細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞,并獲得遷移侵襲能力的過程,多個研究證明EMT在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲中起到關(guān)鍵作用。本研究基于網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫對上皮相關(guān)分子標志物和AAMDC表達的相關(guān)性進行了分析,結(jié)果如圖3E所示,間質(zhì)細胞的標志物β-促胰蛋白酶(β-catenin,CTNNB1)、球蛋白(Vimentin)及N-凝集素(N-cadherin)與AAMDC的表達顯著正相關(guān),提示AAMDC促進HCC細胞的轉(zhuǎn)移可能與EMT過程相關(guān)。

1)P<0.05; 2)P<0.01。

2.4 AAMDC與FASN的相互作用

過表達AAMDC或敲低AAMDC分別促進或抑制HCC細胞的遷移和侵襲。為明確介導AAMDC促進腫瘤細胞遷移和侵襲功能的生物學途徑,采用免疫共沉淀結(jié)合高效液相質(zhì)譜的方法繪制AAMDC的相互作用蛋白質(zhì)網(wǎng)絡。首先在HepG2和PLC8024細胞里過表達AAMDC,并對其進行了免疫共沉淀、銀染、質(zhì)譜鑒定,探索AAMDC的相互作用蛋白質(zhì)(圖4A、B)。韋恩圖顯示,HepG2和PLC8024細胞中分別鑒定到353個和161個AAMDC的特異性互作蛋白質(zhì)(圖4C、D)。將HepG2細胞中AAMDC的互作蛋白質(zhì)進行通路分析,發(fā)現(xiàn)這些互作蛋白主要富集在細胞代謝通路、復合物組裝以及翻譯相關(guān)的信號通路(圖4E),而在PLC8024細胞中AAMDC的互作蛋白質(zhì)主要集中在細胞代謝、RNA剪接和rRNA生物合成等信號通路中(圖4F)。對在HepG2細胞和PLC8024細胞中獲取的AAMDC互作蛋白質(zhì)取交集,得到了11個在兩株HCC細胞中都與AAMDC具有相互作用的蛋白質(zhì)(圖4G),分別為FASN、PRMT1、S100A8、STRAP、RPS24、RPL27、RPL38、 RPS16、ABCB1、ITGA11、TUBA1B。其中,FASN通過催化脂肪酸生物合成來促進細胞生長和存活,并且多個研究報道FASN的異常激活是HCC發(fā)展過程中的主要代謝事件。隨后通過免疫共沉淀實驗驗證了AAMDC和FASN存在相互作用(圖4H)。并且通過油紅-O染色實驗發(fā)現(xiàn),細胞過表達AAMDC之后染色增加,表明AAMDC能夠促進脂質(zhì)合成(圖4I)。文獻報道FASN蛋白在脂肪酸生物合成中發(fā)揮重要作用[11],因此推測AAMDC可能通過與FASN互作影響HCC細胞的脂肪酸合成和代謝,進而參與介導HCC惡性進展。

A-B:SDS-PAGE結(jié)合銀染結(jié)果顯示AAMDC在HepG2 (A)和PLC8024 (B)中的相互作用蛋白質(zhì);C-D:高效液相質(zhì)譜鑒定AAMDC在HepG2 (C)和PLC8024 (D)中的相互作用蛋白質(zhì);E:AAMDC在HepG2細胞中的相互作用蛋白質(zhì)功能富集;F:AAMDC在PLC8024細胞中的相互作用蛋白質(zhì)功能富集;G:韋恩圖顯示AAMDC在HepG2和PLC8024的相互作用蛋白質(zhì)交集;H:免疫共沉淀結(jié)合Western blot的結(jié)果顯示FASN和AAMDC具有相互作用;I:油紅-O實驗結(jié)果顯示過表達AAMDC促進HCC中的脂質(zhì)積累。A-B: SDS-PAGE binding silver staining results showed AAMDC interaction proteins in HepG2 (A) and PLC8024 (B); C-D: High performance liquid phase mass spectrometry to identify AAMDC interaction proteins in HepG2 (C) and PLC8024 (D); E: Functional enrichment of interacting proteins of AAMDC in HepG2 cells; F: Functional enrichment of interacting proteins of AAMDC in PLC8024 cells; G: Wayne diagram showed that the intersection of AAMDC interacting proteins in HepG2 and PLC8024; H: The results of co-immunoprecipitation combined with Western blot showed that FASN and AAMDC interacted; I:Oil red-O experimental results showed that overexpression of AAMDC promoted lipid accumulation in HCC.圖4 AAMDC相互作用蛋白Figure 4 AAMDC interaction protein

2.5 AAMDC參與mTOR通路

為了探究AAMDC如何激活下游通路促進HCC細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,對過表達AAMDC的HCC細胞HepG2和PLC8024進行了轉(zhuǎn)錄測序?；鹕綀D顯示在HCC細胞過表達AAMDC后差異表達的基因(圖5A、B)。對過表達AAMDC的HCC細胞和對照組細胞進行生物信息學分析(圖5C),結(jié)果顯示mTOR信號通路被顯著激活。Western blot實驗檢測mTOR信號通路關(guān)鍵marker,結(jié)果表明過表達AAMDC促進mTOR信號通路的激活(圖5D),在過表達AAMDC的肝癌細胞,加入mTOR通路的抑制劑Rapamycin,結(jié)果顯示AAMDC激活p-mTOR的功能被顯著地抑制(圖5E)。另外,在過表達AAMDC的肝癌細胞中沉默F(xiàn)ASN的表達,Western blot結(jié)果表明沉默F(xiàn)ASN能夠抑制AAMDC對p-mTOR的激活作用(圖5F)。以上結(jié)果表明,AAMDC與mTOR通路異常激活相關(guān),并且該途徑是由FASN所介導的。

A-B:火山圖顯示在HepG2(A)和PLC8024(B)過表達AAMDC后差異表達的基因;C:點棒圖顯示mTOR通路在AAMDC過表達的HCC細胞中被顯著激活;D:Western blot實驗顯示AAMDC過表達激活mTOR通路;E:過表達AAMDC后加入mTOR通路抑制劑,檢測p-mTOR的變化;F:過表達AAMDC后沉默F(xiàn)ASN表達,檢測p-mTOR的變化。A-B: Volcano plots showed that differentially expressed genes after overexpression of AAMDC in HepG2(A) and PLC8024(B); C: The dot bar plot showed that the mTOR pathway was significantly activated in AAMDC overexpressed hepatocellular cells; D:Western blot experiments showed that AAMDC overexpression activated the mTOR pathway; E: AAMDC overexpression activated the p-mTOR was rescued by Rapamycin; F: AAMDC overexpression activated the p-mTOR was rescued by knockdown FASN.圖5 AAMDC激活mTOR通路Figure 5 AAMDC activates the mTOR pathway

3 討論

由于基因表達失調(diào)導致的腫瘤轉(zhuǎn)移與HCC患者較差的預后密切相關(guān)。在本研究中,AAMDC在HCC組織中表達上調(diào),通過激活mTOR通路促進HCC轉(zhuǎn)移。在一項Genome-Wide Association Studies(GWAS)研究中,AAMDC被鑒定為HBV感染的易感因素[5],提示AAMDC可能與HBV相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。TCGA和臨床隊列的表達分析結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,AAMDC的 mRNA和蛋白表達水平均表現(xiàn)為癌組織高于癌旁組織,且AAMDC高表達的HCC患者腫瘤復發(fā)和遷移的時間較短,提示AAMDC與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)過表達AAMDC顯著地促進HCC細胞的遷移和侵襲,這些數(shù)據(jù)均提示AAMDC在HCC進展中扮演著癌基因角色。

聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組測序及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)AAMDC可能通過激活mTOR通路促進HCC轉(zhuǎn)移,同時體外實驗結(jié)果也表明在HCC細胞中過表達AAMDC可提高mTOR通路磷酸化水平。本研究結(jié)果和此前AAMDC促進三陰乳腺癌轉(zhuǎn)移的研究結(jié)論一致[3]。多項研究數(shù)據(jù)表明AKT/mTOR通路可被circMDK/miR-346/ATG16L1[6]、ATF4/FUT1/EGFR[7]等信號軸激活,促進HCC的發(fā)生發(fā)展。藥物fasting可通過抑制AKT/mTOR信號通路阻斷Warburg效應,從而增強HCC細胞對sorafenib的藥物敏感性而抑制腫瘤生長[8]。接受肝移植治療的HCC患者中,使用mTOR抑制劑Rapamycin可顯著延長患者總生存期和無疾病生存期[9]。本研究數(shù)據(jù)表明,AAMDC通過與脂肪酸合成酶FASN相互結(jié)合而促進mTOR通路激活。現(xiàn)有文獻支持FASN在mTOR信號通路的調(diào)控中的作用。脂肪酸(FA)通常以甘油三酯(TG)形式存儲,作為能量來源,脂肪酸也用于合成鞘脂和甘油磷脂,作為信號轉(zhuǎn)導分子或生物膜構(gòu)建組分[10-11]。多項研究表明,脂肪酸代謝異常與HCC相關(guān)表征具有較高的相關(guān)性,包括化療敏感性、細胞增殖、血管生成和細胞侵襲[10-12]。此外,HCC的典型特征之一是脂肪酸合成相關(guān)基因的上調(diào),研究顯示FASN的高表達預示著HCC的不良預后[13]。敲除FASN顯著抑制小鼠模型中由AKT活化驅(qū)動的HCC發(fā)生[14],另有研究顯示FASN的缺失僅僅延遲了腫瘤的發(fā)生,表明其中還存在著支持HCC細胞增殖和存活的額外機制[15]。在FASN缺失的小鼠中,mTOR發(fā)生丙二?；チ藢70S6K/4EBP1的磷酸化調(diào)控[16]。在DLBC中,FASN更是可直接調(diào)控4EBP1的蛋白表達而激活AKT/mTOR通路[17]。FASN在胃腸間質(zhì)瘤中表達上調(diào),通過調(diào)控C75而激活AKT/mTOR通路,促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]。在小鼠HCC模型中,FASN缺失或失活可顯著地減少AKT/mTOR介導的腫瘤形成[19]。HCC細胞中,CD147激活的AKT/mTOR通路可反饋性促進FASN的轉(zhuǎn)錄而上調(diào)其表達[20]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)AAMDC可與FASN相互結(jié)合進而激活AKT/mTOR通路,然而,AAMDC與FASN的結(jié)合如何調(diào)控mTOR通路的仍需要深入研究,例如,二者的相互作用場所,AAMDC是否可增強FASN的蛋白穩(wěn)定性或者AAMDC是否可通過與FASN相互結(jié)合而參與脂質(zhì)代謝等。

基于TCGA數(shù)據(jù)和臨床樣本檢測數(shù)據(jù),本研究發(fā)現(xiàn)AAMDC在HCC組織中表達顯著上調(diào),AAMDC的高表達水平導致HCC患者的高復發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率?；诟咄繙y序和蛋白質(zhì)組學的生物信息學分析和體外實驗結(jié)果顯示AAMDC通過與FASN相互作用,激活AKT/mTOR通路,促進HCC細胞侵襲遷移。綜上,本研究的數(shù)據(jù)支持AAMDC在HCC中發(fā)揮癌基因功能。

作者貢獻聲明

周宣辰:實施實驗、整理數(shù)據(jù)、撰寫及修改論文;胡麗玲:整理數(shù)據(jù)、修改論文;李鈺瑩、石富金、鄭丹丹:整理數(shù)據(jù);施心雨:修改論文;張志毅:提供指導意見;孟坤、田秋紅:提出研究思路與框架、指導實驗、匯總數(shù)據(jù)、修改論文。

利益沖突聲明

本項目未受到企業(yè)、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。