高良姜素對(duì)利血平誘導(dǎo)的抑郁模型小鼠的影響

馮真英, 周中流, 陳丹, 彭素絹, 李觀同, 孫玉香, 黃麗平*

(1. 廣東醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 藥學(xué)部, 廣東 湛江 524001; 2. 嶺南師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 廣東 湛江 524048)

抑郁癥是一類以精神障礙為突出表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,癥狀表現(xiàn)為患者長(zhǎng)時(shí)間和持續(xù)的情緒低落,反應(yīng)遲緩。經(jīng)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),有近4億人正飽受抑郁癥的困擾,約占世界人口的4.4%,特別是在如今新冠病毒大流行的特殊時(shí)期,10年后抑郁癥可能成為人類勞動(dòng)能力低下甚至喪失的首要原因[1]。而目前廣泛使用的抗抑郁藥物具有很大局限性,如SSRIs和三環(huán)類等抗抑郁藥物,大多都有明確的不良反應(yīng)、價(jià)格高、停藥易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)[2],因此開發(fā)安全有效的預(yù)防抑郁癥及緩解抑郁癥狀的藥物是當(dāng)今社會(huì)亟須解決的問題。近年研究表明,中醫(yī)藥防治抑郁癥優(yōu)勢(shì)突出,不僅療效顯著,而且毒性較小,可以長(zhǎng)期服用。

高良姜是一種藥食同源的溫里藥,其性味基本穩(wěn)定,從古至今藥學(xué)書籍記載其特性基本一致,多以辛、苦、大溫、無(wú)毒為主,在醫(yī)用及日常應(yīng)用方面都有突出的貢獻(xiàn)。高良姜素是高良姜(alpiniaofficinarumhance)中的一種天然黃酮類化合物。近年研究提示,高良姜素具有修護(hù)皮膚、抑制炎癥、抗糖尿病、抗腫瘤及其并發(fā)癥、抗纖維化、抗病原微生物及神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性[3],其應(yīng)用前景廣闊。研究表明,高良姜素可改善APP/PS1小鼠海馬神經(jīng)元受損情況,其機(jī)制可能與介導(dǎo)Akt/MEF2D/Beclin-1轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)[4]。另外,抑郁患者常常伴有胃腸功能障礙或慢性胃病,而胃腸功能紊亂又會(huì)導(dǎo)致抑郁癥的癥狀加劇。高良姜黃酮類成分能顯著改善胃黏膜血管血流、抗氧化和預(yù)防胃黏膜損傷[5]。另外,最新研究表明,胃腸道菌群可經(jīng)腦-腸-菌軸干預(yù)消化道疾病的進(jìn)展,腦腸肽是腦-腸軸的神經(jīng)肽信號(hào),腦腸肽分泌異常,抑制五-羥色胺(5-HT)的分泌,可刺激胃酸分泌,促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng),導(dǎo)致焦慮和抑郁的發(fā)生[6]。然而,高良姜素可否通過(guò)改善胃腸功能而發(fā)揮抗抑郁作用仍未見報(bào)道,值得進(jìn)一步探討?；诖?本研究以氟西汀治療作為陽(yáng)性對(duì)照組,觀察利血平誘導(dǎo)的抑郁小鼠海馬和皮質(zhì)中應(yīng)激因子超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)及5-HT水平變化和自噬的影響,旨在為其抗抑郁治療提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF級(jí)小鼠,體質(zhì)量(20±2)g,6月齡,購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證:SCXK(粵)2018-0002。溫度指示計(jì)維持溫度在18～29℃,相對(duì)濕度55%,動(dòng)物房持續(xù)換氣。合格證編號(hào):44007200101764。本研究獲得廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):GDY2302382)。

1.1.2 主要試劑

鹽酸氟西汀(廣醫(yī)第一附屬醫(yī)院藥房,批號(hào):1798A);高良姜素(純度99.94%,成都曼思特生物科技有限公司,貨號(hào):548-83-4);SOD、MDA、GSH-Px和5-HT Elisa試劑盒購(gòu)自Mlbio公司,貨號(hào)分別為:ml29197-1、mlsh0939、m1058194、m1001891;P62、Beclin-1、LC3B和GAPDH一抗均購(gòu)自英國(guó)艾博抗公司,貨號(hào)分別為:ab240635,ab302670,ab192890,ab9484;RIPA裂解液購(gòu)自索萊寶科技公司;BCA、電泳液和轉(zhuǎn)膜液等均購(gòu)自Beyotime Biotechnology公司;3MA(貨號(hào)R022011)和利血平(貨號(hào)R006853)均購(gòu)自北京索萊寶生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模與干預(yù)

取模型小鼠60只,隨機(jī)分為正常組、模型組、氟西汀組(15 mg/kg)、高良姜素高劑量組(100 mg/kg)、高良姜素低劑量組(25 mg/kg)和自噬抑制組(3MA組)(30 mg/kg),每組10只。按照0.1 mL/10 g對(duì)各組小鼠灌胃,連續(xù)7 d。第7天灌胃,模型組及各給藥組即刻腹腔注射生理鹽水配制的2.5 mg/kg利血平溶液0.1 mL/10 g,正常組腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.2.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)在有機(jī)玻璃缸(25 cm×10 cm×15 cm),游泳時(shí)水溫控制在(24±2)℃,控制水位使小鼠游泳時(shí)尾巴不能觸碰到圓筒底部。強(qiáng)迫游泳6 min,觀察記錄后4 min內(nèi)小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。當(dāng)小鼠浮于液面、停止掙扎時(shí)開始記錄累計(jì)不動(dòng)時(shí)間[7],每次實(shí)驗(yàn)后清理并更換純凈水。

1.2.3 懸尾實(shí)驗(yàn)

懸尾實(shí)驗(yàn)的累計(jì)停滯時(shí)間能反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抑郁絕望狀態(tài)[8]。計(jì)算造模7 d時(shí)和給藥后小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間來(lái)評(píng)估小鼠的絕望情況。將小鼠的尾端距尾尖1 cm處黏貼在盒子頂部。小鼠的頭部向下,距離盒子底部約20 cm。實(shí)驗(yàn)持續(xù)5 min。當(dāng)懸吊的小鼠沒有明顯掙扎時(shí),被認(rèn)為是靜止的。記錄實(shí)驗(yàn)后5 min內(nèi)小鼠的累計(jì)靜止時(shí)間,每次只操作1只小鼠。適應(yīng)1 min后,待小鼠停止掙扎,靜止不動(dòng)為懸尾不動(dòng)時(shí)間。

1.2.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行小鼠焦慮抑郁程度檢測(cè)。將實(shí)驗(yàn)小鼠移置到透明箱子中(50 cm×50 cm×40 cm),以距離箱壁25 cm 的正方形區(qū)域?yàn)橹行膮^(qū)域。小鼠因趨觸性喜歡緊貼墻壁,這在有焦慮樣行為的小鼠中表現(xiàn)更為明顯,即焦慮程度較低的小鼠出現(xiàn)并停留在曠場(chǎng)中心區(qū)域的時(shí)間更多。每只小鼠分別被放置在箱子中心位置,給藥1 h后,將小鼠放入曠場(chǎng)內(nèi),觀察并記錄小鼠在5 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)情況,包括水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、后肢站立次數(shù),每次只操作1只,每次測(cè)試后及時(shí)清理動(dòng)物排泄物[9]。

1.2.5 糖水偏好實(shí)驗(yàn)

待給藥結(jié)束,各組小鼠單只分籠飼養(yǎng),籠子里放置2瓶1%糖水的飲水瓶,1 d后更換其中1瓶為純水,放置1 d。適應(yīng)訓(xùn)練結(jié)束后,禁水1 d后開始實(shí)驗(yàn):鼠籠放置1%糖水和純水各1瓶,1 d后稱取并記錄糖水和純水的消耗量,計(jì)算糖水偏好比。

1.2.6 Elisa檢測(cè)應(yīng)激因子SOD、MDA、GSH-Px和5-HT水平

將各組小鼠皮質(zhì)加入9 倍預(yù)冷生理鹽水并置于勻漿器中研磨,4000 r/min離心10 min,吸取上清液待測(cè),每孔加上清液10 μL和樣品稀釋液90 μL,隨后分別嚴(yán)格按SOD、MDA、GSH-Px和5-HT的Elisa試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.7 免疫熒光檢測(cè)LC3B的表達(dá)

小鼠腦組織經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛固定,脫水包埋處理后,將切片脫蠟至水;在3%H2O2中浸泡10 min;0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液微波加熱對(duì)抗原修復(fù);遮光封閉滴加LC3B抗體(1∶50)置于37 ℃恒溫箱1 h,加入羊抗兔二抗置于恒溫箱20 min,抗淬滅封片;PBS作為陰性對(duì)照;顯微觀察拍照,呈藍(lán)色熒光即為陽(yáng)性表達(dá),最后進(jìn)行圖像分析。

1.2.8 Western blot檢測(cè)Beclin-1和P62水平

將各組小鼠的海馬組織加入含蛋白酶抑制劑的裂解液,冷凍勻漿,12 000 r/min下低溫離心10 min, BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度,定量后用于Western blot檢測(cè)。在110 V,55 min條件下進(jìn)行電泳,上樣量為30 μg總蛋白,濕法轉(zhuǎn)膜,條件為300 mA、90 min,兔抗小鼠Beclin-1、P62和 GAPDH一抗(1∶1000),山羊抗兔二抗(1∶2500),ECL試劑盒在CLD檢測(cè)器中檢測(cè)。結(jié)果以各目的蛋白與GAPDH灰度值比值表示,用Image-pro進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析軟件采用SPSS 19.0。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,通過(guò)軟件中One-way ANOVA及t檢驗(yàn)對(duì)行為學(xué)觀測(cè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。免疫組化結(jié)果采用Image J進(jìn)行灰密度分析,然后結(jié)合SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高良姜素對(duì)利血平誘導(dǎo)的抑郁癥小鼠的影響

與正常組相比較,懸尾實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠的懸停時(shí)間顯著增加(P<0.01);與模型組比,氟西汀組、3MA組、高良姜素高和低劑量組小鼠的懸停時(shí)間顯著減少(P<0.01)。與正常對(duì)照組比較,強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠的浮停時(shí)間顯著增加(P<0.01);與模型組比,其余各組小鼠的浮停時(shí)間顯著減少(P<0.01)。與正常對(duì)照組比較,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠的水平活動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)顯著減少(P<0.01);與模型組比,高良姜素各劑量組的水平移動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)顯著增加(P<0.01)。與正常組比較,糖水偏好實(shí)驗(yàn)中模型組的糖水偏好度出現(xiàn)顯著降低(P<0.01);與模型組比,氟西汀組、3MA組和高良姜素高劑量組小鼠的糖水偏好度顯著提高(P<0.05),見圖1。

A: 懸尾實(shí)驗(yàn);B: 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn);C: 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn);D: 糖水偏好實(shí)驗(yàn)。與正常對(duì)照組相比, 1)P<0.05, 2)P<0.01;與模型組相比, 3)P<0.05, 4)P<0.01。A: Tail suspension test; B: Forced swimming test; C: Open field experiment; D: Sugar water preference experiment. Compared with the normal control group, 1)P<0.05, 2)P<0.01; Compared with the model group, 3)P<0.05, 4)P<0.01.圖1 高良姜素對(duì)利血平誘導(dǎo)的抑郁小鼠模型干預(yù)作用的影響Figure 1 Effect of galangin on reserpine-induced depressive mouse model

2.2 高良姜素對(duì)利血平誘導(dǎo)的抑郁小鼠腦氧化應(yīng)激和5-HT的影響

經(jīng)利血平誘導(dǎo)后,與正常組比,模型組表現(xiàn)為SOD、GSH-Px和5-HT水平明顯下降,而MDA濃度明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組比,其余各組小鼠表現(xiàn)為SOD、GSH-Px和5-HT水平明顯提高,而脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA濃度明顯減少(P<0.05或P<0.01),表明高良姜素能一定程度對(duì)抗利血平誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激從而發(fā)揮抗抑郁作用,見圖2。

與正常對(duì)照組相比, 1)P<0.05, 2)P<0.01;與模型組相比, 3)P<0.05, 4)P<0.01。Compared with the normal control group, 1)P<0.05, 2)P<0.01; Compared with the model group, 3)P<0.05, 4)P<0.01.圖2 高良姜素對(duì)利血平誘導(dǎo)的抑郁小鼠腦組織中氧化應(yīng)激因子和5-HT水平的影響Figure 2 Effect of galangin on oxidative stress factor and 5-HT level in brain of depressed rats induced by reserpine

2.3 高良姜素對(duì)利血平誘導(dǎo)的抑郁小鼠腦組織中自噬蛋白的影響

免疫熒光檢測(cè)LC3B表達(dá)情況,與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠的LC3B表達(dá)顯著增加(P<0.01);與模型組比,氟西汀組、高良姜素高劑量組和3MA組小鼠的LC3B表達(dá)均明顯降低(P<0.01),見圖3。

A:正常組;B:模型組;C:氟西汀組;D:高良姜素高劑量組;E:3MA(3-甲基腺嘌呤)組;F:LC3B蛋白相對(duì)表達(dá)量。與正常對(duì)照組相比,1)P<0.01;與模型組相比,2)P<0.01。A:Normal group; B:Nodel group; C:Fluoxetine group; D:Galangin high-dose group; E:3MA (3-methyladenine) group; F: Expression level of LC3B. Compared with the normal control group, 1)P<0.01; Compared with the model group, 2)P<0.01.圖3 免疫熒光檢測(cè)LC3B表達(dá)水平Figure 3 Expression level of LC3B detected by immunofluorescence

2.4 高良姜素對(duì)利血平誘導(dǎo)的抑郁小鼠神經(jīng)元自噬的影響

與正常組相比,模型組小鼠腦組織Beclin-1表達(dá)均顯著升高,而P62明顯下降(P<0.05或P<0.01);與模型組相比,氟西汀組、高良姜素高劑量組和3MA組小鼠腦組織Beclin-1表達(dá)水平均明顯降低,而P62則明顯上升(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果提示高良姜素可能通過(guò)抑制自噬發(fā)揮抗抑郁作用,見圖4。

與正常對(duì)照組相比,1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組相比,3)P<0.05,4)P<0.01。Compared with the normal control group, 1)P<0.05, 2)P<0.01;Compared with the model group, 3)P<0.05, 4)P<0.01.圖4 高良姜素對(duì)P62和Beclin-1表達(dá)的影響Figure 4 Effect of galangin on P62 and Beclin-1 expression

3 討論

利血平誘導(dǎo)急性抑郁癥是常用的抑郁模型構(gòu)建方法之一[10-12],通過(guò)消耗大腦內(nèi)5-HT等神經(jīng)遞質(zhì),引發(fā)運(yùn)動(dòng)滯緩、體溫降低及系列生理變化,從而造成抑郁癥[13]。動(dòng)物的懸尾、強(qiáng)迫游泳、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和糖水偏好等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)廣泛用于抗抑郁藥物的初篩,可全面評(píng)價(jià)高良姜素抗抑郁藥的作用效果[14]。本研究發(fā)現(xiàn),高良姜素高、低劑量組均能顯著減少小鼠強(qiáng)迫游泳浮停和懸尾不動(dòng)時(shí)間,提高掙扎頻率,增加其運(yùn)動(dòng)次數(shù),表現(xiàn)為小鼠水平跨越格子數(shù)和后肢站立次數(shù)增多,且小鼠對(duì)藥物呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。此外,結(jié)果還發(fā)現(xiàn)高良姜素可以顯著提高利血平誘導(dǎo)的急性抑郁模型小鼠海馬腦區(qū)中5-HT的水平,提示高良姜素可能通過(guò)調(diào)節(jié)5-HT的水平來(lái)改善急性抑郁模型小鼠的抑郁行為。

氧化應(yīng)激與抑郁癥之間的關(guān)系已引起諸多學(xué)者的關(guān)注。臨床及基礎(chǔ)研究均發(fā)現(xiàn),抑郁癥患者和抑郁動(dòng)物模型均出現(xiàn)抗氧化指標(biāo)的減少及氧化有關(guān)通路的激活,從而造成蛋白質(zhì)和DNA損傷,產(chǎn)生過(guò)氧化脂質(zhì)體[15]。研究證實(shí)通過(guò)抑制氧化應(yīng)激可減輕抑郁行為[16]。氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物中,MDA濃度是反映氧自由基水平的重要指標(biāo),MDA的產(chǎn)生過(guò)程伴隨著心肌抗氧化代謝酶SOD、過(guò)氧化氫酶(CAT)和GSH-Px的消耗,促使氧自由基生成而加劇氧化。高良姜素可激活PI3K/Akt通路,發(fā)揮抗過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[17],提示其具有明確的抗氧化活性。本研究發(fā)現(xiàn),利血平可以顯著降低小鼠皮質(zhì)中抗氧化代謝酶SOD和GSH-Px的水平,提高M(jìn)DA濃度,提示利血平具有增強(qiáng)小鼠氧化應(yīng)激的作用。結(jié)果顯示,高良姜素各劑量組和氟西汀組小鼠腦中SOD、GSH-Px水平顯著高于模型組小鼠,而MDA濃度顯著降低。由此可推測(cè)得到,高良姜素能夠顯著提高利血平誘導(dǎo)抑郁模型小鼠腦組織中抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性,減少脂質(zhì)過(guò)氧化中間產(chǎn)物MDA的濃度。

自噬是一種高度保守的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物消化和再循環(huán)的細(xì)胞機(jī)制,也是腦神經(jīng)元死亡的主要形式之一。Beclin-1、LC3和P62均是自噬標(biāo)志物,其中Beclin-1是自噬調(diào)控的標(biāo)志性蛋白之一,Beclin-1表達(dá)增加與自噬活性增強(qiáng)呈正相關(guān)[18-19]。Beclin-1是參與刺激自噬特異性基因的正調(diào)節(jié)因子;LC3是檢測(cè)自噬發(fā)生的標(biāo)志蛋白,是首個(gè)自噬小體膜蛋白,在前自噬泡及自噬泡表面富集。研究證實(shí),抑郁癥模型大鼠海馬組織中 Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高,海馬神經(jīng)元細(xì)胞自噬明顯增多,同時(shí),自噬過(guò)度激活,誘發(fā)神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷,從而加重海馬神經(jīng)損傷及大鼠的抑郁程度[20]。研究發(fā)現(xiàn),高良姜素可通過(guò)調(diào)節(jié)Akt/MEF2D/Beclin-1信號(hào)通路,利用自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)發(fā)揮清除海馬神經(jīng)元內(nèi)異常蛋白的作用,從而減少阿爾茨海默癥特征性蛋白(p-tau和Aβ42等)的聚積[4],發(fā)揮對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑郁模型組小鼠海馬中Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)顯著升高,P62蛋白表達(dá)顯著下降;而給予高良姜素干預(yù)治療后,高良姜素組小鼠海馬組織中Beclin-1和LC3B水平顯著下降,P62水平顯著升高,結(jié)果表明高良姜素能一定程度的抑制抑郁模型小鼠自噬水平。

綜上所述,高良姜素可以改善利血平抑郁模型小鼠的抑郁行為,可使抗利血平誘導(dǎo)的5-HT水平下降,SOD和GSH-Px水平提高,MDA水平降低,以及調(diào)節(jié)自噬標(biāo)志物Beclin-1、LC3B和P62的水平,因此推測(cè)高良姜素抗抑郁作用機(jī)制可能與抑制自噬和氧化應(yīng)激有關(guān),本研究為高良姜素對(duì)抑郁癥的治療作用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),后期將會(huì)針對(duì)其抗抑郁的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

作者貢獻(xiàn)聲明

馮真英、陳丹、彭素絹、孫玉香:實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、相關(guān)文獻(xiàn)資料收集、分析及論文初稿寫作;黃麗平、李觀同:論文框架及關(guān)鍵部分修改;周中流:項(xiàng)目指導(dǎo)及負(fù)責(zé)人,指導(dǎo)論文寫作。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。