臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)卵巢早衰家兔線(xiàn)粒體的影響

張娟, 李陽(yáng), 閆夏貝, 劉杰, 庹平

(1.中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科, 湖北 武漢 430070; 2.武漢科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 湖北 武漢 430081)

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF) 是指40歲以下女性出現(xiàn)卵泡發(fā)育不良和卵巢過(guò)早老化,引起持續(xù)性閉經(jīng)和性器官萎縮并伴有雌激素缺乏及促性腺激素水平升高的一種綜合征[1]。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚,與許多復(fù)雜因素有關(guān),主要有遺傳缺陷疾病[2]、自身免疫疾病和化療損傷等醫(yī)源性因素[3-4]。常用的激素替代療法只能緩解低雌激素導(dǎo)致的圍絕經(jīng)期綜合征,并不能有效恢復(fù)卵巢功能,而且超量使用激素會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的副作用。因此,需要積極尋求治療POF的新方法[5-6]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)因其固有的再生特性在醫(yī)學(xué)中備受重視[7-8]。MSCs是一種多能干細(xì)胞,免疫原性差,且獲取途徑多樣。其中人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞獲取較為容易,也無(wú)創(chuàng)傷,且引發(fā)的倫理問(wèn)題較少,是極好的來(lái)源途徑[8-10]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分泌許多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子、信號(hào)脂質(zhì)、信使RNA和調(diào)節(jié)性miRNA等[11],這些因素與細(xì)胞間通訊、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞或組織代謝的變化有關(guān)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)能同時(shí)激活多種機(jī)制(營(yíng)養(yǎng)、旁分泌、免疫調(diào)節(jié)和分化)來(lái)影響受損組織再生的所有階段,從而改善卵巢功能[12]。本課題組前期已成功構(gòu)建了家兔卵巢早衰模型[13],并發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的家兔POF模型在注射UCMSCs治療后,早衰卵巢的結(jié)構(gòu)和功能得到改善,細(xì)胞凋亡情況減少,雌二醇(estradiol,E2)上升,促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)下降,UCMSCs可能通過(guò)上調(diào)富半胱氨酸蛋白61和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá),從而激活休眠卵泡生成、恢復(fù)卵巢功能,對(duì)POF起到治療作用[14]。為進(jìn)一步探究UCMSCs治療POF的作用機(jī)制,本研究以家兔為對(duì)象,觀(guān)察UCMSCs治療后顆粒細(xì)胞凋亡比例、線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu)變化以及線(xiàn)粒體DNA(mitochondrial deoxyribonucleic acid,mtDNA)的拷貝數(shù)變化,研究UCMSCs對(duì)卵巢早衰家兔線(xiàn)粒體的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性未交配日本大耳白兔15只,2.5～2.8 kg,月齡5月左右,購(gòu)自武漢萬(wàn)千佳興生物科技有限公司[SCXK(鄂)2018-0022],飼養(yǎng)于中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心[SYXK (鄂)2019-0082]。本研究經(jīng)中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):2022211)。

1.2 主要試劑與儀器

EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix(EQ001)、FSH/ E2 ELISA Kit (ELK9279/1208)均購(gòu)自武漢ELK公司;tunel試劑盒(11684817910)購(gòu)自北京Roche公司;MesenCultTMOsteogenic/Adipogenic/Chondro Differentiation Kit(05465/05412/05455)均購(gòu)自加拿大stemcell technologies公司;Anti-CD90/34/105/45均購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司;熒光定量PCR儀(QuantStudio 6 Flex System)購(gòu)自武漢Life technologies公司;倒置熒光拍照顯微鏡(IX51)購(gòu)自日本OLYMPUS公司;酶標(biāo)儀(DR-200Bs)購(gòu)自Diatek公司;透射電子顯微鏡(HT7800)購(gòu)自HITACHI公司;注射用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)購(gòu)自德國(guó)Baxter Oncology GmbH公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與模型制備

隨機(jī)分組,正常對(duì)照組3只,POF模型組和UCMSCs治療組各6只。根據(jù)前期研究,采用連續(xù)2 d腹腔注射50 mg/kg環(huán)磷酰胺構(gòu)建POF模型,注射環(huán)磷酰胺后,各組家兔都有脫毛情況,采食量變少、活動(dòng)量減少、E2和FSH水平變化及卵巢指數(shù)變化等。

1.3.2 UCMSCs治療

(1)UCMSCs的培養(yǎng)及鑒定 臍帶標(biāo)本取自本院妊娠37周以上產(chǎn)婦胎兒,已獲中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):2016020)。將洗凈的臍帶剪成2～3 cm的小段,剔除臍動(dòng)靜脈,剝離華通膠,用無(wú)菌眼科剪將華通膠剪成1 mm2的小組織塊,轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加入10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素及完全培養(yǎng)液,于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)用胰蛋白酶消化液消化凍存或傳代。每3 d按1∶3體積比傳代。取第3代UCMSCs,制成懸液于EP管,分別加入抗體CD90、CD34、CD105、CD45,流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:貼壁細(xì)胞表達(dá)CD90和CD105,不表達(dá)CD34和CD45,為人體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(圖1)。取第3代UCMSCs,將細(xì)胞以(1.5×105)/孔接種于培養(yǎng)皿中,分別標(biāo)記為正常組、成骨組、成脂組和成軟骨組。待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%匯合度時(shí)分別將成骨組的培養(yǎng)基、成脂組的培養(yǎng)基、成軟骨組的培養(yǎng)基換成相應(yīng)的誘導(dǎo)液,正常組繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng),每2～3 d換液一次,鏡下觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)明顯鈣結(jié)節(jié)進(jìn)行茜素紅染色、發(fā)現(xiàn)明顯脂滴進(jìn)行油紅O染色、在誘導(dǎo)的21 d行阿利新藍(lán)染色,證明UCMSCs的成骨、成脂及成軟骨分化潛能(圖2)。

圖1 UCMSCs的流式檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Flow detection results of UCMSCs

(2)治療方法 UCMSCs治療組的6只家兔在造模后第3天連續(xù)注射3 d的UCMSCs懸液,細(xì)胞數(shù)為(5×106)/mL,每天2 mL。卵巢早衰模型組注射同等的滅菌用水。

1.3.3 觀(guān)察指標(biāo)

在造模前、治療后1、7和14 d,通過(guò)耳緣靜脈采取3組家兔靜脈血,離心(3 000 r/min,10 min)取上清,血清于-80 ℃冰箱保存。在治療后14 d處死后取材,取3組家兔雙側(cè)卵巢,清洗并稱(chēng)質(zhì)量,切取適量卵巢組織放在4%多聚甲醛中固定,固定后石蠟包埋,5 μm切片備用;切取米粒大小組織放入電鏡固定液中,另取所需量新鮮組織凍存在-80 ℃冰箱中。

(1)卵巢指數(shù) 生理鹽水清洗血跡,剝離多余脂肪組織后,用電子天平稱(chēng)取卵巢濕重并記錄;卵巢指數(shù)=卵巢濕重(g)/家兔體質(zhì)量(kg)。

(2)血清E2和FSH水平 取出-80 ℃冰箱保存的血清,Elisa法檢測(cè)血清中E2和FSH水平。

(3)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè) 每個(gè)卵巢組織石蠟切片隨機(jī)選取3張切片,經(jīng)脫蠟,蛋白酶K消化,37 ℃水浴鍋孵育30 min;加入破膜液,取tunel試劑盒中的試劑1和試劑2按體積比1∶10混合,配制適量孵育液,4 ℃過(guò)夜;滴加DAPI染核,室溫避光孵育20～30 min;用抗熒光淬滅封片劑封片,顯微鏡下觀(guān)察拍照,IPP軟件計(jì)數(shù)。

(4)電鏡觀(guān)察線(xiàn)粒體形態(tài) 取出電鏡固定液中的卵巢組織,1%鋨酸避光室溫固定;組織依次加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇和100%丙酮上行脫水;丙酮:812包埋劑滲透包埋;包埋板放于60 ℃烤箱聚合48 h;超薄切片后用150目方華膜銅網(wǎng)撈片;銅網(wǎng)先在2%醋酸鈾飽和酒精溶液中染色;然后再2.6%枸櫞酸鉛溶液中避二氧化碳染色;透射電鏡觀(guān)察卵巢組織中線(xiàn)粒體的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)。

(5)RT-PCR法檢測(cè)卵巢組織中mtDNA拷貝數(shù) 取20 mg卵巢組織于1 mL預(yù)冷的TRIpure中充分研磨,加入三氯乙烷混勻-離心-取上清液-加入異丙醇混勻-離心-棄上清-加入75%乙醇清洗RNA沉淀-離心-棄上清,加入RNase-Free Water充分溶解RNA,采用EntiLink 1stStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA,最后使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物:Rb-ACTIN:上游:5’-CCCAGATCATGTTCGAGACGT-3’,下游:5’-TAGC-CCTCGTAGATGGGCAC-3’;Rb-mtDNA:上游:5’-CGAAAAATCTTAGGGTACATACAAC-3’,下游:5’-TTAGGTTGACTAGTGGGTAAGGTAT-3’,采用2-ΔΔCT法進(jìn)行mtDNA拷貝數(shù)結(jié)果的計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 卵巢指數(shù)比較

正常對(duì)照組卵巢指數(shù)為(0.0567±0.0475),POF模型組卵巢指數(shù)為(0.0379±0.0239)。與對(duì)照組相比,模型組卵巢指數(shù)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);UCMSCs治療組卵巢指數(shù)為(0.0436±0.0125),與模型組相比,治療組卵巢指數(shù)升高,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);3組的卵巢指數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.764,P<0.05)。

2.2 各組E2和FSH值比較

各組在造模前血清E2和FSH水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FE2=0.032,PE2>0.05;FFSH=0.289,PFSH>0.05)。造模后模型組家兔E2值一直較低、FSH值一直較高,未隨時(shí)間出現(xiàn)規(guī)律性變化,與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t治療后1d E2=3.016,t7d E2=4.247,t14d E2=14.931,P<0.05;t治療后1d FSH=-4.562,t7d FSH=-8.015,t14d FSH=-9.038,P<0.05)。干細(xì)胞干預(yù)后治療組家兔血清E2水平上升,FSH水平下降,并且隨著時(shí)間出現(xiàn)周期性波動(dòng),與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t治療后1d E2=-6.896,t7d E2=-3.573,t14d E2=-45.964,P<0.05;t治療后1d FSH=3.136,t7d FSH=4.424,t14d FSH=8.872,P<0.05),見(jiàn)圖3、4。

圖3 3組不同采血時(shí)間點(diǎn)的E2水平Figure 3 E2 levels in the three groups at different blood collection time points

圖4 3組不同采血時(shí)間點(diǎn)的FSH水平Figure 4 FSH levels in three groups at different blood collection time points

2.3 卵巢顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)

正常對(duì)照組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)較少,散在分布,平均表達(dá)數(shù)為(1.51±0.24);POF模型組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多,均勻分布,平均表達(dá)數(shù)為(50.66±7.32),與正常對(duì)照組相比有差異(t=-11.442,P<0.05);UCMSCs治療組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)較模型組減少,平均表達(dá)數(shù)為(27.89±4.97),與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.400,P<0.05)。3組凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.57,P<0.05),見(jiàn)圖5、6。

A:正常對(duì)照組; B:模型組; C:治療組A: Normal control group; B: Model group; C: Treatment group圖5 卵巢顆粒細(xì)胞凋亡圖Figure 5 Apoptosis of ovarian granulosa cells

2.4 電鏡下卵巢組織線(xiàn)粒體形態(tài)變化

正常對(duì)照組中卵泡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核較大,圓形色淡,核仁偏位,并常見(jiàn)有分裂跡象。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線(xiàn)粒體、發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器;線(xiàn)粒體,呈圓形或長(zhǎng)橢圓形,散在分布。POF模型組卵泡顆粒細(xì)胞核皺縮明顯,線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)排列紊亂、腫脹及空泡變,線(xiàn)粒體體積變大、基質(zhì)變淺等,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張或囊泡化,或互相離散。UCMSCs治療組卵泡顆粒細(xì)胞核皺縮不明顯,散在分布正常及異常線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu),線(xiàn)粒體嵴部分尚存,伴空泡,見(jiàn)圖7、8。

A:正常對(duì)照組; B:模型組; C:治療組A: Normal control group; B: Model group; C: Treatment group圖7 透射電鏡下的線(xiàn)粒體形態(tài)改變(×2 500)Figure 7 Morphological changes of mitochondria under transmission electron microscopy(×2 500)

2.5 卵巢組織中mtDNA拷貝數(shù)變化

正常對(duì)照組卵巢組織中mtDNA拷貝數(shù)均值為(1.04±0.12),POF模型組卵巢組織中mtDNA拷貝數(shù)較少,均值為(0.26±0.10),與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.789,P<0.05);而UCMSCs治療組卵巢組織中mtDNA拷貝數(shù)明顯增加,均值為(0.66±0.14),與模型組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.097,P<0.05)。3組卵巢的卵巢組織中mtDNA拷貝數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.89,P<0.05),見(jiàn)圖9。

1)P<0.05; 2)P<0.01圖9 卵巢組織中mtDNA拷貝數(shù)Figure 9 Copy number of mtDNA in ovarian tissue

3 討論

近年來(lái),眾多研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞治療是較好的細(xì)胞療法之一[15-16]。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛,而較為常用的是UCMSCs[17]。UCMSCs能分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及神經(jīng)元樣細(xì)胞等多種類(lèi)型的細(xì)胞,且取材簡(jiǎn)單、免疫原性低和倫理爭(zhēng)議少,在醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前研究表明,UCMSCs已在許多疾病的治療中發(fā)揮重要作用,如卵巢早衰、糖尿病、肝損傷、骨損傷等[18-20]。

線(xiàn)粒體是存在于顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞內(nèi)、具有核外遺傳物質(zhì)、可獨(dú)立進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯的半自主細(xì)胞器,參與許多基本的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)。線(xiàn)粒體內(nèi)膜向內(nèi)褶皺形成“嵴”,線(xiàn)粒體嵴上有許多線(xiàn)粒體基粒,這些基?？衫煤粑満铣葾TP,線(xiàn)粒體分布不規(guī)則及空泡化結(jié)構(gòu)改變是卵母細(xì)胞損傷的標(biāo)志[21]。線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)的紊亂變化會(huì)影響卵母細(xì)胞的發(fā)育,可能導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備功能下降甚至衰退[22]。mtDNA是線(xiàn)粒體獨(dú)立擁有的一組遺傳物質(zhì),編碼著線(xiàn)粒體呼吸鏈上的13種蛋白[23]。mtDNA拷貝數(shù)的減少會(huì)影響呼吸鏈上13種蛋白亞基的轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能異常[23]。研究發(fā)現(xiàn)[24-25],線(xiàn)粒體功能異?？稍斐陕涯讣?xì)胞及其周?chē)亚痤w粒細(xì)胞的功能障礙和凋亡,導(dǎo)致卵泡閉鎖甚至衰竭。上述研究提示線(xiàn)粒體異常與卵巢衰老密切相關(guān)。

本研究顯示:與正常對(duì)照組相比,造模后卵巢指數(shù)明顯降低,POF模型組家兔一直處于低E2和高FSH狀態(tài),顆粒細(xì)胞凋亡比例明顯升高,影響卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)與發(fā)育,均顯示了環(huán)磷酰胺對(duì)卵巢的損傷,模型在生理上能基本代表人POF。同時(shí)觀(guān)察發(fā)現(xiàn),POF模型組家兔卵巢組織線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)紊亂、完全空泡化,大量線(xiàn)粒體嵴消失,mtDNA拷貝數(shù)明顯減少,表明卵巢早衰與線(xiàn)粒體損傷存在相關(guān)性,卵巢衰老伴隨線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)紊亂和功能異常。經(jīng)UCMSCs耳緣靜脈注射治療后,POF家兔卵巢指數(shù)升高,血清FSH值降低、E2值升高,顆粒細(xì)胞凋亡明顯減少,卵巢組織的線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)中間雖有空泡化,但線(xiàn)粒體嵴部分尚存,mtDNA拷貝數(shù)也增加,提示線(xiàn)粒體損傷修復(fù)可能在UCMSCs治療卵巢早衰中起作用。最近的觀(guān)察表明,在許多情況下,干細(xì)胞只短暫地出現(xiàn)在受損組織中,但它們?cè)诙虝撼霈F(xiàn)期間,會(huì)限制組織破壞或通過(guò)各種機(jī)制加強(qiáng)修復(fù)受損組織,這些機(jī)制包括為促進(jìn)組織內(nèi)源性干細(xì)胞的增殖和分化提供合適的環(huán)境;上調(diào)過(guò)度免疫反應(yīng)的基因;轉(zhuǎn)移含有線(xiàn)粒體和microRNA的囊泡成分;上調(diào)炎癥反應(yīng)的基因[26]。研究闡明[27-28],UCMSCs有能力將自己的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移到mtDNA耗盡的細(xì)胞中,轉(zhuǎn)移的mtDNA可以恢復(fù)線(xiàn)粒體呼吸鏈和氧化磷酸化等一系列重要的細(xì)胞功能,表明UCMSCs可以作為一種潛在的治療手段,線(xiàn)粒體的轉(zhuǎn)移為UCMSCs治療與線(xiàn)粒體功能障礙相關(guān)的疾病提供了合理的依據(jù)。

綜上所述,POF伴隨著mtDNA拷貝數(shù)的減少和線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)的破壞,經(jīng)UCMSCs治療后,mtDNA拷貝數(shù)較前增加,線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)部分恢復(fù),提示UCMSCs對(duì)POF的治療可能是通過(guò)修復(fù)線(xiàn)粒體損傷來(lái)減少細(xì)胞凋亡和組織修復(fù)來(lái)完成的,但其通路機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

作者貢獻(xiàn)聲明

張娟:提出研究思路和框架,完善課題,修改論文;李陽(yáng):實(shí)驗(yàn)操作,撰寫(xiě)論文;閆夏貝:設(shè)計(jì)及指導(dǎo)實(shí)驗(yàn),撰寫(xiě)論文;劉杰:指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)步驟,協(xié)助實(shí)驗(yàn)完成;庹平:指導(dǎo)文獻(xiàn)的查找和實(shí)驗(yàn)步驟。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等的第三方資助,不存在潛在利益沖突。