三氯乙烯高效降解菌的篩選鑒定及降解特性研究

曹衛(wèi)承

（上海市環(huán)境科學(xué)研究院，上海 200233）

鹵代烴類(lèi)化合物用途非常廣泛，既能在化學(xué)實(shí)驗(yàn)室用作有機(jī)溶劑，也能在化工廠用作化學(xué)試劑的原材料。其通常被用在實(shí)驗(yàn)室作為有機(jī)溶劑使用，在化工廠還經(jīng)常被當(dāng)作原料使用。

鹵代烴在使用完成以后，如果沒(méi)有采取有效的處理，就會(huì)引起周?chē)h(huán)境的污染。如果它們揮發(fā)到空氣中，就會(huì)引起大氣污染。如果泄漏到土壤中，就會(huì)引起土壤和地下水的污染[1-3]。

在地下水的所有污染物中，鹵代烴是一大類(lèi)，占比超過(guò)了40%。它們本身具有一定的毒性，人類(lèi)接觸后會(huì)引起一系列健康問(wèn)題，并且具有“三致“作用，能夠在食物鏈中傳播，在生物體內(nèi)具有富集作用。

在鹵代烴中，三氯乙烯，英文簡(jiǎn)寫(xiě)TCE，是其中一大類(lèi)。TCE 在美國(guó)和日本滲入到地下水中，引起了廣泛的污染[4-7]。

從1960 年起，世界上各個(gè)國(guó)家逐漸對(duì)TCE 引起的污染重視起來(lái)，逐步將其列入到自己國(guó)家的污染物控制名單中。美國(guó)環(huán)境保護(hù)總署（EPA）把TCE 列入到優(yōu)先控制污染物名單中。在我們國(guó)家，國(guó)家生態(tài)環(huán)境保護(hù)部將其列入到有限監(jiān)測(cè)污染物[8-9]。

TCE 的降解產(chǎn)物包括二氯乙烯和氯乙烯，同樣具有一定的毒性和“三致“作用。

目前，在世界上很多國(guó)家，無(wú)論是土壤還是地下水中，TCE 都引起了普遍的污染，治理的難度也非常大。

對(duì)于環(huán)境污染問(wèn)題，治理的方法有很多，其中微生物方法是一種行之有效的好方法，也可以用來(lái)解決TCE 帶來(lái)的問(wèn)題[10-11]。

對(duì)于TCE 引起的環(huán)境污染，最開(kāi)始用厭氧微生物去治理[12-15]?？墒窃谥卫淼倪^(guò)程中，往往生成有毒物質(zhì)，于是開(kāi)始用好氧微生物去治理。在好氧環(huán)境中，從外面引入的好氧毒株適宜性不如本地的好，所以首選本地環(huán)境中培養(yǎng)的好氧毒株。

本文研究地點(diǎn)選擇上海市浦東新區(qū)，試著從當(dāng)?shù)剡x擇好氧毒株治理TCE 污染。本文從整個(gè)降解動(dòng)態(tài)出發(fā)，比較不同的降解條件，選擇最合適的，為以后TCE引起的污染修復(fù)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 菌種來(lái)源

菌種來(lái)源選擇上海市浦東新區(qū)的一個(gè)化工廠。首先在化工廠中選擇合適的地點(diǎn)打井，并用采樣工具采集井中地下水樣品。將取回來(lái)的地下水樣品，用分析儀器進(jìn)行測(cè)試，分析結(jié)果表明水中含有TCE 污染物。將剩余地下水樣品裝入采樣瓶中，并充入一定量的保護(hù)氣氮?dú)?。將沖完氮?dú)獾臉悠菲糠旁诒淅锢洳乇４妗?/p>

1.2 TCE 高效降解菌的馴化篩選

將取來(lái)的菌種選擇平板法進(jìn)行培養(yǎng)，選擇TCE 作為碳源。

用50 mL 移液管移取無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基50 mL，置于培養(yǎng)裝置中，用電子天平稱(chēng)取10 g 樣品加入其中。

在避光條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度設(shè)置為30℃，轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)為180 rpm，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為36 h。

用移液管移取1 mL 的培養(yǎng)液，將其加入到新的地下水樣品中，加完后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度設(shè)置為30 ℃，轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)為180 rpm。培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為5 d，再用移液管移取培養(yǎng)液，周而復(fù)始。最后從培養(yǎng)液中得到純菌，數(shù)量為3 株。對(duì)菌進(jìn)行編碼，分別為T(mén)CE-1、TCE-2、TCE-3。

配制質(zhì)量濃度為10 mg/L 的TCE 溶液，并將溶液pH 調(diào)節(jié)為7。將調(diào)節(jié)完的溶液加入反應(yīng)器中，并加入體積為180 mL 的培養(yǎng)基，隨后加入含菌的懸浮液，使菌的濃度保持為100 cells/mL。

配制完成后，將反應(yīng)器在30 ℃下進(jìn)行振蕩，將反應(yīng)器轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)為180 rpm。將振蕩完的樣品經(jīng)過(guò)儀器進(jìn)行分析測(cè)試，分析結(jié)果表明1 號(hào)菌TCE-1 降解效果最好。

1.3 TCE 高效降解菌的鑒定

接下來(lái)用化學(xué)試劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取菌株的DNA。首先用SDS－蛋白酶K 進(jìn)行裂解，接下來(lái)用CTAB 把多糖以及細(xì)胞碎片進(jìn)行沉淀，然后再用異丙醇進(jìn)行沉淀。

接下來(lái)對(duì)提取的DNA 進(jìn)行操作，完成16SrDNA的PCR 擴(kuò)增。采用的擴(kuò)增引物為通用引物。把f27：AGAGTTTGATCCTGG CTCAG 作為正向引物使用。把rl 492：TACGGCTACCTTGTTACGACTT 作為反向引物使用。該引物PCR 擴(kuò)增片段約為1 500 bp。

PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：10×Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，20 μmol/L 引物f27 1 μL，20 μmol/L 引物r1 492 1μL，ddH2O 34 μL，DNA 模板0.5 μL，5 U/L TaqDNA 聚合酶0.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min；94℃20s，52℃10s，72 ℃30 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。溴化乙錠染色后，紫外凝膠成像系統(tǒng)成像觀察，以DNA Marker 為參照。

接下來(lái)，對(duì)整個(gè)菌株進(jìn)行測(cè)序。這項(xiàng)工作是由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成，

1.4 TCE 高效降解菌的降解性能探究

1.4.1 接種量

首先，研究接種量對(duì)降解性能的影響。選擇4 種TCE-1 接種量進(jìn)行分析。最大接種量設(shè)定為40%，最小接種量設(shè)定為10%。中間接種量為20%和接種量30%。接下來(lái)將溶液pH 調(diào)節(jié)為7。

然后把反應(yīng)液置于恒溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)定反應(yīng)溫度為30 ℃。對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行振蕩，振蕩速率調(diào)節(jié)為180 rpm。

隨著反應(yīng)的進(jìn)行，利用分析儀器對(duì)TCE 含量進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.4.2 pH

其次，研究pH 對(duì)降解性能的影響。將溶液最大pH 設(shè)定為11.0，將溶液最小pH 設(shè)定為3.0。中間設(shè)置了3 個(gè)pH 溶液5.0、7.0、9.0。將溫度環(huán)境設(shè)置為30 ℃，在搖床內(nèi)采用振蕩培養(yǎng)，振蕩速率設(shè)定為180 rpm。

隨著反應(yīng)的進(jìn)行，利用分析儀器對(duì)TCE 含量進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.4.3 溫度

再次，研究反應(yīng)溫度對(duì)降解性能的影響。將反應(yīng)溫度最大值設(shè)置為35 ℃，將反應(yīng)溫度最小值設(shè)置為15 ℃。中間插入20、25 和30 ℃。將溶液pH 調(diào)節(jié)為中性，接種量調(diào)節(jié)為30%。采用振蕩培養(yǎng)的方式進(jìn)行，振蕩速率設(shè)定為180 rpm。

隨著反應(yīng)的進(jìn)行，利用分析儀器對(duì)TCE 含量進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.4.4 初始濃度

最后，研究初始濃度對(duì)降解性能的影響。配制不同濃度的TCE 溶液。將最大質(zhì)量濃度設(shè)定為100 mg/L，將最小質(zhì)量濃度設(shè)定為0.1 mg/L。中間質(zhì)量濃度設(shè)置為1 和10 mg/L。

將反應(yīng)液pH 調(diào)節(jié)為7.0，設(shè)定接種量為30%。采取恒溫振蕩方式，把溫度設(shè)定為30 ℃，把搖床的振蕩速率調(diào)節(jié)為180 rpm。

隨著反應(yīng)的進(jìn)行，利用分析儀器對(duì)TCE 含量進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.5 氣相色譜分析

本文研究了TCE 溶液的儀器分析條件。分析儀器采用氣相色譜，儀器型號(hào)為島津GC-2010。儀器的具體分析條件見(jiàn)表1。

表1 島津GC-2010 氣相色譜分析條件

2 結(jié)果與分析

2.1 TCE 高效降解菌的鑒定

2.1.1 TCE-1 菌株的形態(tài)學(xué)特征

對(duì)菌株形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行研究，在培養(yǎng)基上進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)菌落成圓形，菌落的直徑約為2 mm 大小。

菌落呈現(xiàn)出乳白色，菌落的邊緣比較整齊。

菌落的表面比較光滑，看起來(lái)還很濕潤(rùn)。發(fā)現(xiàn)很容易挑起。

革蘭氏染色陽(yáng)性，球狀，菌體濃度為5.5×106個(gè)/mL。

2.1.2 TCE-1 菌株16S rDNA 的序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

接下來(lái)，將TCE-1 1 123bp 的測(cè)定結(jié)果列出，如圖1 所示。

圖1 測(cè)定結(jié)果

在NVBI 網(wǎng)站上，利用Blast 程序進(jìn)行分析。比較測(cè)得的序列與Genbank 中核酸的序列，TCE-1 同源性于Stenotrophomonas 菌株，選取與該序列相關(guān)性較高的20 個(gè)序列，用DNAstr v 軟件包Cilstal V 法，對(duì)這些細(xì)菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)TCE-1 菌株與Stenotrophomonas 屬中Stenotrophomonas sp. TS23 關(guān)系最近，如圖2 所示。

圖2 菌株16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

經(jīng)過(guò)綜合形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，將TCE-1歸入到Stenotrophomonas 屬中，把它命名為Stenotropho monas sp.TCE-1 菌株。

該菌株為單胞菌，其屬于好氧菌類(lèi)，這種菌株在土壤中經(jīng)常出現(xiàn)。

文獻(xiàn)報(bào)道Stenotrophomonas 屬菌種善于降解多環(huán)芳烴。

2.2 菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)

在液體培養(yǎng)基中接種TCE-1。每隔一定時(shí)間，取一定量的培養(yǎng)菌液進(jìn)行測(cè)定。選用的測(cè)定波長(zhǎng)為600 nm。將生長(zhǎng)曲線(xiàn)列在圖3。菌株剛開(kāi)始生長(zhǎng)比較慢，在24 h后增長(zhǎng)非?？欤?0 h 后非常穩(wěn)定。

圖3 TCE-1 在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.3 接種量對(duì)TCE 降解的影響

首先，研究接種量對(duì)降解性能的影響，如圖4 所示?？偟膩?lái)說(shuō)，當(dāng)接種量低的時(shí)候，降解效率也低。接種量高的時(shí)候，降解效率也高。降解效率的最大值，是在30%的時(shí)候。超過(guò)30%，氧氣會(huì)消耗得特別快。缺少氧氣，反應(yīng)進(jìn)行得不徹底。

圖4 接種量對(duì)TCE 降解性能的影響

2.4 pH 對(duì)TCE 降解性能的影響

其次，研究pH 對(duì)降解性能的影響。不同pH 分析結(jié)果如圖5 所示。將反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為64 h。在酸性pH為3 的溶液中降解42.8%。在酸性pH 為5 的溶液中降解了53.1%。在堿性pH 為9 的溶液中降解了79.0%。在堿性pH 為11 的溶液中降解了45.1%。在中性pH為7 的溶液中降解了86.9%。最大降解率為86.9%，是在中性pH 為7 的溶液中進(jìn)行的。

圖5 pH 對(duì)TCE 降解性能的影響

不同pH 下TCE 降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 不同pH 下TCE 降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.5 溫度對(duì)TCE 降解性能的影響

再次，研究溫度對(duì)降解性能的影響。一般來(lái)說(shuō)，溫度越高，反應(yīng)速度越大。但如果把溫度提高太多，酶的活性就會(huì)降低。一般來(lái)說(shuō)總有一個(gè)適合溫度。

溫度對(duì)TCE 降解性能的影響如圖6 所示。從圖6中可觀察到TCE 降解最快的時(shí)候，發(fā)生在溫度為30 ℃。而且在這個(gè)溫度，降解最多。降解比較慢的時(shí)候發(fā)生在15 ℃及以下。一般來(lái)說(shuō)微生物代謝差的時(shí)候多發(fā)生在低溫時(shí)候，以致污染物降解也慢。

圖6 溫度對(duì)TCE 降解性能的影響

不同溫度下TCE 降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 不同溫度下TCE 降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.6 初始濃度對(duì)TCE 降解性能的影響

最后，研究初始質(zhì)量濃度對(duì)降解性能的影響。不同初始濃度的分析結(jié)果如圖7 所示。將最大質(zhì)量濃度設(shè)置為10 mg/L。將最小質(zhì)量濃度設(shè)置為0.1 mg/L。觀察時(shí)間設(shè)定為72 h。結(jié)果表明，初始質(zhì)量濃度增大，降解率也增大。把研究質(zhì)量濃度繼續(xù)擴(kuò)大到100 mg/L，濃度增大了，降解慢了下來(lái)。說(shuō)明高濃度TCE 溶液產(chǎn)生了抑制作用。

圖7 初始質(zhì)量濃度對(duì)TCE 降解性能的影響

不同初始質(zhì)量濃度下TCE 降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。

表4 不同初始質(zhì)量濃度下TCE 降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 結(jié)論

1）好氧菌TCE-1 是能夠?qū)CE 礦化的。在分析圖譜中，其他氯代產(chǎn)物的峰并沒(méi)有出現(xiàn)。從圖譜分析結(jié)果中，可以觀察帶沒(méi)有出現(xiàn)二次污染。

2）從基于形態(tài)學(xué)觀察以及16S rDNA 序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育來(lái)看， 可以將TCE -1 歸入到單胞屬Stenotrophomonas sp.。在土壤中，可以經(jīng)常發(fā)現(xiàn)這種菌。

3）Stenotrophomonas sp.TCE-1 降解TCE 的最佳條件為pH 7.0，溫度30 ℃。在這些條件下接種量大于5%時(shí)，增加接種量對(duì)提高TCE 降解速率效果明顯，在一定濃度范圍內(nèi)，菌株不受基質(zhì)抑制。

4）Stenotrophomonas sp.TCE-1 在上述最佳反應(yīng)條件下，TCE 初始質(zhì)量濃度為10 mg/L 時(shí)其降解速率常數(shù)為0.029 2 h-1，降解半衰期為23.74 h。