一株c基因型牛副流感病毒3型病毒的分離鑒定

楊 巍，蔣 磊，董秀梅

1.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院/農業(yè)部動物疫病病原生物學重點實驗室東北科學觀測實驗站，黑龍江哈爾濱 150030；2.遼寧省農業(yè)發(fā)展服務中心，遼寧沈陽 110032

牛副流感病毒3型（BPIV3）屬于副黏病毒科、副黏病毒亞科、呼吸道病毒屬，是一種能夠引起牛的急性呼吸道疾病的病毒性病原。BPIV3有3種常見的基因型，包括a、b、c型，這三種基因型之間的差異很小[1]。在臨床上BPIV3容易與其它病原發(fā)生混合感染，很少發(fā)現(xiàn)單獨感染的病例。如果是BPIV3的單獨感染，一般不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，個別病例會有輕微的呼吸道癥狀。若是BPIV3與其它病原發(fā)生混合感染則病情惡化迅速，特別是細菌的繼發(fā)性感染容易引起嚴重的呼吸道癥狀，最終導致死亡。近些年來，我國黑龍江、內蒙古等省在流行病學調查中發(fā)現(xiàn)，牛群中BPIV3的血清陽性率很高，其它一些省如山東、江西等也在牛群中檢測到了BPIV3抗體的存在[2]。因此對于BPIV3的防治應引起高度重視,否則將嚴重危害我國養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。

本研究中，我們從黑龍江某牛場中有呼吸道癥狀的病牛鼻拭子中成功分離到一株BPIV3。將分離株M基因與GenBank中已發(fā)表毒株的M基因進行同源性比較及進化樹分析，結果表明分離株屬于c基因型。我們的結果將為牛副流感病毒3型檢測試劑盒及疫苗的研發(fā)工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病料

病料樣本采集于黑龍江某牛場患有呼吸系統(tǒng)疾病的病牛。

1.1.2 細胞和主要試劑

MDBK細胞由本實驗室保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司，RNA提取試劑盒、2×Taq PCR試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA marker等購自天根生化科技有限公司，反轉錄試劑盒、FITC標記的兔抗羊IgG購自賽默飛世爾科技公司，BPIV3抗體購自VMRD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病毒的分離純化

先將無菌采集到的病牛鼻拭子放置于1 mLPBS中充分混勻，用0.22 μm的濾膜過濾除菌后接種于長滿單層的MDBK細胞。盲傳三代后對產生CPE的樣本進行噬斑純化[3]。純化后的病毒在MDBK細胞上連續(xù)傳代，收集各代病毒液放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫熒光鑒定

用純化后的病毒感染MDBK細胞，感染72 h后固定被感染的細胞，Triton-X-100透膜，BSA封閉后加入一抗（BPIV3抗體）孵育1 h，然后加入二抗（FITC標記的兔抗羊IgG）孵育1 h，最后用含有DAPI的封片劑封片，封片后樣品用熒光顯微鏡進行觀察[4]。

1.2.3 分離株生長情況的測定

用純化后的病毒感染MDBK細胞，于感染后的不同時間點收取病毒，測定感染后病毒的生長情況。病毒滴度的測定方法如下：將收獲病毒的上清液進行10倍稀釋（10-1～10-10）；將MDBK細胞培養(yǎng)于96孔板上，長滿單層后加入稀釋好的病毒液，每個稀釋度做8個復孔，每孔加入100 μL，使其在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；同時設立陽性和陰性對照。每天觀察細胞病變情況，5 d后用Karber法計算結果[5]。

1.2.4 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的BPIV3分離株SD0835（GenBank登錄號：HQ530153）和NX49（GenBank登錄號：KT071671） M基因序列，利用生物學軟件Oligo和DNAStar設計一對引物。上游引物為：5’-GCCAATCAGTCCCTCGACAAA-3’，下游引物為：5’-TGTCCAGGCTGTCGGTGTTAC-3’。預期擴增片段大小為1 094 bp。引物由吉林庫美生物技術有限公司合成。

1.2.5 RT-PCR

參照病毒RNA提取試劑盒說明書提取BPIV3病毒基因組RNA，參照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA為模板使用上述設計好的引物進行目的片段的擴增。PCR反應體系為：上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix Ⅱ 12.5 μL，DNA 模板 2 μL，dH2O 8.5 μL。反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產物置于4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行鑒定。

1.2.6 擴增產物的測序與序列分析

樣品送吉林庫美生物技術有限公司進行測序，將測序結果與GenBank上已發(fā)表的序列進行比較，并利用Mega 6.0和DNAStar軟件進行系統(tǒng)進化分析和同源性比較。

2 實驗結果

2.1 接種BPIV3分離株的MDBK細胞的免疫熒光鑒定

MDBK細胞被病毒感染后48 h用間接免疫熒光法對被感染細胞進行鑒定。結果表明，細胞對照組中只有代表細胞核的藍色熒光信號，而實驗組中除了藍色熒光信號外還發(fā)現(xiàn)了代表BPIV3感染的綠色熒光信號,證明分離到的病毒為BPIV3。

2.2 BPIV3分離株在MDBK細胞上生長情況的測定

用純化后的病毒感染MDBK細胞，于感染后的不同時間點（0、12、24、48、72、96 h）收取病毒，測定病毒滴度并繪制病毒生長曲線。結果表明在感染后第72小時達到病毒最高滴度為5.62×108TCID50/mL。

噬斑純化后的病毒在MDBK細胞上進行七次連續(xù)傳代（P1～P5），比較各代次之間的病毒滴度。結果表明傳至P5代病毒的滴度明顯提升達到6.58×108TCID50/mL。

2.3 BPIV3分離株M基因的擴增

利用RT-PCR方法擴增出HLJ1分離株的M基因，PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，與預期大小一致，為1 094 bp。

2.4 BPIV3分離株M基因的序列測定與分析

測序結果表明HLJ1分離株的M基因大小為1 056 bp，與BPIV3c型參考毒株NX49和SD0835同源性較高分別達到99.7%、99.1%，而與其它BPIV 3a和BPIV3b型參考毒株同源性較低為83.1%～85.8%（NM09（GenBank登錄號：JQ063064）,Q5592（GenBank登錄號：EU277658），TVMDL15（GenBank登錄號：KJ647284），TVMDL60（GenBank登錄號：KJ647289））。氨基酸同源性方面，HLJ1與NX49和SD0835的同源性均為99.7%，而與Q5592的同源性最低為96.3%。遺傳進化分析表明，HLJ1與NX49和SD0835同屬于c基因型。

3 討論

在本研究當中我們采取患有呼吸系統(tǒng)疾病的病牛的新鮮鼻拭子，經放置在無菌PBS中混勻并濾膜除菌后，立即接種MDBK細胞，盲傳三代后，能夠產生典型的病變。分離到的病毒經噬斑純化后，用間接免疫熒光方法進行鑒定，結果表明成功分離出一株BPIV3毒株。病毒感染MDBK細胞后，測定不同時間點的病毒滴度并繪制病毒生長曲線。我們發(fā)現(xiàn)在感染后0～72 h病毒增殖速度較快，并于感染后第72小時達到病毒最高滴度，72 h后病毒滴度逐漸回落，因此在進行病毒傳代過程中，為獲得最大滴度病毒，應在感染后72 h進行收毒。噬斑純化后的病毒在MDBK細胞上進行5次連續(xù)傳代，經比較各代次之間的病毒滴度發(fā)現(xiàn)，傳至P5代病毒的滴度較之前明顯提高。M基因是BPIV3的分型基因，在本研究中我們擴增出HLJ1的M基因，測序結果表明分離株的M基因為1 056 bp。利用生物學軟件將HLJ1的M基因與GenBank上已發(fā)表的BPIV3參考毒株M基因序列比較后，結果表HLJ1與NX49和SD0835同屬于c基因型。在本研究當中，我們從患呼吸系統(tǒng)疾病的病牛鼻拭子當中成功分離到一株c型BPIV3，我們的結果將為牛副流感病毒3型檢測試劑盒及疫苗的研發(fā)工作奠定基礎。