類紫杉醇脂質(zhì)體體外釋放的槳膜結(jié)合分析法研究

鄭玉婷，洪 濤，徐柯卉，溫明皓，楊吉雪，伍夢瑩，杭太俊，宋 敏

（中國藥科大學(xué)藥物分析系，南京 210009）

脂質(zhì)體是由一個或多個磷脂雙分子層包裹核心水相組成的球形囊泡，它們獨特的兩親性使其能夠裝載各種疏水或親水的生物活性物質(zhì)，具有靶向性、生物利用度高、提高藥物穩(wěn)定性、降低藥物毒性等優(yōu)勢。由于藥物臨床試驗的成本高、風(fēng)險大，通過體外釋放來預(yù)測體內(nèi)行為，可以降低脂質(zhì)體藥物臨床失敗的風(fēng)險。1997 年，美國食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《口服緩釋劑型:體外/體內(nèi)相關(guān)性的開發(fā)、評價和應(yīng)用》（Extended Release Oral Dosage Forms:Development,Evaluation,and Application of In vitro/In vivo Correlations）指南中揭示了體外溶出度檢測的重要意義：（1）提供過程控制和質(zhì)量保證；（2）確定產(chǎn)品隨時間的穩(wěn)定釋放特性；（3）利于監(jiān)管決定[1]。釋放度不僅能區(qū)別不同處方或組成的制劑，還在一定程度上反映了藥物的安全性有效性，故體外釋放是脂質(zhì)體藥物的關(guān)鍵質(zhì)量控制項目之一[2]。

本研究針對創(chuàng)新藥物類紫杉醇脂質(zhì)體凍干粉制劑進行研究。類紫杉醇新藥化學(xué)結(jié)構(gòu)與紫杉醇和多西他賽相似，均具有相同的10-脫乙酰基巴卡?、竽负?，且三者抗腫瘤機制相同，均主要作用于微管和微管蛋白系統(tǒng)從而起到抗腫瘤的作用。由于類紫杉醇的疏水特征，將其包裹在由磷脂、膽固醇合成的膜層結(jié)構(gòu)中制成脂質(zhì)體，可有效降低增溶劑導(dǎo)致的不良反應(yīng)。本品預(yù)期體內(nèi)釋放時間為12 h。在分析現(xiàn)有體外釋放方法的優(yōu)缺點基礎(chǔ)上，結(jié)合本品的特點，進行了分析測定方法的開發(fā)。

離心超濾法效率高、設(shè)備成本低、操作快速；固相萃取法對脂質(zhì)體和游離藥物的分離度較高，可有效去除干擾物質(zhì)，靈敏度高[3]，在體外釋放研究中也有應(yīng)用[4-5]。因此本研究分別采用了離心超濾法、固相萃取法以及透析袋與溶出槳法結(jié)合的方法對類紫杉醇脂質(zhì)體制劑進行釋放度考察。最終發(fā)現(xiàn)將透析袋與溶出槳法結(jié)合效果最佳，簡稱為槳膜結(jié)合法，并對該方法進行了條件優(yōu)化。

1 材 料

1.1 試藥與試劑

自制類紫杉醇原料藥（批號：191104，定量核磁標(biāo)定純度97.75%）；自制類紫杉醇脂質(zhì)體凍干粉（批號：210302、210303、210304，每支20 mg）。

乙腈、甲酸、硫酸、甲酸銨（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、十二烷基硫酸鈉（SDS）（分析純，美國Sigma-Aldrich 公司）；吐溫-80（化學(xué)純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；三乙胺（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；牛血清白蛋白（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：ST023-50 g）；Amicon?Ultra-0.5 超濾離心管（美國Millipore 公司，規(guī)格：30 K）；Oasis HLB 30 μmol/L 固相萃取柱（美國Waters 公司，規(guī)格：60 mg/3 cc）；普通型透析袋3.5 kD（批號：MD3525），普通型透析袋8 ～ 14 kD（批號：MD1425），纖維素透析袋100 kD（批號：SP131414），以上透析袋均購自上海源葉生物科技有限公司；即用型透析袋1 000 kD（美國光譜醫(yī)學(xué)公司，批號：131492）；0.45 μm 水系濾膜（天津津騰試驗設(shè)備有限公司）；0.22 μm 水系濾膜（上海新亞凈化器件廠）。

1.2 儀 器

LC-2010C HT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；BS 110S 型電子分析天平、BS 21S 型電子分析天平，PB-10 普及型pH 計（德國Sartorius 公司）；ZRS-8G 智能溶出試驗儀（天津大學(xué)無線電廠）；MZY-UR30VF 實驗室超純水機（南京妙之儀電子科技有限公司）；KH-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Zetasizer Nano ZS90 激光粒度分析儀（英國Malvern Instruments公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 釋放方法的選擇

將類紫杉醇脂質(zhì)體均勻分散于HEPES 緩沖液中，加入三乙胺硫酸鹽后置37 ℃水浴中振蕩。在適當(dāng)時間點吸取溶液0.5 mL，置于超濾離心管，以14 500 r/min 轉(zhuǎn)速離心30 min 或加在預(yù)處理的Oasis固相柱上分離脂質(zhì)體與游離藥物。

離心超濾法在48 h 釋放度僅為（22.48 ±7.45）%（n= 6），考慮可能是脂質(zhì)體釋放的游離藥物不溶于HEPES 釋放介質(zhì)，導(dǎo)致離心時無法透過濾膜孔徑，而留在了膜內(nèi)，使釋放度測量不準(zhǔn)。故取適量原料藥用含0.5%吐溫80 的HEPES 釋放介質(zhì)溶解后按上述超濾離心法處理，測得結(jié)果發(fā)現(xiàn)超濾膜對游離藥物存在著顯著吸附。游離藥物留在了膜內(nèi)，而未濾過膜外。即使采用游離藥物對超濾膜進行預(yù)飽和，也不能有效消除其吸附作用，使得數(shù)據(jù)測定無法客觀準(zhǔn)確。

固相萃取法48 h 釋放率為（24.5 ± 5.42）%（n= 6），分析原因可能是游離藥物與SPE 小柱在預(yù)處理過程中引入的牛血清白蛋白結(jié)合，導(dǎo)致在淋洗步驟時以藥物-蛋白結(jié)合形式被洗脫下來造成損失。實驗發(fā)現(xiàn)三乙胺硫酸鹽作為釋放劑，主要是增大內(nèi)水相滲透壓使內(nèi)水相中的藥物釋放，而對于分布在脂質(zhì)雙分子層中的類紫杉醇藥物，是否加入三乙胺硫酸鹽對其釋放無影響。

2.2 透析袋截留相對分子質(zhì)量的選擇

裁取6 cm 左右透析袋，兩端以配套的透析夾夾緊并用牛皮筋固定于溶出槳上，照高效液相色譜法（《中華人民共和國藥典》2020 版四部通則0512項下高效液相色譜法）測定。由表1可知透析袋內(nèi)脂質(zhì)體水溶液上樣體積為0.5 mL 和1 mL 釋放最好，更換表面活性劑后24 h 釋放量明顯變大，表明SDS 比吐溫80 更能增大脂質(zhì)體表面磷脂雙分子層的流動性。同時也反映了透析袋截留相對分子質(zhì)量太小導(dǎo)致藥物不能透過的問題，使用1 000 kD的透析袋為最佳。

Table1 In vitro release results of liposomes with dialysis bag in different molecular weight cut-off at 24 h

2.3 釋放介質(zhì)的選擇

在透析袋內(nèi)脂質(zhì)體水溶液的上樣體積為1 mL時，如圖1 所示，分別比較了0.1%、0.3%、0.5%SDS 的PBS 緩沖液和0.1%、0.3%、0.5% SDS 的HEPES 緩沖液作為介質(zhì)的釋放情況，由于0.5%SDS相較于更低濃度的SDS，HEPES 緩沖液相較于PBS緩沖液更能滿足預(yù)期時間的體內(nèi)釋放要求，因此選定SDS 濃度為0.5%、釋放介質(zhì)為HEPES 緩沖液。

Figure1 In vitro drug release curves of paclitaxel derivative liposomes in different dissolution media （, n = 3）

2.4 透析袋內(nèi)脂質(zhì)體水溶液上樣體積考察

由表2 可知在0.5 mL 上樣時累積釋放度的RSD 整體小一些，而且釋放更快。考慮到當(dāng)上樣體積過小時可能會導(dǎo)致移取溶液的誤差變大，重復(fù)性變差，從而使RSD 增大，故選定脂質(zhì)體水溶液上樣體積為0.5 mL的條件下對溶解凍干粉的水溶液體積進行考察。

Table2 In vitro release results of liposomes with 0.5 mL and 1 mL of aqueous solution in dialysis bag (, n = 3)

Table2 In vitro release results of liposomes with 0.5 mL and 1 mL of aqueous solution in dialysis bag (, n = 3)

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2.5 脂質(zhì)體凍干粉溶解體積考察

釋放度考察中一般要求靠前時間點累積釋放度的RSD 可稍大一些（應(yīng)在20%以內(nèi)），其后各時間點的RSD 應(yīng)在10%以內(nèi)，由表3 所示，20 mL 比30 mL 更符合規(guī)定。故最終優(yōu)化條件為以0.5%SDS 的HEPES 作為釋放介質(zhì)，20 mL 純化水溶解脂質(zhì)體凍干粉，透析袋內(nèi)脂質(zhì)體水溶液上樣0.5 mL進行釋放。

Table3 In vitro release results of liposomes with 20 mL and 30 mL of purified water in penicillin bottle(, n = 3)

Table3 In vitro release results of liposomes with 20 mL and 30 mL of purified water in penicillin bottle(, n = 3)

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2.6 體外釋放測定結(jié)果

測定方法見“2.2”項。類紫杉醇脂質(zhì)體在0.5，1，2，4，6，8，12 h 的累計釋放速率分別為（3.71 ±0.68）%、（11.44 ± 1.85）%、（35.39 ± 4.62）%、（78.48 ± 2.82）%、（91.79 ± 2.65）%、（97.28 ±3.3）%和（102.83 ± 2.96）%（n=6）。

2.7 批間重復(fù)性考察

3批脂質(zhì)體制劑在 12 h內(nèi)釋放穩(wěn)定，批次間一致性良好，如圖2所示。自制類紫杉醇脂質(zhì)體整體釋放緩慢，無突釋現(xiàn)象，6 h后累計釋放率逐漸達到平臺。

Figure2 In vitro drug release curves of different batches of paclitaxel derivative liposome （, n = 6）

2.8 區(qū)分能力考察

藥物釋放時間依賴于磷脂含量，磷脂含量越高，藥物釋放越慢。釋藥曲線差異源于兩種處方中藥脂比不同，由于處方1 中磷脂含量比處方2 約低9%，故在12 h內(nèi)釋放速率較高。圖3表明，本方法對不同處方的脂質(zhì)體體外釋放具有區(qū)分能力。

Figure3 In vitro drug release curves of paclitaxel derivative liposome with different formulas （, n = 6）

2.9 不同pH條件考察

由于脂質(zhì)體進入體內(nèi)會受到巨噬細(xì)胞和外周巨細(xì)胞的吞噬，這些細(xì)胞會產(chǎn)生酸性和其他物質(zhì)以加速脂質(zhì)體降解，使細(xì)胞與脂質(zhì)體界面的pH 小于7，故考察了釋放介質(zhì)在pH 6.5 和pH 7.4 條件下藥物釋放情況。結(jié)果見圖4。4 h前pH 6.5釋放得快，4 h 后pH 7.4 釋放略快于pH 6.5，釋放曲線的差異反映了介質(zhì)pH 對脂質(zhì)體體外釋放的影響，提示體內(nèi)環(huán)境變化對脂質(zhì)體體內(nèi)釋藥可能的作用。

Figure4 In vitro drug release curves of paclitaxel derivative liposome under different pH conditions （, n = 6）

3 討 論

本研究為建立類紫杉醇藥物在12 h 內(nèi)從脂質(zhì)體中完全釋放的方法，在釋放方法、透析袋截留相對分子質(zhì)量、透析袋膜材和表面活性劑等多個方面進行了優(yōu)化，結(jié)果表明類紫杉醇脂質(zhì)體在體外具有良好的緩釋作用。該方法可用于評估非水溶性藥物脂質(zhì)體制劑的體外擴散動力學(xué)、測試產(chǎn)品質(zhì)量的一致性、建立體外/體內(nèi)行為的相關(guān)性，為脂質(zhì)體制劑評價影響藥物質(zhì)量的工藝變更提供有用的反饋。

3.1 透析袋截留相對分子質(zhì)量的確定

Xu 等[6]提出在脂質(zhì)體不能透過的前提下，透析袋的截留相對分子質(zhì)量應(yīng)為藥物相對分子質(zhì)量的100 倍，否則會使透過效率變低。然而，實驗結(jié)果表明100 kD 的透析袋也未達到相對分子質(zhì)量約為1 000 的類紫杉醇期望的釋放量，為使藥物盡快釋放，繼續(xù)考察更大孔徑的透析袋。經(jīng)測定類紫杉醇脂質(zhì)體粒徑為（93.81 ± 1.722）nm，美國光譜醫(yī)學(xué)1 000 kD 透析袋的孔徑大約為70 nm，對于本研究中粒徑分布集中在75 ～ 150 nm 的類紫杉醇脂質(zhì)體不能通過，只有當(dāng)類紫杉醇藥物從脂質(zhì)體中釋放出來進入溶液中時才能進行擴散，因此本研究中選用的1 000 kD 透析袋符合預(yù)期釋放要求。

3.2 透析袋膜材比較

試驗中嘗試了不同品牌、不同孔徑的纖維素酯膜（cellulose ester, CE）和再生纖維素膜（regenerated cellulose, RC），如表4 所示，再生纖維素膜作為親水性膜不會對類紫杉醇造成吸附，然而其無法使脂質(zhì)體達到12 h 完全釋放。雖然纖維素酯膜對類紫杉醇藥物有吸附，但是試驗表明可通過0.5% SDS的水溶液洗滌數(shù)次以消除藥物殘留。

Table4 In vitro release results of paclitaxel derivative liposomes with different brands of dialysis bags(, n = 6)

Table4 In vitro release results of paclitaxel derivative liposomes with different brands of dialysis bags(, n = 6)

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3.3 表面活性劑的選擇

在槳膜結(jié)合法的介質(zhì)選擇方面，基于自制類紫杉醇藥物的非親水性特征，考慮在釋放溶液中加入表面活性劑來增大磷脂膜流動性促進藥物釋放。擬定表面活性劑須滿足3點要求：一是符合漏槽條件；二是要達試驗預(yù)期釋放量；三是表面活性劑的濃度要盡可能低以更好模擬體內(nèi)生理環(huán)境。實驗測得SDS 對類紫杉醇原料藥的浸潤性較好，能明顯增加原料藥在水性介質(zhì)中的溶解度，比吐溫80 更能促進類紫杉醇藥物釋放，故SDS 適合作為類紫杉醇脂質(zhì)體體外釋放試驗的表面活性劑。

4 結(jié) 語

近年來脂質(zhì)體技術(shù)迎來新的突破，例如脂質(zhì)納米粒、長循環(huán)脂質(zhì)體、pH 敏感脂質(zhì)體、溫度敏感脂質(zhì)體、磁性脂質(zhì)體和免疫脂質(zhì)體等[7]。由于包載藥物性質(zhì)及脂質(zhì)體制劑功能的不同，體外釋放方法不一而足。觸發(fā)釋放行為、分離包封與游離藥物、檢測分析手段是開發(fā)釋放方法需要考慮的3個因素。透析法[8-14]是目前最受熱衷的方法，然而對于快釋制劑，藥物跨越透析膜可能是限速步驟[15]。無透析袋的取樣分離法[4,16-18]需要保證脂質(zhì)體與游離藥物分離完全；不使用分離手段而直接檢測藥物釋放的電化學(xué)法[19]、熒光法[20-21]則要求藥物具備檢測特殊性。透析適配器技術(shù)[2]和分散釋放器技術(shù)[22-23]已經(jīng)被證明改善了膜滲透限速的影響，且使用了藥典規(guī)定的溶出設(shè)備，為體外釋放儀器的商業(yè)化生產(chǎn)、規(guī)范化使用、制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。實驗中發(fā)現(xiàn)，透析袋質(zhì)量參差不齊，必要時應(yīng)對透析袋進行篩選比較。透析膜的截留相對分子質(zhì)量和儀器自動化程度限制了脂質(zhì)體釋藥試驗的進一步優(yōu)化。藥物體外擴散研究方法的選擇需要結(jié)合具體藥物分析，從而推動配方開發(fā)、臨床治療和結(jié)果預(yù)測。