PCR 技術在實驗動物細菌檢測中的應用進展

席曉霞，孫 婧，段天林，田永剛，王 芳，張麗娟，張景科，王德貴

（1.蘭州大學實驗室與設備管理處醫(yī)學實驗中心，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學基礎醫(yī)學院，甘肅 蘭州）

生命科學領域的教學、科研、檢定、安全評價和成果鑒定，幾乎都離不開實驗動物，實驗動物的重要作用無可替代。實驗動物的質量直接影響著科學實驗的準確性和實驗動物從業(yè)人員的健康。目前評價實驗動物質量的主要評判標準之一是微生物質量控制，定期對實驗動物進行微生物質量監(jiān)測是確保實驗動物質量的重要手段。近年來，中國實驗動物質量監(jiān)測結果顯示，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯桿菌等有陽性結果的發(fā)生，對實驗動物質量的控制造成困擾[1-8]。

屏障環(huán)境實驗動物微生物質量檢測主要依據(jù)GB 14922.2-2011《實驗動物微生物學等級及監(jiān)測》的檢驗流程進行操作，其主要方法是傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生化鑒定。該方法不僅花費時間長、操作步驟相對繁雜、結果判定受主觀人為因素影響較大，對一些難以培養(yǎng)的致病細菌也無法進行檢測[9]。此外，實驗動物在飼養(yǎng)繁殖過程中容易感染各種易感病原，從而導致疾病的暴發(fā)和流行，嚴重影響經(jīng)濟效益和公共衛(wèi)生，存在很多的安全隱患。因此，建立一種快速、敏感、經(jīng)濟、易于標準化操作的檢測技術并納入實驗動物微生物檢測國家標準尤為重要。

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，對實驗動物細菌檢測的技術也隨之上升到了基因水平，其檢測、分類的方式日漸增多，特別是基于PCR 的檢測技術，因其敏感度高、快速且簡便、特異性較強而被廣泛應用于實驗動物的細菌檢測。鑒于PCR 技術在實驗動物細菌學研究中的重要性，本文對PCR 技術在實驗動物細菌檢測中的應用進展綜述如下。

1 普通PCR 技術的應用

1985 年Mullis 發(fā)明了聚合酶鏈式反應技術，通過體外模擬DNA 合成過程，可以對目的基因片段進行指數(shù)級擴增，使得在體外進行核酸片段的無限擴增成為可能[10]。1995 年唐瀏英等發(fā)現(xiàn)用PCR 方法檢查血細胞中的抗原可對布氏菌感染做到早期診斷，且該技術具有敏感性高、特異性好、快速等優(yōu)點[11]。2000 年唐永姣等應用PCR技術對甘肅省阿克賽縣和玉門市的鼠疫樣品進行檢測，均呈現(xiàn)陽性，且有較高特異性[12]。

2 多重PCR 技術的應用

多重PCR 是以普通PCR 為基礎，同時加入多對引物，可同時擴增出多個目的基因，從而達到對多種病原菌同時進行檢測的目的，具有高靈敏度、高度特異敏感、低成本等優(yōu)點，既能節(jié)省試劑又能縮短檢測時間[13-14]。

多重PCR 實現(xiàn)了在同一反應體系對多種病原微生物進行檢測或具體類型的鑒別診斷，在臨床上具有很高的應用價值。陸紅玉等建立了適合三種致病菌快速檢測的多重PCR 方法，這三種致病菌分別是沙門氏菌、小腸結腸炎耶爾森菌以及食蟹猴志賀氏菌。從這三種致病菌混合感染的標本中，檢測出不同的病原菌，且細菌檢出率高于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，說明該方法具有很高的特異性和檢測靈敏度，且具有很強的實用性和潛在的發(fā)展力[15]。馮杰等針對肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌同時進行了培養(yǎng)法和PCR 法檢測。通過比較發(fā)現(xiàn)，PCR 法檢出率略高于培養(yǎng)法，在檢測耗時方面，采用國標推薦的分離培養(yǎng)法，其全程檢測時間至少需要3～7 d 時間，而PCR 檢測法僅需1 d 時間即可完成[16]。王鵬飛等建立了肺支原體、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的多重PCR 檢測方法，該方法對三種菌的檢測靈敏度為1～10 pg[17]。祝巖波等建立了肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的多重PCR 檢測方法，用該方法檢測了76 份感染的實驗動物糞便標本，其最低檢測靈敏度能達到10 pg[18]。張越華等建立的4 重PCR 方法能對同一樣品中的4種致病菌模板進行特異性擴增，無交叉反應，其檢測靈敏度為3～10 ng，該方法也可以從混合感染的病料中特異性地檢測出4 種致病菌[19]。

3 實時熒光定量PCR 技術的應用

實時熒光定量PCR 檢測技術是利用熒光信號的變化實時檢測PCR 擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最終對起始模板進行定量分析。在PCR 反應過程中，隨著反應產(chǎn)物的累積，對應的熒光信號強度也隨之增強。通過收集每一個循環(huán)的熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，得到熒光擴增曲線圖。

王立鵬等分別用細菌分離培養(yǎng)生化鑒定法和Dole qPCR 法對國內多家機構提供的SPF 級小鼠和大鼠進行檢測，后者不僅檢岀培養(yǎng)法檢測的所有陽性樣本，而且陽性檢岀率遠高于培養(yǎng)法，Dole qPCR 方法直接檢測組織樣本的敏感度和特異度比傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法均大大提高[20]。陽成波等建立了一種基于TaqMan 探針的實時定量PCR方法，建立了一種用于快速、高效的定量檢測空腸彎曲菌的方法[21]。

4 巢式PCR 技術的應用

巢式PCR 反應技術一般需要兩對PCR 引物。第一對引物用于普通PCR 擴增。第二對引物用于結合在第一次PCR 產(chǎn)物的內部，進行二次擴增。該方法的優(yōu)勢是最大程度地降低擴增錯誤率，使得巢式PCR 保持了較高的特異性。

潘雅君等為了檢測實驗動物常見肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜肺巴斯德桿菌和綠膿桿菌，提出一種可更準確、靈敏、快速、簡便的多重巢式PCR 方法。根據(jù)待檢微生物16S rDNA序列的保守區(qū)和可變區(qū)分別設計通用引物和特異引物，通過兩種引物長短差異化創(chuàng)新設計，將模板富集和特異片段擴增兩個過程整合為單個反應體系內的一步PCR 反應。結果表明，多重巢式PCR 方法能夠在標準株DNA 混合模板中同時擴增出4 條待檢測片段，而在陰性對照組中未檢測出任何片段。多重巢式PCR 方法在實際檢測應用中能夠成功檢測出細菌感染陽性樣本，且未擴增出其他微生物的特異性條帶。建立的多重巢式PCR 體系可以同時檢測實驗動物咽拭子等臨床樣本中的多種病原菌，與常規(guī)多重PCR 方法相比，該方法具有特異性和靈敏度高、操作簡便、節(jié)省時間等優(yōu)點[22]。

5 數(shù)字PCR 技術及其應用

數(shù)字PCR 技術是一種能夠進行絕對定量的核酸檢測技術，目前應用廣泛的是微滴式數(shù)字PCR，其工作原理是把DNA 稀釋至較低濃度，形成微滴狀態(tài)，隨后開始PCR 擴增，通過計算陽性微滴的數(shù)目，依據(jù)泊松分布從而計算出樣本中的DNA 分子數(shù)[23]。相關文獻表明，與熒光定量PCR 相比，該技術成本低、靈敏度高、定量不依賴于標準曲線，對反應抑制物的耐受能力也更高，可實現(xiàn)DNA 的絕對定量。數(shù)字PCR 對核酸含量較低的樣品檢測準確率和靈敏度均較高[24-25]。

目前實驗動物細菌檢測的“金標準”仍然是熒光定量PCR 技術，但依賴于標準曲線的Ct值，而在繪制標準曲線的標準品時缺乏統(tǒng)一的計量標準。然而數(shù)字PCR 技術綜合了熒光定量PCR 和基因芯片的高通量的高精準性，并且不依賴標準物質定量，實現(xiàn)了單分子DNA 絕對定量，能夠對目標基因的濃度進行精準分析，目前已被科研人員大量應用于難培養(yǎng)和高風險的致病菌檢測研究中，如沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副豬嗜血桿菌、結核分支枝桿菌、豬鏈球菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌等[26-33]。

6 討論

PCR 基因擴增技術除了用于食品安全和畜牧業(yè)檢測，還廣泛應用于實驗動物細菌學的檢測。然而PCR 技術也存在很多影響因素，一方面PCR 技術提高檢測靈敏度的同時，對其檢測中的錯誤也有放大作用，實驗過程中的隨機誤差易導致假陽性和假陰性結果的出現(xiàn)；另一方面，處理樣本會對實驗環(huán)境造成污染，電泳的EB 染料會危害人的健康，因此在操作過程中要做好防護，嚴格按實驗室的分區(qū)進行實驗。對于PCR 檢測結果的報告要慎重，必須在有相應嚴格質控措施（如陰、陽性質控等）的情況下重復測定，方可作出報告。

針對PCR 技術的優(yōu)缺點，目前建立了許多檢測病原菌的新型檢測方法，均是將兩種或兩種以上的方法相結合，如PCR 技術與LAMP、基因芯片等技術結合，取長補短，提高動物病原檢測的靈敏性、可重復性，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)法操作繁瑣、耗時費力、不適用于無法培養(yǎng)的微生物、檢測周期較長、對檢測人員專業(yè)技能要求較高等缺點[34-35]，通過一次操作完成多種病原體的檢測，實現(xiàn)靈敏、特異、快速和高效的目的，實現(xiàn)了大批量實驗動物病原樣本的檢測、混合感染樣品基質中的多種微生物的有效檢測、實驗動物檢測的標準化，這些新的檢測方法必將在未來實驗動物病原檢測中發(fā)揮很好的檢測作用。PCR 檢測方法在效率和敏感性上均具有較大優(yōu)勢，適合用于實驗動物細菌感染的快速診斷和大規(guī)模的質量篩查[36-39]。

目前多種多重PCR 系統(tǒng)逐步應用于臨床，檢測耗時3～10 h，成為當下病原菌快速診斷的主流工具[40-47]。其中在稀有突變樣本檢測、微量核酸樣本檢測、表達量差異鑒定等方面，數(shù)字PCR表現(xiàn)出的優(yōu)勢非常明顯。在基因表達研究、microRNA 研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、單細胞基因表達、癌癥標志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定等諸多方面具有廣闊研究前景[48-49]。

PCR 技術因檢測快速、高效、靈敏、特異等優(yōu)點在實驗動物細菌檢測方面具有較高的價值，已作為一個較為成熟的技術進行廣泛的推廣應用，尤其適合于實驗動物大規(guī)模的質量檢測和細菌感染的快速診斷。但目前尚未納入國家標準，還需要進一步對其方案進行改進、細化、具體化、合理化。相信在不遠的將來，PCR 技術將越來越成熟，盡早納入國家標準，應用于實驗動物質量檢測等工作。