抗生素抗性基因及其消除策略

李 奎,周心晨,韓新燕

(1.浙江省畜牧技術(shù)推廣與種畜禽監(jiān)測總站,浙江 杭州 310017;2.海南浙江大學(xué)研究院,海南 三亞 572000;3.浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310058)

自1929年青霉素面世以來,抗生素這類由某些微生物在生活過程中產(chǎn)生的、對某些其他病原微生物具有抑制或殺滅作用的化學(xué)物質(zhì),逐漸走入大眾視野。由于其抑菌和促生長的特性,抗生素被廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)療和畜牧生產(chǎn)中。在近一個(gè)世紀(jì)中,為改善人類及動物健康作出了巨大貢獻(xiàn)。然而,抗生素在幫助動物對抗病原菌感染和擴(kuò)散的同時(shí),也帶來了藥物殘留和耐藥性的問題,會造成環(huán)境污染,并且能作用于腸道菌群,影響動物健康。

為了維護(hù)人類、動物健康和良好生態(tài)環(huán)境,各國開始限制、禁用飼用抗生素。中國也積極響應(yīng),自2020年元旦起就已停止生產(chǎn)和進(jìn)口相應(yīng)獸藥產(chǎn)品,注銷抗生素獸藥產(chǎn)品的批準(zhǔn)文號和進(jìn)口獸藥注冊證書,同年7月1日起禁止所有促生長類藥物飼料添加劑(除中藥外)的生產(chǎn)[1]。

抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)是使抗生素作用效果減弱的“罪魁禍?zhǔn)住?。ARGs是微生物攜帶的可使其暴露于一種或多種抗生素環(huán)境中而不被殺死的基因。經(jīng)過研究,ARGs的產(chǎn)生、種類和耐藥機(jī)制都已被逐步探明,檢測方法也隨著時(shí)代發(fā)展不斷進(jìn)步。隨著粘菌素抗性基因mcr被發(fā)現(xiàn)及其在人畜間和社區(qū)間的傳播性被證實(shí),“最后一道防線”粘菌素被突破[2-4]。在無抗生素可用的風(fēng)險(xiǎn)下,抗生素抗性基因消除策略成為當(dāng)下及未來一段時(shí)間內(nèi)的研究熱點(diǎn)。本文系統(tǒng)總結(jié)了21世紀(jì)以來ARGs的消除策略,以期為該領(lǐng)域的后續(xù)研究提供理論參考。

1 ARGs作用機(jī)制

1.1 ARGs的產(chǎn)生

從進(jìn)化生態(tài)學(xué)的角度考慮,大多數(shù)臨床抗生素是在藥用抗生素使用時(shí)代之前就存在的天然微生物產(chǎn)物的衍生物,通常存在于土壤微生物的化學(xué)庫中。相應(yīng)地,對這些化合物的耐藥性也是在很久以前的自然環(huán)境中進(jìn)化出來的[5]。耐藥菌和敏感菌在土壤環(huán)境中共存了很長時(shí)間,但沒有占據(jù)主導(dǎo)地位?？股乜剐曰蚩煞譃楣逃锌剐院瞳@得性抗性2種類型。固有抗性是指細(xì)菌本身通過遺傳獲得的抗性基因序列,是微生物在長期進(jìn)化過程中獲得的對抗生素表現(xiàn)出抗性的性狀。而獲得性抗性是指微生物通過水平轉(zhuǎn)移方式從外界獲得的抗性基因序列,在自身體內(nèi)表達(dá)而產(chǎn)生的抗生素抗性性狀。一般地,細(xì)菌自發(fā)突變的概率為10-6～10-8,而且很不穩(wěn)定,而突變獲得對不同藥物的多重抗生素抗性的概率更低[5]。因此在抗生素的選擇壓力條件下,通過質(zhì)粒、整合子和轉(zhuǎn)座子等載體介導(dǎo)的抗性基因的水平轉(zhuǎn)移是造成今天抗性基因廣泛傳播的的重要原因[6]。

1.2 ARGs的種類

目前,我國養(yǎng)殖場廢水、污水處理廠、河流、細(xì)菌體內(nèi)、飲用水、沉積物、土壤、空氣等不同的環(huán)境介質(zhì)中,至少已發(fā)現(xiàn)有39種四環(huán)素類抗性基因(tet)、4種磺胺類抗性基因(sul)和10種β-內(nèi)酰胺類抗性基因(NDM-1),以及部分喹諾酮類抗性基因(qnr)、大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因(erm)和整合基因(int)[7]。

1.3 ARGs的發(fā)現(xiàn)方法

20世紀(jì)90年代,分子生物學(xué)技術(shù)和設(shè)備的出現(xiàn)與傳播使人們發(fā)現(xiàn)了新ARGs和許多變體。傳統(tǒng)的鑒定方法包括克隆、誘變、轉(zhuǎn)座子誘變、功能基因組學(xué)方法等。到了下一代測序時(shí)代,DNA測序的成本下降,可通過全基因組測序、宏基因組、功能宏基因組學(xué)方法分離和檢測新ARGs。在將下一代測序引入臨床微生物學(xué)時(shí),數(shù)據(jù)分析成了主要挑戰(zhàn)。生物信息學(xué)分析工具的發(fā)明與應(yīng)用使ARGs發(fā)現(xiàn)進(jìn)入生物信息學(xué)時(shí)代。此時(shí)可使用電阻分析、蛋白質(zhì)建模、目的基因的合成等方法來預(yù)測新的ARGs,但仍需經(jīng)過生物學(xué)驗(yàn)證[8]。

1.4 ARGs的耐藥機(jī)制

ARGs主要有3個(gè)作用機(jī)制:一是細(xì)菌外膜孔蛋白基因的突變和表達(dá)水平的降低,降低孔蛋白對抗生素的敏感性,從而降低細(xì)菌外膜的通透性,減少藥物進(jìn)入細(xì)菌,并在染色體編碼的外排泵的協(xié)同作用下,外排抗生素,使細(xì)胞內(nèi)抗生素濃度下降;二是基因突變或翻譯后修飾原本對抗生素具有高親和力的作用靶點(diǎn),降低抗生素作用靶點(diǎn)對抗生素的親和力,同時(shí)不影響靶點(diǎn)的正常功能;三是編碼修飾酶或水解酶,給抗生素加上基團(tuán)來改變其結(jié)構(gòu),或者水解破壞抗生素結(jié)構(gòu),使抗生素失活[9-11]。

2 ARGs的消除策略

2.1 物理和化學(xué)方法

2.1.1 吸附法 過去人們考慮ARGs的消除策略時(shí),更多是從環(huán)境的角度,減少環(huán)境廢水和空氣中的抗生素殘留,因此發(fā)明了一系列物理、化學(xué)方法。關(guān)于使用金屬或納米粒子、碳納米管和沉積物吸附去除抗生素的研究很多[12-15]。然而,天然或改性吸附劑在經(jīng)濟(jì)可行性、適用性、去除效率和再生方面都存在缺陷。Aydin等[16]評估了四氧化三鐵-赤泥-納米粒子從傳統(tǒng)市政污水處理廠收集的污水樣品中去除抗生素的吸附效果,發(fā)現(xiàn)這種吸附劑具有良好的效果。在該研究中,通過間歇吸附試驗(yàn)研究了四氧化三鐵-赤泥-納米粒子吸附劑的赤泥含量、pH、接觸時(shí)間、吸附劑用量、溫度和其他參數(shù)對環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)的影響。根據(jù)之前的分析,四氧化三鐵-赤泥-納米粒子的磁分離被認(rèn)為是去除抗生素的有效方法。

氧化鎂-氧化鋅(ZnO-MgO)納米復(fù)合材料和MgO納米顆粒具有成本低、易合成的特點(diǎn),同樣可用于去除抗生素[17]。因此,Zhang等[18]研究了氧化鎂(ZnO)納米顆粒和氧化鋅(MgO)納米復(fù)合材料對利奈唑胺的吸附。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)的RSM研究了吸附劑用量、pH值和溫度對利奈唑胺吸附性能的影響。結(jié)果表明,使用無毒吸附劑,通過簡單的程序可以在短時(shí)間內(nèi)有效去除大量利奈唑胺(90%),表明ZnO-MgO納米復(fù)合材料和 MgO 納米顆粒的聯(lián)合作用是一種靈敏、有效和高效的吸附劑。

生物炭和活性炭是具有高吸附力的碳質(zhì)材料,被廣泛應(yīng)用于吸附污染物[19-20]。Kim等[21]評估了添加蘋果樹衍生生物炭(biochar derived from apple tree,AB)的活性污泥系統(tǒng)對CIP的去除性能,AB以10%、20%和40%的不同比例添加到活性污泥生物反應(yīng)器中,CIP的減少和消除(高達(dá)94%)主要?dú)w因于AB的吸附,CIP去除率與AB的添加量有關(guān)。吸附動力學(xué)和等溫分析表明吸附過程涉及粒子內(nèi)擴(kuò)散、π-π電子-供體-受體相互作用、疏水性相互作用和靜電引力。馬佳瑩等[22]使用食物垃圾和雞糞作為基質(zhì),研究了厭氧消化(anaerobic digestion,AD)過程中粉狀活性炭(powdered activated carbon,PAC)產(chǎn)生甲烷和去除抗生素的機(jī)制,表明在厭氧共消化反應(yīng)器中添加AC可以增加甲烷產(chǎn)量,同時(shí)去除各種抗生素,抗生素濃度的降低主要?dú)w因于PAC的物理吸附和細(xì)菌的滅活。

2.1.2 高級氧化法 在吸附劑中添加合適的降解酶可以提高抗生素去除效率。Sun等[23]用固定化漆酶修飾的中空介孔碳球(hollow mesoporous carbon sphere,HMCs)探索蟲膠在降解過程中抗生素和氧化還原介質(zhì)刺激作用下的降解機(jī)制。結(jié)果表明,二羥基化和去甲基化是鹽酸四環(huán)素(tetracycline hydrochloride,TCH)的主要降解反應(yīng),哌嗪取代基氧化和羥基化是鹽酸環(huán)丙沙星(ciprofloxacin hydrochloride,CPH)的主要降解反應(yīng)。此外,添加3 mm磺胺類抗生素(sulfonamide antibiotics,SA)氧化還原介質(zhì)后,固定化蟲膠對TCH和CPH的去除效率分別為99.4%和96.9%。

Hou等[24]設(shè)計(jì)了一個(gè)由缺氧-好氧(anoxic-aerobic,A/O)池、上流式厭氧污泥床(upflow anaerobic sludge blanket,UASB)和4個(gè)獨(dú)立的高級氧化工藝(advanced oxidation process,AOP)組成的實(shí)驗(yàn)室模擬反應(yīng)器,從實(shí)際的制藥廢水中同時(shí)去除了18種抗生素和10種ARG。CAO等[25]系統(tǒng)地研究了零價(jià)鐵(Fe0)過硫酸鹽(peroxymonosulfate,PMS)對四環(huán)素的降解,結(jié)果表明,在最佳條件下,四環(huán)素在5 min內(nèi)去除率達(dá)到88.5%。其反應(yīng)機(jī)理表明四環(huán)素通過活性氧的氧化和少量吸附被去除。Xu等[26-27]制備了氧化石墨負(fù)載的CoFe2O4(CoFe2O4-EG)作為多相催化劑來活化PMS,進(jìn)而催化磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole,SMX)的降解,SMX去除率在20 min內(nèi)高達(dá)99%;又通過水熱法成功構(gòu)建了膨脹石墨固定鎳鐵氧體(NiCo2O4),并通過PMS活化法將其應(yīng)用于模型廢水中SMX的降解。它被證明具有高催化活性(99.9%)、高礦化率(32.4%)和低離子浸出率。

除了上述吸附法、高級氧化法以外,還有過濾法、絮凝法,以及基于一定條件的組合策略如溶膠-凝膠法、臭氧和光催化法、紫外線照射和光催化法等等[28]。

2.2 生物方法

2.2.1 高溫堆肥法 如何有效去除畜禽糞便中的抗生素是近年來環(huán)境科學(xué)研究的熱點(diǎn)。高溫堆肥作為處理有機(jī)固體廢物(如畜禽糞便污泥和城市生活垃圾)的有效方法,在國內(nèi)外得到廣泛研究和應(yīng)用。最近關(guān)于從牲畜糞便堆肥中去除抗生素的研究主要集中在四環(huán)素,其他類型的研究較少。僅有Xia等[29]、Yang等[30]進(jìn)行了從肉雞糞便中去除氟喹諾酮類抗生素的堆肥試驗(yàn),但抗生素濃度和堆肥時(shí)間對抗生素去除率的影響并不顯著。Xie等[31]指出,堆肥過程包括復(fù)雜的微生物動力學(xué),這取決于堆肥的材料和條件。因此,堆肥對減少糞便攜帶的ARGs的影響因不同的研究而異。為了確定堆肥設(shè)施的大氣環(huán)境對ARGs豐度的影響,Cui等[32]進(jìn)行了半透膜覆蓋的高溫堆肥和污泥的傳統(tǒng)高溫堆肥。與常規(guī)高溫堆肥的結(jié)果相比,半透膜覆蓋的高溫堆肥處理后ARGs的總豐度下降了42.1%。周順桂團(tuán)隊(duì)開發(fā)了UTM超高溫好氧發(fā)酵技術(shù),研究表明超高溫堆肥發(fā)酵溫度高,發(fā)酵速度快,且具有更高效、更迅速的ARGs去除效果[33]。本課題組的研究也發(fā)現(xiàn),不同的糞便處理方法會引起ARGs的不同變化,但ARGs的總豐度會降低,且厭氧堆肥對ARGs的清除效果比厭氧消化更好[34]。

2.2.2 生物去除法 Bai等[35]進(jìn)行了利用假單胞菌H117去除TC、硝酸鹽、Mn(II)、生物錳氧化物(biological manganese oxide,BMO)和磁性BMO(magnetic biological manganese oxide,MBMO)的研究,結(jié)果表明,該菌株在96 h內(nèi)對TC(68.86%)、硝酸鹽(100%)和Mn(II)(64.64%)的去除率較高,而對BMO和MBMO的去除率分別為91.29%和96.63%。

3 小 結(jié)

抗生素抗性基因的進(jìn)入會導(dǎo)致菌群結(jié)構(gòu)的改變,并隨菌群的演替富集在其生存環(huán)境中,隨菌群的遷移而遷移?？剐曰蜃鳛橐环N新型的污染物,應(yīng)從污染源頭和傳播兩方面入手消除,即抗性基因宿主菌群和基因水平轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用的可移動遺傳元件。目前的方法不同程度地降低了污水、污泥、糞便中抗性基因豐度,但增加了污染治理的成本,研究人員應(yīng)考慮從源頭減少抗性基因的產(chǎn)生。在畜牧業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)上,減少飼料中抗生素添加劑的使用,以降低抗生素對菌群的選擇壓力,降低抗性基因的水平轉(zhuǎn)移。考慮能否開發(fā)能降低抗性基因產(chǎn)生并對畜禽無害的添加物,以達(dá)到從源頭消減抗性基因污染的目的。未來的研究方向,一方面是開發(fā)抗生素替代物,減少抗生素的使用;另一方面是優(yōu)化污水污泥處理工藝,最大程度地消除抗性基因污染。