椰子油對(duì)海南黑山羊羔羊瘤胃上皮發(fā)育的影響

施力光,張 雨,吳靈麗,曹 婷,侯冠彧,周漢林

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所,海南 儋州 571737;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷 030801;3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 湛江實(shí)驗(yàn)站,廣東 湛江 524013)

瘤胃作為反芻動(dòng)物攝入飼草料的“處理工廠”,70%以上的可消化物質(zhì)和50%以上的粗纖維都能夠通過(guò)瘤胃微生物的發(fā)酵和降解轉(zhuǎn)化成能被其自身利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),因而瘤胃結(jié)構(gòu)和功能的完整是反芻動(dòng)物正常生長(zhǎng)發(fā)育以及產(chǎn)肉產(chǎn)奶的重要保障。瘤胃上皮(乳頭)作為瘤胃發(fā)酵機(jī)能重要的功能單元,與反芻動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育及其生產(chǎn)性能表現(xiàn)密切相關(guān)[1]。研究已證實(shí),新生的幼齡反芻家畜瘤胃未發(fā)育完全,隨著日齡增長(zhǎng)和植物性飼料的攝取,瘤胃的功能才日趨完善,幼齡反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育的形態(tài)學(xué)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化代謝和成年后生產(chǎn)性能的發(fā)揮具有重要參考意義,且斷奶日齡[2]、飼料組成[3]、瘤胃內(nèi)環(huán)境[4]、疾病和中毒等[5]因素都會(huì)影響反芻動(dòng)物瘤胃上皮的發(fā)育。Sun等[6]通過(guò)斷奶前綿羊開(kāi)食料的誘食使瘤胃上皮IGF-I和cyclin mRNA表達(dá)水平增加,進(jìn)而促進(jìn)瘤胃上皮發(fā)育;Debruyne等[7]在羔羊飼料中添加椰子油對(duì)瘤胃發(fā)育有顯著的刺激作用和抑制甲烷生成的調(diào)控效果;閆小蘭等[8]通過(guò)改變羔羊飼糧的氮硫比有效地促進(jìn)瘤胃發(fā)育和改善羔羊瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu);Wang等[9]在犢牛日糧中添加皂甙也改變了微生物的定植并產(chǎn)生持久影響。椰子油是一種富含大量中短鏈飽和脂肪酸植物油脂,可直接通過(guò)自由擴(kuò)散的形式被腸道上皮吸收,既可以作為一種飼料營(yíng)養(yǎng)成分添加使用,又能作為功能性添加劑調(diào)控瘤胃機(jī)能性。然而關(guān)于椰子油調(diào)控幼齡家畜瘤胃發(fā)育的研究相對(duì)較少?；诖?在課題組前期體外模擬發(fā)酵試驗(yàn)證實(shí)椰子油對(duì)體外發(fā)酵有明顯調(diào)控效果的基礎(chǔ)上[10],本試驗(yàn)以海南黑山羊羔羊?yàn)檠芯繉?duì)象,在日糧中添加椰子油,觀察瘤胃早期發(fā)育的影響,以期為早期營(yíng)養(yǎng)干預(yù)幼齡反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選用24只10日齡海南黑山羊羔羊,平均體重2.05±0.16 kg,體質(zhì)健康,由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所海南黑山羊種羊場(chǎng)提供。試驗(yàn)羔羊隨機(jī)分成4個(gè)處理,每組6個(gè)重復(fù),Ctrl組為對(duì)照組,僅飼喂基礎(chǔ)日糧,LCO組飼喂基礎(chǔ)日糧+4 g/d椰子油,MCO組飼喂基礎(chǔ)日糧+6 g/d椰子油,HCO組飼喂基礎(chǔ)日糧+8 g/d椰子油?；A(chǔ)日糧組成為代乳粉+精料+鮮王草,代乳粉購(gòu)于北京精準(zhǔn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中心,椰子油購(gòu)于海南品椰品實(shí)業(yè)有限公司。精料由種羊場(chǎng)自配,組成成分及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)飼養(yǎng)周期90 d,分2個(gè)階段進(jìn)行,10～70日齡采用人工哺乳的方式專(zhuān)人負(fù)責(zé)定時(shí)投喂,其中代乳粉經(jīng)溫水溶解后,飼喂量為羔羊體重的2 %,椰子油通過(guò)一次性注射器直接飼喂到羔羊口中,精料和鮮草則按照50∶50的比例(干物質(zhì)基礎(chǔ))提供給羔羊自由采食,每日飼喂2次,晨飼07:00,晚飼17:00,自由飲水。70日齡斷奶后,除停止飼喂代乳粉,飼養(yǎng)管理同前。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

90 d試驗(yàn)期結(jié)束后,每個(gè)組6只羔羊全部屠宰,按照趙有璋[11]的方法,宰前禁食禁水稱(chēng)重,頸靜脈放血致死后剝離毛皮進(jìn)行常規(guī)屠宰性能測(cè)定。瘤胃清除內(nèi)容物后選取背囊和腹囊中心區(qū)域約2 cm2樣品5～6塊,PBS沖洗后進(jìn)行乳頭計(jì)數(shù)和密度測(cè)定,另取1 cm2瘤胃組織4%多聚甲醛室溫固定24 h,用于切片制作。

1.3 瘤胃器官指數(shù)和體積測(cè)定

瘤胃內(nèi)容物清空后,將幽門(mén)扎緊,從賁門(mén)處向瘤胃內(nèi)充滿(mǎn)自來(lái)水,用量筒測(cè)定用水體積,記為瘤胃體積;瘤胃器官指數(shù)為瘤胃重占宰前活重的百分比。

1.4 瘤胃上皮乳頭密度測(cè)定

準(zhǔn)確量取2 cm2的瘤胃上皮,體視鏡下計(jì)數(shù)乳頭的數(shù)量,每只羔羊體測(cè)定5個(gè)重復(fù),連續(xù)計(jì)數(shù)后取平均值記為瘤胃上皮乳頭密度。

1.5 瘤胃上皮形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)4%多聚甲醛固定的瘤胃上皮,使用梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋后,修成立方體蠟塊,5 μm厚度切片、展片、貼片,再經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度乙醇復(fù)水,H.E.染色,梯度乙醇脫水,中性樹(shù)脂封片,光鏡下觀察拍照。用Image-Pro 6.0圖片分析軟件測(cè)定乳頭的長(zhǎng)度和寬度,每只羔羊個(gè)體測(cè)定5張切片,每張切片3個(gè)視野,每個(gè)視野讀數(shù)5個(gè)數(shù)據(jù),分別統(tǒng)計(jì)每組6只羔羊5個(gè)重復(fù)對(duì)應(yīng)的單位面積內(nèi)乳頭長(zhǎng)度×寬度之和進(jìn)行計(jì)算乳頭表面積。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 椰子油對(duì)羔羊瘤胃重量和體積的影響

由表2可知,在日糧中添加6 g/d的椰子油,90日齡屠宰時(shí)羔羊瘤胃體積顯著的大于對(duì)照組、低劑量和高劑量椰子油添加(P<0.05),瘤胃重量則不受椰子油添加的影響,瘤胃指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

表2 椰子油對(duì)羔羊瘤胃重量和體積的影響

2.2 椰子油對(duì)瘤胃上皮乳頭性狀的影響

對(duì)瘤胃上皮H.E切片染色的光鏡觀察和統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,在日糧中添加椰子油對(duì)瘤胃上皮乳頭的長(zhǎng)度和寬度沒(méi)有顯著的影響(P>0.05),計(jì)算單位面積內(nèi)乳頭的數(shù)量,發(fā)現(xiàn)HCO組上皮乳頭密度極顯著降低(P<0.01),乳頭表面積在HCO和Ctrl組也顯著降低(P<0.05),羔羊日糧中添加4～6 g/d椰子油,瘤胃乳頭表面積增加了約20%。

表3 椰子油對(duì)羔羊瘤胃乳頭性狀的影響

2.3 椰子油對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

光學(xué)顯微鏡下不同處理組瘤胃上皮的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1和圖2所示,對(duì)照組黏膜結(jié)構(gòu)完整,角質(zhì)層(SC)光滑無(wú)明顯增生,顆粒層(SG)和棘突層(SS)細(xì)胞分解不明顯(圖1A、圖2A);隨著日糧椰子油劑量的增加,圖1B、圖1C顆粒層(SG)和棘突層(SS)的細(xì)胞層數(shù)增多,圖2B基底層(SB)增厚,尤其是角質(zhì)層(圖2C)出現(xiàn)了明顯的增厚,圖1D和2D無(wú)色的角質(zhì)化細(xì)胞(SC)增多明顯,在6～8 g/d椰子油添加的羔羊瘤胃乳頭上皮黏膜也出現(xiàn)了無(wú)規(guī)則的卷曲或增厚。

圖1 瘤胃上皮石蠟切片H.E.染色(100×)

圖2 瘤胃上皮石蠟切片H.E.染色(200×)

瘤胃乳頭上皮角質(zhì)層、顆粒層、棘突層和基底層高度的測(cè)量結(jié)果如表4所示,添加椰子油能夠顯著增加角質(zhì)層的厚度(P<0.05),顆粒層細(xì)胞厚度在Ctrl組和MCO組無(wú)顯著差異(P>0.05),LCO組和HCO組細(xì)胞層厚度顯著增加(P<0.05),棘突層在對(duì)照和低劑量椰子油組無(wú)差異,6～8 g/d椰子油添加顯著增加了棘突層細(xì)胞的數(shù)量。

表4 椰子油對(duì)羔羊瘤胃上皮乳頭細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

3 討 論

椰子油是富含大量中長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的天然油脂,豐富的月桂酸(母乳中油脂的主要成分)有利于幼齡動(dòng)物腸道的吸收和利用[12],且對(duì)瘤胃發(fā)育有明顯的刺激效果[13]。盧勁曄[14]發(fā)現(xiàn)使用高能量水平飼料能顯著增加青年波爾山羊瘤胃干重,但對(duì)瘤胃濕重?zé)o影響;馮丹等[15]在湖羊日糧中添加不同比例桑葉粉對(duì)瘤胃增重影響顯著。本試驗(yàn)中添加椰子油對(duì)羔羊瘤胃重量變化影響不顯著,綜合考慮瘤胃指數(shù),可能是由于斷奶日齡稍晚、斷奶后養(yǎng)殖時(shí)間較短造成,因?yàn)橛醒芯勘砻鞲嵫蜻M(jìn)入育肥階段后平均日增重和器官指數(shù)變化趨勢(shì)受到日糧組成變化而發(fā)生反轉(zhuǎn)[16]。瘤胃的體積隨著椰子油添加量增加而增大,與Tümmler等[17]結(jié)果一致。本試驗(yàn)中8 g/d椰子油對(duì)瘤胃體積變化無(wú)顯著影響,推測(cè)可能由于添加過(guò)高能量的椰子油造成羔羊采食量下降[18],降低了攝入飼糧對(duì)瘤胃的填充刺激所造成。

瘤胃上皮乳頭大約從15～56 d開(kāi)始逐漸發(fā)育,母乳或代乳粉等液體日糧會(huì)限制幼畜瘤胃上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能的發(fā)育[16]。Carballo等[19]報(bào)道羔羊早期斷奶會(huì)造成瘤胃上皮乳頭高度、寬度、面積和肌層等厚度的降低,而趙雅軒等[20]報(bào)道早期斷奶日齡不同只影響瘤胃乳頭長(zhǎng)度,對(duì)其他上皮參數(shù)影響不明顯。本試驗(yàn)中瘤胃上皮乳頭長(zhǎng)度和寬度都未受到椰子油添加的影響,但能夠增加瘤胃乳頭面積(添加量4～6 g/d),與盧勁曄[14]報(bào)道的高能量日糧能增加瘤胃重量同時(shí)增加上皮乳頭長(zhǎng)度和乳頭表面積略有差異。在瘤胃形態(tài)學(xué)研究中,瘤胃乳頭長(zhǎng)度直接決定對(duì)粗纖維飼料附著力,而不同日糧組成、添加劑對(duì)瘤胃上皮乳頭的影響差異大相徑庭[21-22],推測(cè)是由于本試驗(yàn)日糧中除了添加的代乳粉外,誘食的精料和鮮草日糧組成同時(shí)有效地刺激了對(duì)照組羔羊瘤胃上皮的發(fā)育造成。因?yàn)閷?duì)幼齡反芻動(dòng)物而言,攝入的固體飼料除具有物理刺激作用外,還可促使瘤胃微生物的發(fā)酵功能逐漸建立并產(chǎn)生多種代謝物質(zhì)。揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)是刺激瘤胃上皮細(xì)胞和乳頭形態(tài)學(xué)發(fā)育的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)素,尤其是丁酸能夠刺激瘤胃上皮細(xì)胞周期由G0/G1期向S期推進(jìn),細(xì)胞在S期可完成DNA復(fù)制進(jìn)行增殖,進(jìn)而增加瘤胃乳頭發(fā)育,椰子油中含中、短鏈脂肪酸的比例達(dá)60%以上,是低碳脂肪酸(丁酸)最豐富的來(lái)源,進(jìn)而通過(guò)羔羊瘤胃代謝影響上皮乳頭形態(tài)學(xué)發(fā)育。高能量日糧對(duì)采食量的抑制會(huì)弱化日糧對(duì)瘤胃上皮的刺激,相應(yīng)延緩瘤胃上皮的增殖和發(fā)育,這也解釋了高添加量的椰子油會(huì)造成瘤胃上皮乳頭密度極顯著降低的結(jié)果。

瘤胃上皮的細(xì)胞結(jié)構(gòu)從瘤胃腔內(nèi)向外依次是角質(zhì)層、顆粒層、棘突層和基底層。一般認(rèn)為棘突層和基底層細(xì)胞是吸收代謝的主要場(chǎng)所,因?yàn)槌⒔Y(jié)構(gòu)觀察棘突層上皮細(xì)胞存在著豐富的細(xì)胞器結(jié)構(gòu),而且線粒體數(shù)量較多,細(xì)胞代謝作用強(qiáng)。本試驗(yàn)觀察到添加椰子油后顆粒層和棘突層細(xì)胞明顯增厚,這與Sun等[6]、盧勁曄[14]、Ragionieri等[23]分別在羔羊、青年羊、犢牛上的研究報(bào)道一致,高的能量水平、瘤胃發(fā)酵劑及推遲的斷奶日齡均能促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞的發(fā)育。棘突層是短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)代謝的重要細(xì)胞結(jié)構(gòu),來(lái)源于瘤胃微生物發(fā)酵的乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸能夠直接參與細(xì)胞的代謝,盡管中鏈飽和脂肪酸能否被棘突層和基底層上皮細(xì)胞直接吸收利用還未驗(yàn)證,但從C8～C12在幼畜腸道不需要形成乳糜微粒就能被上皮細(xì)胞所吸收來(lái)看,推測(cè)椰子油是能被瘤胃上皮細(xì)胞直接吸收進(jìn)而刺激棘突層和基底層細(xì)胞增殖的。而且顆粒層和棘突層細(xì)胞大量線粒體產(chǎn)生的ATP水解后釋放的能量被跨膜蛋白Na+/K+-ATP酶利用,以增強(qiáng)細(xì)胞膜內(nèi)外的離子平衡和代謝活性,進(jìn)而影響到的消化和分泌機(jī)能。本試驗(yàn)中還觀察到添加椰子油后,瘤胃乳頭上皮的角質(zhì)層明顯增厚,角質(zhì)層細(xì)胞由橋粒相連接而形成,Xu等[24]在高谷物日糧飼喂的綿羊瘤胃上皮也觀察到角質(zhì)層細(xì)胞的明顯增厚,可見(jiàn),瘤胃上皮對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收在很大程度上依賴(lài)于角質(zhì)層細(xì)胞的保護(hù)和防御作用,過(guò)厚的角質(zhì)層或者角質(zhì)化不全會(huì)引起乳頭退化而不利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的說(shuō)法有待深入研究。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下,MCO組(基礎(chǔ)日糧+6 g/d椰子油)瘤胃的容積顯著增加,MCO組和LCO組(基礎(chǔ)日糧+4 g/d椰子油)瘤胃上皮乳頭表面積增大,HCO組(基礎(chǔ)日糧+8 g/d椰子油)乳頭角質(zhì)層細(xì)胞明顯增厚。羔羊日糧中添加6 g/d椰子油能一定程度刺激瘤胃上皮乳頭細(xì)胞層的增生,促進(jìn)羔羊瘤胃的發(fā)育。