南豐蜜橘對高溫?zé)岷Φ纳眄憫?yīng)及耐熱性評價模型構(gòu)建

徐超 楊再強 王雨亭 劉布春 楊惠棟 湯雨晴 胡新龍 胡鐘東

摘? ? 要：【目的】探究南豐蜜橘不同品系對高溫?zé)岷Φ纳眄憫?yīng)，并進(jìn)行耐熱性評價?！痉椒ā客ㄟ^測定高溫下南豐蜜橘不同品系（楊小-26和南豐-28）葉片組織結(jié)構(gòu)、氣孔形態(tài)和生理生化指標(biāo)，評價兩個品系的耐熱性強弱?！窘Y(jié)果】高溫顯著影響兩個品系葉片組織結(jié)構(gòu)和氣孔形態(tài)特征；高溫下兩個品系的Pn下降，在24 h時是氣孔因素導(dǎo)致的，而在48 h時是非氣孔因素。高溫期間楊小-26的Fv/Fm、ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm和DIo/CSm值均高于南豐-28，而O2-、H2O2和MDA含量則小于南豐-28。在高溫處理48 h時，楊小-26的SOD和CAT活性高于南豐-28。通過相關(guān)性分析和主成分分析，篩選出氣孔面積、Pn、MDA、Fv/Fm和SOD作為模型構(gòu)建的關(guān)鍵參數(shù)，構(gòu)建TOPSIS的耐熱性評價模型，計算出楊小-26的耐熱性高于南豐-28。【結(jié)論】高溫下楊小-26葉片組織更穩(wěn)定、光合能量轉(zhuǎn)換效率高、細(xì)胞膜損傷較輕、SOD和CAT酶的活性高是其耐熱性較高的主要原因。

關(guān)鍵詞：南豐蜜橘；高溫?zé)岷?；解剖結(jié)構(gòu)；光合作用；抗氧化酶活性；耐熱性

中圖分類號：S666.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）12-2638-14

收稿日期：2023-09-06 接受日期：2023-11-20

基金項目：江西省自然科學(xué)基金面上項目（20224BAB205051）；江西現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科研協(xié)同創(chuàng)新專項項目（JXXTCXBSJJ202206；JXXTCX202203）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-26）；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（JXARS-07）；南豐蜜橘品種改良育種（撫科計字[2022]8號）

作者簡介：徐超，博士，研究方向為果樹氣象學(xué)。E-mail：xuchao@jxaas.cn

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：hzd204028@163.com

Physiological response to high temperature and heat tolerance evaluation of different lines in Nanfeng tangerine

XU Chao1， 2， YANG Zaiqiang3， WANG Yuting1， LIU Buchun2， YANG Huidong1， TANG Yuqing1， HU Xinlong1， HU Zhongdong1*

（1Institute of Horticulture/Nanchang Key Laboratory of Germplasm Innovation and Utilization of Fruit and Tea， Jiangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanchang 330299， Jiangxi， China; 2Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture， CAAS/National Engineering Laboratory of Efficient Crop Water Use and Disaster Reduction/Key Laboratory of Agricultural Environment， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing 100081， China; 3School of Applied Meteorology， Nanjing University of Information Science and Technology， Nanjing 210046， Jiangsu， China）

Abstract： 【Objective】 In order to explore the physiological response of different lines in Nanfeng tangerine to high temperature and evaluate their heat resistance， the present experiment was undertaken. 【Methods】 With the main cultivars of Nanfeng tangerine， Yangxiao-26 and Nanfeng-28， as the experimental materials， the effects of 24 h and 48 h treatments at 42 ℃ on the leaf tissue structure， stomatal morphology， photosynthetic fluorescence parameters， energy transfer， reactive oxygen species and antioxidant enzyme activity of plants were studied. Based on the results， an entropy weighted TOPSIS heat tolerance model was established to determine the heat resistance degrees of Yangxiao-26 and Nanfeng-28. 【Results】 With the extension of high temperature and time， the thickness changes of the epidermis and palisade tissue of the leaves of Yangxiao-26 and Nanfeng-28 were not significant， but the values of Yangxiao-26 were greater than those of Nanfeng-28. After 48 h high-temperature treatment， the thicknesses of the epidermis and sponge tissue significantly decreased by 14.63% and 14.29% in Yangxiao-26， respectively， while they were 13.47% and 15.75% in Nanfeng-28， respectively. With 24 h high temperature treatment， there was no significant differences in the ratio of palisade tissue to spongy tissue between Yangxiao-26 and Nanfeng-28， compared to the untreated group， but the difference was significant with 48 h high temperature treatment. At room temperature， the stomatal areas of Yangxiao-26 and Nanfeng-28 were 62.71 μm and 54.17 μm， respectively. After 48 h high-temperature treatment， the stomatal area of both significantly decreased by 84% and 93%， respectively. High temperature had a significant impact on the length and width of stomata in Yangxiao-26 and Nanfeng-28， both of which significantly decreased with the duration of high temperature treatment. The stomatal density ranges of Yangxiao-26 and Nanfeng-28 were 62.27-69.41 and 61.31-64.06， respectively， which indicated that they were not affected by high temperature treatment. The stomatal closure percentage of Yangxiao-26 and Nanfeng-28 decreased significantly with the extension of high temperature time. After 48 h high temperature treatment， the stomatal closure percentage of both decreased by 58% and 81%， respectively. Before high-temperature treatment， the stomatal length， width， density and closure percentage of Yangxiao-26 were all greater than those of Nanfeng-28. At room temperature， there was no significant difference in leaf Pn between Yangxiao-26 and Nanfeng-28; With the extension of high temperature time， the Pn of both showed a decreasing trend. After 48 h high temperature treatment， the Pn rates of both decreased by 57% and 82% respectively， compared to those without high temperature treatment， and at this time， the Pn of Yangxiao-26 was significantly higher than that of Nanfeng-28. The variation pattern of Gs and Pn was almost consistent， and Gs in both Yangxiao-26 and Nanfeng-28 decreased with the extension of high temperature time. The variation pattern of Ci and Ls in Yangxiao-26 and Nanfeng-28 under different treatment durations under high temperature conditions was opposite. With 24 h high temperature treatment， the Ci of Yangxiao-26 and Nanfeng-28 decreased compared to that without high temperature treatment， while the value of Ls increased compared to that without high temperature treatment. With 48 h high-temperature treatment， the Ci values of Yangxiao-26 and Nanfeng-28 increased compared to those without high-temperature treatment， while the Ls value decreased compared to that without high-temperature treatment. However， there was no significant difference in Ci and Ls at both 24 h and 48 h between Yangxiao-26 and Nanfeng-28. During the entire high-temperature treatment period， the maximum photochemical quantum yield （Fv/Fm）， energy absorbed per unit light cross-section （ABS/CSm）， energy captured for reducing QA （TRo/CSm）， energy captured for electron transfer （ETo/CSm）， and dissipated energy （DIo/CSm） values in the leaves of Yangxiao-26 were consistently higher than those of Nanfeng-28; With the increase of high temperature duration， the contents of superoxide anion （O2-）， hydrogen peroxide （H2O2） and Malondialdehyde （MDA） in the leaves of Yangxiao-26 and Nanfeng-28 increased continuously， and the contents of O2-， H2O2 and MDA in the leaves of Yangxiao-26 were always lower than those of Nanfeng-28. With the increase of high-temperature treatment time， the ascorbic acid peroxidase （APX） activity in the leaves of Yangxiao-26 and Nanfeng-28 significantly increased. The superoxide dismutase （SOD） activity in the leaves of Yangxiao-26 increased with the extension of high temperature treatment time， while the SOD enzyme activity in the leaves of Nanfeng-28 first increased and then decreased with the extension of high temperature treatment time. With 24 h of high temperature treatment， there was no significant difference in leaf SOD enzyme activity between Yangxiao-26 and Nanfeng-28， but after 48 hours of treatment， the SOD enzyme activity in Yangxiao-26 leaves was significantly lower than that of Nanfeng-28. The order of catalase （CAT） activity in the leaves of Yangxiao-26 was 48 h＞24 h＞0 h， while in the leaves of Nanfeng-28， the order of CAT enzyme activity was 24 h＞0 h＞48 h. Moreover， with high temperature treatment for 24 h， the CAT enzyme activity of Yangxiao-26 was significantly higher than that of Nanfeng-28， while with high temperature treatment for 48 h， the CAT enzyme activity of Yangxiao-26 was significantly lower than that of Nanfeng-28. Based on the above physiological parameters， a heat tolerance evaluation model based on entropy weighted TOPSIS was constructed， and it was found that the heat tolerance of Yangxiao-26 （0.678 4） was higher than that of Nanfeng-28 （0.412 9）. 【Conclusion】 The main reasons for higher heat resistance of Yangxiao-26 under high temperature conditions are its more stable leaf tissue， high photosynthetic energy conversion efficiency， less damage to cell membrane and high activity of SOD and CAT enzymes.

Key words： Nanfeng tangerine; High temperature; Anatomy structure; Photosynthesis; Antioxidant enzyme activity; Heat resistance

隨著全球氣候變暖、夏季極端高溫天氣頻發(fā)和重發(fā)，高溫?zé)岷σ呀?jīng)成為限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最主要的氣象災(zāi)害之一。南豐蜜橘是江西省第二大特色柑橘品種，已有1300多年的歷史，栽培面積約3.3萬hm2，當(dāng)前楊小-26是主栽品系，前期筆者研究團(tuán)隊已篩選其變異品系南豐-28，但兩者的耐熱性尚缺少數(shù)據(jù)支撐。近年來，高溫?zé)岷σ呀?jīng)成為南豐蜜橘健康生產(chǎn)最主要的限制因素，據(jù)南豐縣地面國家氣象站數(shù)據(jù)，2022年南豐縣監(jiān)測到38 ℃以上的高溫天數(shù)是67 d，導(dǎo)致90%以上的果園植株葉片發(fā)生卷曲干枯，果實發(fā)生日灼，更有甚者部分果園絕收或毀園。因此，研究楊小-26、南豐-28的高溫響應(yīng)機(jī)制并綜合評價兩者的耐熱性，對未來耐熱品系的篩選和推廣、保證夏季植株生長和果實發(fā)育具有重要意義。

光合作用是植物細(xì)胞最主要的生理功能過程，對高溫脅迫非常敏感，通常在其他細(xì)胞功能受損之前受到抑制。高溫脅迫影響細(xì)胞功能的主要位點是光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco），而細(xì)胞色素b559（Cytb559）和質(zhì)體醌（PQ）也受到影響，與PSⅡ相比，PSⅠ在高溫下是相對穩(wěn)定的[1-2]。在高溫條件下，植物表現(xiàn)出短期的回避或馴化機(jī)制以響應(yīng)高溫?zé)岷?，如改變?nèi)~向、蒸騰冷卻或改變膜脂組成。同時，葉片氣孔關(guān)閉和水分損失減少、氣孔和毛狀體密度增加以及木質(zhì)部導(dǎo)管變大也是植物中常見的熱誘導(dǎo)特征[2]。在高溫脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量對細(xì)胞有害的活性氧（reactive oxygen species，ROS），例如超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）等。研究證實，較低濃度的ROS有助于植物耐受性的增強，但過量的ROS會導(dǎo)致植物細(xì)胞氧化損傷[3]，使葉綠體和線粒體發(fā)生膨脹，破壞蛋白和核酸等高分子，抑制新的D1蛋白合成，阻礙PSⅡ的修復(fù)循環(huán)，從而加劇光抑制[4]。植物體會產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，維持細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生和清除的平衡，以降低ROS對細(xì)胞的傷害程度[5]。常見的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等。研究表明，高溫下植物體內(nèi)抗氧化酶的變化規(guī)律并不一致。通常情況下，適度的高溫脅迫會增強植物葉片中抗氧化酶的活性，當(dāng)溫度超過一定閾值時，抗氧化酶的蛋白結(jié)構(gòu)受損，活性大幅降低[6]。高溫對抗氧化酶活性的影響在不同品種、器官、發(fā)育階段、處理溫度和持續(xù)時長條件下有所差異[7]。高溫還會阻礙植物體內(nèi)的電子傳遞。胡美君等[8]研究證實，高溫使PSⅡ受體側(cè)電子傳遞受到抑制，熱耗散增加，電子傳遞能量減少，PSⅡ供體側(cè)捕光復(fù)合物Ⅱ（light-harvasting complex Ⅱ，LHCⅡ）或者放氧復(fù)合體（oxygen-evolving complex，OEC）受損，捕獲光能減少，電子傳遞受阻，最終導(dǎo)致光能利用率降低。葉綠素?zé)晒庾鳛楣夂献饔醚芯康奶结槪粌H能反映光能吸收、激發(fā)能傳遞和光化學(xué)反應(yīng)等光合作用的原初反應(yīng)過程，而且與電子傳遞、質(zhì)子梯度的建立及ATP合成和CO2固定等過程有關(guān)[9]。幾乎所有光合作用過程的變化均可通過葉綠素?zé)晒夥从吵鰜?，因此通過研究葉綠素?zé)晒鈦黹g接研究光合作用的變化是一種簡便、快捷、可靠的方法[10]。該技術(shù)也是筆者在本研究中使用的關(guān)鍵方法之一。

楊小-26是目前南豐蜜橘的主栽品種，筆者課題組前期已篩選出其變異優(yōu)株南豐-28，準(zhǔn)備在適種地區(qū)大范圍推廣。高溫一直以來是限制南豐蜜橘植株健康生長發(fā)育的主要農(nóng)業(yè)氣象因素，因此，在大范圍推廣南豐-28前，了解其對高溫?zé)岷Φ纳眄憫?yīng)，并綜合評價其與楊小-26的耐高溫強弱尤其關(guān)鍵。筆者在本研究中以南豐蜜橘主栽品系楊小-26及其變異品系南豐-28的3年生盆栽苗為試驗材料，在42 ℃高溫下處理24 h和48 h，觀察葉片組織結(jié)構(gòu)及氣孔形態(tài)顯微結(jié)構(gòu)，測定光合熒光參數(shù)、抗氧化酶等生理生化參數(shù)，并基于以上指標(biāo)構(gòu)建耐熱性評價模型，綜合比較兩個品系的耐熱性，研究南豐蜜橘在高溫脅迫下的生理響應(yīng)機(jī)制，為耐熱品種的選育和耐熱機(jī)制的研究提供參考，為高溫?zé)岷Φ木C合防控提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2023年6月在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所綜合實驗大樓進(jìn)行，以3年生南豐蜜橘（主栽品系楊小-26及其變異品系南豐-28）盆栽苗為試驗材料，盆的規(guī)格是高25 cm、直徑50 cm，里面營養(yǎng)土與珍珠巖質(zhì)量比為4∶1，土壤pH約6.7，土壤濕度為70%～80%，按需澆水。

選取健康無病蟲害、長勢一致的楊小-26和南豐-28盆栽苗各18盆，將楊小-26和南豐-28植株移至25 ℃的人工氣候室中適應(yīng)3 d，此過程中人工氣候室的濕度設(shè)定為65%～70%，光照度設(shè)定為800 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h/8 h（白天/晚上），第3天將植株分別置于42 ℃人工氣候室中連續(xù)處理24 h和48 h，高溫處理過程中濕度、光照和光周期同上，以25 ℃培養(yǎng)的植株作為對照，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)3株盆栽苗，試驗過程中植株按需澆水，確保盆中土壤濕度維持在70%～80%。指標(biāo)測定和取樣時間分別是高溫處理24 h和48 h后。

1.2 葉片細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀測

每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)選取1枚葉片，剪取葉片中部主脈旁1.5 cm×1.5 cm的方塊放入2 mL的離心管中，用FAA固定液（70%乙醇90 mL+冰乙酸5 mL+甲醛5 mL）固定，于4 ℃冰箱中保存，然后葉片經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片（切片厚度8 μm）、封片后制成永久裝片。用體式顯微鏡（SMZ25，Nikon）觀察并拍照，每個處理測定4個視野。使用ImageJ測量葉片上表皮、下表皮、柵欄組織和海綿組織等的結(jié)構(gòu)參數(shù)[11]。

1.3 葉片下表皮氣孔結(jié)構(gòu)觀測

每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)選取1枚葉片，剪取葉片中部主脈旁1.5 cm×1.5 cm的方塊放入2 mL的離心管中，用pH為7.0～7.5的電鏡固定液（2.5%戊二醛+100 mmol·L-1磷酸鹽）中固定，于4 ℃冰箱中保存。用掃描電鏡（Regulus8100，日立）觀測，每個處理觀測10個視野并拍照，用200倍鏡（200 μm）的照片統(tǒng)計氣孔數(shù)目和閉合氣孔的數(shù)目，計算氣孔密度（公式1）和氣孔閉合百分比（公式2）；用3000倍鏡（10 μm）照片測量氣孔的長度、寬度和面積，使用ImageJ軟件測量[11]。

氣孔密度/（個?mm-2）=氣孔數(shù)目/視野面積；? ? （1）

氣孔閉合百分比/%=（每個視野閉合氣孔數(shù)目/每個視野氣孔數(shù)目）×100。 ? ? ? ? ? ? ? （2）

1.4 光合參數(shù)的測定

在活體情況下，每組處理選取盆栽植株健康的功能葉3～5枚，使用便攜式光合儀LI-6400（LI-COR，美國）于09：00—11：00測定葉片的凈光合速率（Pn）、胞間二氧化碳濃度（Ci）和氣孔導(dǎo)度（Gs）。測量期間葉室內(nèi)流速500 μmol·s-1，相對濕度60%，CO2濃度390 μmol·mol-1，葉室溫度25 ℃，光合有效輻射光強1000 μmol·m-2·s-1。氣孔限制值（Ls）根據(jù)公式3求得，其中Ca為空氣中二氧化碳值[12]。

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

在活體情況下，每組處理選取健康的功能葉3～5枚，用高速連續(xù)激發(fā)式熒光儀HandyPocket PEA（Hansatech，英國）測定快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線，用于研究植物光合機(jī)構(gòu)的光化學(xué)活性、光能的吸收和轉(zhuǎn)化效率。測定前用儀器自帶葉夾夾住葉片，暗適應(yīng)25 min，然后儀器自動記錄Fo、Fm、Fv、Fv/Fm、Sm、Area、PIABS、ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm、DIo/CSm等參數(shù)[13]。

1.6 過氧化氫和超氧陰離子含量測定

采集植株健康的功能葉0.2 g在液氮中研磨至粉末，置于2 mL離心管中，在離心管中加入2 mL提取液，于4000×g 4 ℃離心20 min，取上清液，作為待測液。使用過氧化氫和超氧陰離子活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）進(jìn)行加樣和反應(yīng)，用紫外分光光度計（UV-3600iPlus，Shimadzu）測定OD值，并以此計算H2O2和O2-含量，每個處理3次生物學(xué)重復(fù)[14]。

1.7 抗氧化酶活性和MDA含量的測定

采集植株健康的功能葉0.2 g在液氮中研磨至粉末，置于2 mL離心管中，在離心管中加入2 mL提取液，于4000×g 4 ℃離心25 min，取上清液，作為待測液。使用超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和丙二醛（MDA）活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）進(jìn)行加樣和反應(yīng)，用紫外分光光度計（UV-3600iPlus，Shimadzu）測定OD值，并以此計算酶活性和MDA含量，每個處理3次生物學(xué)重復(fù)[15]。

1.8 基于熵權(quán)TOPSIS的耐熱性評價模型

1.8.1 評價矩陣構(gòu)建 （1）原始耐熱性評價矩陣為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)化矩陣的構(gòu)建。為了克服評價尺度的不統(tǒng)一，需要對原始數(shù)據(jù)V進(jìn)行歸一化處理，最終得到標(biāo)準(zhǔn)化矩陣R。具體見公式（5）～（7）：

式中，V是原始評價矩陣；vij是第i個指標(biāo)在第j個處理的初始值；R是標(biāo)準(zhǔn)化后的矩陣；rij第i個指標(biāo)在第j個處理的標(biāo)準(zhǔn)化值；i=1，2，3，…，m，m是評價指標(biāo)數(shù)量；j=1，2，3，…，n，n是品系的數(shù)量。公式（6）和（7）分別為正向、負(fù)向指標(biāo)算法。

1.8.2 評價指標(biāo)權(quán)重的確定 利用熵權(quán)法計算各指標(biāo)的權(quán)重，計算公式如（8）～（10）：

式中，wi為權(quán)重值；Hi為信息熵；fij為指標(biāo)的特征比重；ln0=0。

1.8.3 綜合評判結(jié)果 （1）基于熵權(quán)TOPSIS的耐熱性評價模型構(gòu)建。使用熵權(quán)wi構(gòu)建加權(quán)規(guī)范化耐熱性評價矩陣，具體計算公式如（11）：

（2）耐熱性評價。本文中以貼近度Tj表示耐熱性的大小，范圍在0～1之間，數(shù)值越貼近1，表明耐熱性越強，計算公式如（12）～（16）：

式中，[Y+]和[Y-]分別代表正負(fù)理想解；yi+和yi-分別為最優(yōu)數(shù)據(jù)，其中yi+由每列中最大值構(gòu)成，yi-由每列中最小值構(gòu)成，yij代表第i個指標(biāo)在第j個處理中的值。Ｄj+和Ｄj-分別代表第i個指標(biāo)與yi+和yi-的距離，其中Dj+為最優(yōu)方案，Dj-為最劣方案。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用Origin 2022和Excel軟件繪圖，采用Duncan多重比較法分析多個樣本之間的顯著性水平，用t檢驗分析兩個獨立樣本之間的顯著性水平，顯著水準(zhǔn)選擇p＜0.05，極顯著水平選擇p＜0.01。文中數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。

2 結(jié)果和分析

2.1 高溫?zé)岷钚?26與南豐-28葉片組織顯微結(jié)構(gòu)的影響

高溫?zé)岷ζ陂g楊小-26與南豐-28葉片解剖結(jié)構(gòu)清晰，可明顯區(qū)分下表皮、海綿組織和柵欄組織，楊小-26和南豐-28均有雙柵欄組織（圖1）。由表1可知，隨著高溫?zé)岷r間的延長，楊小-26和南豐-28葉片上表皮和柵欄組織的厚度變化不顯著，但楊小-26葉片上表皮和柵欄組織的厚度均大于南豐-28。與對照相比，在高溫處理48 h時，楊小-26和南豐28葉片下表皮和海綿組織厚度均顯著降低，楊小-26分別降低了14.63%和14.29%，南豐-28分別降低了13.47%和15.75%。在高溫處理24 h時楊小-26和南豐-28的柵海比與未處理組相比差異不顯著，而在高溫處理48 h時差異顯著。

2.2 高溫?zé)岷钚?26與南豐-28葉片下表皮氣孔形態(tài)和特征值的影響

從圖2可看出，在3000倍鏡（10 μm）下可以清晰地看出，楊小-26與南豐-28葉片下表皮氣孔形態(tài)均隨著高溫?zé)岷r間的延長而逐漸變小，且相同處理時長，楊小-26氣孔開張大于南豐-28，尤其在高溫處理48 h時更為明顯。高溫?zé)岷钚?26與南豐-28葉片下表皮氣孔特征值的影響見表2。未進(jìn)行高溫處理時，楊小-26與南豐-28氣孔面積分別為62.71 μm2和54.17 μm2，在高溫處理48 h后，二者氣孔面積均顯著降低，分別降低了84%和93%。高溫對楊小-26與南豐-28氣孔長度和寬度有顯著影響，均隨著高溫處理時長的增加而顯著減少。氣孔密度不受高溫處理的影響，楊小-26與南豐-28的氣孔密度范圍分別是62.27～69.41個?mm-2和61.31～64.06個?mm-2。氣孔閉合百分比顯著受高溫影響，楊小-26與南豐-28的氣孔閉合百分比隨著高溫時間的延長而顯著升高，與對照相比，在高溫處理48 h后，二者氣孔閉合百分比分別增加了4.14倍和1.38倍。未進(jìn)行高溫處理前，楊小-26的氣孔長度、氣孔寬度、氣孔密度均大于南豐-28。

2.3 高溫?zé)岷钚?26與南豐-28葉片光合參數(shù)的影響

高溫?zé)岷ο聴钚?26與南豐-28葉片的Pn、Gs、Ci和Ls的變化規(guī)律如圖3所示。未進(jìn)行高溫處理時，楊小-26與南豐-28葉片的Pn無顯著差異；隨著高溫時間的延長，兩者Pn呈現(xiàn)下降趨勢，高溫處理48 h，兩者的Pn較未進(jìn)行高溫處理時分別降低了57%和82%，且此時楊小-26的Pn顯著大于南豐-28。Gs與Pn的變化規(guī)律幾乎一致，楊小-26與南豐-28的Gs均隨著高溫時間的延長而減少。高溫下不同處理時長楊小-26與南豐-28的Ci和Ls變化規(guī)律相反，在高溫處理24 h時，楊小-26與南豐-28的Ci較未進(jìn)行高溫處理時下降，而Ls值較未進(jìn)行高溫處理時上升。高溫處理48 h時，楊小-26與南豐-28的Ci較未進(jìn)行高溫處理時上升，而Ls值較未進(jìn)行高溫處理時下降。但無論是24 h還是48 h下，楊小-26與南豐-28的Ci和Ls差異均不顯著。

2.4 高溫?zé)岷钚?26與南豐-28葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

高溫?zé)岷钚?26與南豐-28葉片熒光動力參數(shù)（Fo、Fm、Fv、Fv/Fm、Sm、Area和PIABS）的影響如圖4所示。隨著高溫?zé)岷μ幚頃r間的延長，楊小-26與南豐-28的Fm、Fv、Fv/Fm、Sm、Area和PIABS呈現(xiàn)下降趨勢，F(xiàn)o則呈上升趨勢。在高溫處理48 h時，楊小-26的Fm、Fv、Fv/Fm、Sm、Area和PIABS值相對于未經(jīng)過高溫處理分別降低了46%、72%、53%、47%、78%和60%，南豐-28分別降低了57%、81%、66%、53%、87%和65%，而楊小-26和南豐-28的Fo則分別上升31%和41%。

2.5 高溫?zé)岷钚?26與南豐-28葉片能量分配的影響

高溫?zé)岷钚?26與南豐-28葉片能量分配[單位受光截面吸收的能量（ABS/CSm）、單位受光截面捕獲用于電子傳遞的能量（ETo/CSm）、單位受光截面捕獲用于還原QA的能量（TRo/CSm）、單位受光截面耗散的能量（DIo/CSm）]的影響如圖5所示。未進(jìn)行高溫處理時，楊小-26與南豐-28葉片的ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm、DIo/CSm無顯著差異；隨著高溫時間的延長，兩者ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm、DIo/CSm呈現(xiàn)下降趨勢，無論是高溫處理24 h或48 h，楊小-26的ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm和DIo/CSm值均始終高于南豐-28。

2.6 高溫?zé)岷钚?26與南豐-28葉片H2O2和O2-含量的影響

高溫?zé)岷钚?26與南豐-28葉片H2O2和O2-含量的影響如圖6所示。隨著高溫?zé)岷μ幚頃r長的增加，楊小-26與南豐-28葉片上H2O2和O2-含量一直呈現(xiàn)增多趨勢。在高溫處理24 h后，南豐-28的H2O2和O2-含量均顯著高于楊小-26。在高溫處理48 h后，楊小-26的H2O2和O2-含量較高溫處理24 h分別增加11%和15%，而南豐-28的H2O2和O2-含量分別增加了11%和10%，且南豐-28的H2O2和O2-含量均顯著高于楊小-26。

2.7 高溫?zé)岷钚?26與南豐-28葉片抗氧化酶活性和MDA含量的影響

高溫對楊小-26與南豐-28葉片MDA含量及APX、SOD和CAT活性的影響如圖7所示。隨著高溫處理時間的延長，楊小-26和南豐-28葉片中MDA含量和APX活性顯著上升，且高溫處理后，南豐-28葉片中MDA含量和APX活性高于楊小-26。楊小-26葉片中SOD活性隨著高溫處理時間的延長而升高，南豐-28葉片中SOD活性隨著高溫處理時間的延長先升高后下降，在高溫處理24 h時，楊小-26和南豐-28葉片中SOD活性差異不顯著，但在處理48 h后楊小-26葉片中SOD活性顯著低于南豐-28。楊小-26葉片中CAT活性的高低順序為48 h＞24 h＞0 h，南豐-28葉片中CAT活性高低順序為24 h＞0 h＞48 h，且高溫處理24 h時楊小-26 CAT活性顯著高于南豐-28，而高溫處理48 h時楊小-26 CAT活性顯著低于南豐-28。

2.8 基于熵權(quán)TOPSIS的楊小-26與南豐-28耐熱性評價

通過相關(guān)性分析和主成分分析，兼顧數(shù)據(jù)易取性，篩選出氣孔面積、凈光合速率、MDA含量、Fv/Fm和SOD活性這5個參數(shù)來計算楊小-26與南豐-28的耐熱性。

（1）加權(quán)規(guī)范化耐熱性評價矩陣。通過計算不同處理下氣孔面積（As）、凈光合速率（Pn）、丙二醛（MDA）含量、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）和超氧化物歧化酶（SOD）活性等5個指標(biāo)的權(quán)重分別是0.16、0.21、0.25、0.23和0.15，構(gòu)建基于熵權(quán)TOPSIS的耐熱性評價模型Y，具體矩陣如下。

（2）耐熱性評價。貼近度的范圍是0到1，楊小-26的貼近度為0.678 4，南豐-28的貼近度為0.412 9，耐熱性越強，貼近度越接近1，可以得出楊小-26的耐熱性強于南豐-28。

3 討 論

葉片是植物對環(huán)境變化比較敏感且可塑性較強的器官，其形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)的變化能較好地反映植物的生長狀況和對外界的適應(yīng)性[16]。發(fā)達(dá)的柵欄組織不僅可以保護(hù)葉肉細(xì)胞免受灼傷，還可以利用衍射光進(jìn)行光合作用。在本研究中，高溫處理下楊小-26和南豐-28葉片上表皮和柵欄組織的厚度變化不顯著。與未處理相比，在高溫48 h時，楊小-26和南豐28葉片下表皮和海綿組織厚度均顯著降低，柵海比顯著升高，表明長期高溫破壞兩者葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)。氣孔是植物表皮上的特殊結(jié)構(gòu)，是植物與外界環(huán)境進(jìn)行CO2和H2O等氣體交換的重要通道和器官[17]。植物葉片通過改變氣孔面積、密度、長（寬）度以及空間分布格局來迅速響應(yīng)短期內(nèi)環(huán)境變化，從而提高葉片的氣孔交換速率[18]。目前，關(guān)于高溫對氣孔密度的影響還存在一定分歧，有研究表明，高溫處理對植物葉片的氣孔密度無顯著影響[11]；然而，另一些研究卻發(fā)現(xiàn)高溫能夠減少或增加植物葉片表皮的氣孔密度[19-20]。出現(xiàn)截然相反結(jié)果的原因可能與植物的種類、遺傳特性、溫度和處理方式等因素密切相關(guān)。本研究表明，高溫處理24 h和48 h對楊小-26和南豐-28的氣孔密度影響不顯著。氣孔密度是評價植物耐熱性強弱的一個重要指標(biāo)，通常耐熱品種比不耐熱品種氣孔密度大，這有利于植物蒸騰作用的加強，顯著降低葉片表面的溫度，從而保護(hù)葉片組織免受高溫?zé)岷21]。在本研究中，楊小-26葉片下表皮的氣孔密度大于南豐-28，這可能是楊小-26耐熱性強的原因之一。此外高溫還會影響植物葉片的氣孔開張度，氣孔開張度是反映植物耐熱性的另一個重要指標(biāo)[22]。在高溫逆境條件下，植物葉片通過氣孔開閉對高溫做出反饋，維持葉片細(xì)胞水分散失和光合效率間的平衡。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著高溫時間的延長，楊小-26和南豐-28葉片下表皮氣孔的面積、長寬度和閉合比都有所下降，但是不管是24 h還是48 h，楊小-26氣孔的面積和長寬度均大于南豐-28，而氣孔閉合比則小于南豐-28，這表明楊小-26的耐熱性強于南豐-28。

光合作用是植物響應(yīng)外界溫度變化最為敏感的生理過程之一[23]。植物光合作用受到抑制有氣孔因素和非氣孔因素[24]。早期的研究把Gs與Pn之間的高度正相關(guān)當(dāng)作光合作用受氣孔限制的依據(jù)，把Ci的降低幅度遠(yuǎn)小于Pn降低的幅度和接近恒定的Ci當(dāng)作Pn降低的非氣孔原因的判斷依據(jù)。而許大全[25]認(rèn)為判斷葉片光合速率降低的主要原因是氣孔因素還是非氣孔因素依據(jù)的是Ci和Ls的變化方向，即Ci降低和Ls升高表明主要原因是氣孔因素，而Ci增高和Ls降低則表明主要原因是非氣孔因素。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)楊小-26和南豐-28在高溫處理24 h時二者Pn的下降伴隨著Ci降低和Ls升高，這表明此時Pn的降低是氣孔因素占主導(dǎo)原因。而在高溫處理48 h時，楊小-26和南豐-28的Pn下降伴隨著Ci增高和Ls降低，這表明此時非氣孔因素是二者Pn降低的主要原因。在本研究中同時還可以間接證明將Gs與Pn之間的高度正相關(guān)當(dāng)作光合作用受氣孔限制的原因有一定的片面性。葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm是環(huán)境脅迫程度的指標(biāo)和探針，反映的是植物潛在最大的光合能力，是評估光合作用效率的一種快捷有效的方法[9]。在非脅迫條件下其值變化很小，穩(wěn)定在0.78～0.84之間，表明能很好地吸收并利用光能[26]。本研究表明楊小-26和南豐-28的Fv/Fm值均隨著高溫時間的延長而降低，且相同的高溫處理時長，楊小-26的Fv/Fm值均大于南豐-28，這表明高溫抑制了兩者對光能的吸收利用，且楊小-26的光合作用效率要大于南豐-28。Fo和Fm可以評估植物光合作用受到抑制的程度，當(dāng)光合作用受到抑制時，F(xiàn)m值會降低，而Fo值會升高。高溫下Fo的升高，與光捕獲復(fù)合體Ⅱ（LHCⅡ）解離和PSⅡ還原側(cè)電子轉(zhuǎn)移受阻有關(guān)[27]，而Fm的降低可能與PSⅡ活性的效率較低有關(guān)，這是由于D1蛋白的構(gòu)象變化，導(dǎo)致PSⅡ電子受體的特性改變[28]。同時，F(xiàn)o、Fm和Fv/Fm也是評估逆境傷害是否可逆的重要參數(shù)，本文僅僅涉及特定高溫以及持續(xù)時間對楊小-26和南豐-28葉片的傷害，并未涉及災(zāi)后的恢復(fù)，這也是接下來實驗需要完善的方面，為未來高溫?zé)岷Φ姆揽卮胧┲贫ㄌ峁├碚撝巍?/p>

Sm可評估PSⅡ和PSⅠ之間質(zhì)體醌庫（PQ pool）的大小[29]，該值變大表明PSⅡ和PSⅠ之間的電子傳遞較少。本研究表明，楊小-26和南豐-28隨著高溫時間的延長，Sm值逐漸變大，表明高溫對兩者的電子傳遞均有影響，相同處理時間，南豐-28的Sm大于楊小-26，表明高溫對南豐-28的影響大于楊小-26。Area是相對于PSII還原側(cè)的電子受體QA的池大小，該值的降低是由于從PSⅡ反應(yīng)中心到醌池的電子轉(zhuǎn)移被阻斷[10]。因此，高溫下楊小-26和南豐-28的Area降低可能是減少從RC到醌池的電子轉(zhuǎn)移的結(jié)果。這一結(jié)果同樣從光合性能指數(shù)PIABS值的變化得到驗證。筆者在本研究中還發(fā)現(xiàn)，隨高溫時間的延長，楊小-26和南豐-28的ABS/CSm、ETo/CSm、TRo/CSm、DIo/CSm均顯著下降，高溫導(dǎo)致兩者PSⅡ活性反應(yīng)中心的密度下降，單位面積吸收的光能降低，捕獲用于還原QA的光能減少，捕獲用于電子傳遞光能的能力減弱，從而導(dǎo)致PSⅡ的光化學(xué)活性受到抑制，進(jìn)而影響植株光合作用，抑制植株的生長。上述參數(shù)值也證實，在相同高溫且處理時間一致的情況下，對南豐-28光合能量傳遞的影響要顯著大于楊小-26。

在非生物脅迫條件下，過量ROS的產(chǎn)生會超過細(xì)胞的清除能力，破壞細(xì)胞膜的功能和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。MDA是植物細(xì)胞膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，是衡量細(xì)胞膜破壞的關(guān)鍵指標(biāo)[12]。為了克服氧化應(yīng)激，植物體會誘導(dǎo)抗氧化防御機(jī)制，SOD、POD和CAT是存在于植物體中抵御ROS過量產(chǎn)生的抗氧化酶，SOD可以將超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，而APX和CAT可以進(jìn)一步將H2O2分解為H2O和O2[30]，以降低ROS的毒害作用。這3種酶可在一定程度上清除體內(nèi)過剩的ROS，維持ROS產(chǎn)生和清除之間的動態(tài)平衡，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，但是當(dāng)脅迫超過植物的承受閾值時，SOD、APX和CAT活性則會下降甚至結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS過度積累，MDA含量增加，膜脂過氧化嚴(yán)重，導(dǎo)致細(xì)胞的代謝失衡，植物體的生長受到抑制。在本研究中，隨著高溫時間的延長，楊小-26和南豐-28葉片內(nèi)的MDA、H2O2和O2-含量呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，表明高溫破壞了兩者細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，并且隨著高溫?zé)岷r間的延長，對葉片細(xì)胞膜傷害越嚴(yán)重。同時，筆者在本研究中還發(fā)現(xiàn)楊小-26葉片內(nèi)SOD和CAT活性最高值在高溫處理48 h，而南豐-28葉片內(nèi)SOD和CAT活性最高值在高溫處理24 h，可能是由于南豐-28在高溫處理24 h就達(dá)到細(xì)胞膜損傷的極限，在高溫48 h時，SOD和CAT酶結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，因此SOD和CAT活性變化趨勢是先升高后降低。

4 結(jié) 論

通過觀測高溫（42 ℃）處理24 h和48 h楊小-26和南豐-28的葉片組織解剖結(jié)構(gòu)、氣孔形態(tài)特征以及測定光合熒光參數(shù)、葉片能量分配、活性氧物質(zhì)和抗氧化酶活性等生理生化指標(biāo)，依據(jù)以上參數(shù)，構(gòu)建基于熵權(quán)TOPSIS的耐熱性評價模型，計算出楊小-26和南豐-28的貼近度分別是0.678 4和0.412 9，確定楊小-26的耐熱性強于南豐-28。高溫處理下（24 h或48 h），楊小-26葉片電子傳遞效率均高于南豐-28，而PSⅡ活性中心的損傷程度則小于南豐-28。高溫處理24 h時，楊小-26和南豐-28葉片Pn下降的原因是氣孔因素，而高溫處理48 h時，Pn下降的原因是非氣孔因素。高溫下楊小-26葉肉組織緊實、氣孔密度大以及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的升高是其耐熱性相對于南豐-28較強的主要原因。

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