血清15與21型藍(lán)舌病病毒的分離與鑒定

李文良，毛 立，楊蕾蕾，許寶軍，唐朝忠，楊 恒，郝 飛，張紋紋，邵 坤，李華春，江杰元*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；2.盱眙縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 盱眙 211700；3.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224)

【研究意義】蟲媒病毒病是一類由媒介昆蟲傳播的病毒性傳染病，對牛羊危害較大的蟲媒病毒病包括藍(lán)舌病(Bluetongue, BT)、牛流行熱(Bovine ephemeral fever, BEF)、流行性出血病(Epizootic hemorrhagic disease, EHD)、阿卡斑(Akabane, AKA)。藍(lán)舌病是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的藍(lán)舌病病毒(Bluetongue Virus, BTV)引起的一種嚴(yán)重侵害反芻動(dòng)物的傳染病，OIE將其列為必需報(bào)告的疫病，我國將其列為一類傳染病[1-2]。隨著全球氣候的變化和國際貿(mào)易的增加，藍(lán)舌病有擴(kuò)大流行的趨勢，世界多地已報(bào)道該病的存在，對牛羊養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展構(gòu)成潛在威脅[2-4]。有必要對其流行分布情況進(jìn)行調(diào)查分析?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】BTV以庫蠓為傳播媒介，主要感染反芻動(dòng)物，綿羊最易感，山羊和牛次之。目前已報(bào)道BTV至少有27個(gè)血清型[4-6]。我國云南、廣東、廣西、貴州、湖北、安徽、四川、內(nèi)蒙古、江蘇和遼寧等省均檢出BTV 血清學(xué)陽性動(dòng)物并分離到病毒，但多為隱性感染，無明顯臨床癥狀[7-12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】江蘇省地處亞熱帶，地勢低平，河湖眾多，雨水豐沛，溫暖潮濕，適合庫蠓等昆蟲的滋生和藍(lán)舌病的傳播，但近年來對該病的流行分布情況沒有研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】為了解BTV在江蘇的流行情況，我們先前對江蘇部分地區(qū)牛、羊血清樣品BTV抗體進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)在某些縣市抗體陽性率較高，并通過設(shè)置陰性監(jiān)控動(dòng)物監(jiān)測血清學(xué)抗體轉(zhuǎn)陽情況證明BTV感染的存在[11]。本研究在此基礎(chǔ)上，通過監(jiān)控動(dòng)物血清學(xué)監(jiān)測，選擇抗體轉(zhuǎn)陽的個(gè)體血液樣品進(jìn)行RT-PCR檢測和病毒分離鑒定，分析病毒及不同血清型的流行情況。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

Transzol UP、一步法RT-PCR試劑盒及大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶和pMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自杭州Axygen公司；其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。MEM、M199培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自Gibco公司。10日齡SPF雞胚購自南京天邦生物技術(shù)有限公司。C6/36和BHK-21細(xì)胞由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈。

1.2 監(jiān)控動(dòng)物的設(shè)置與樣品采集

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，選擇江蘇省盱眙縣桂五鎮(zhèn)一山羊養(yǎng)殖戶(存欄800只)作為監(jiān)控點(diǎn)，選擇血清學(xué)陰性(經(jīng)BTV C-ELISA檢測陰性)的山羊5頭作為監(jiān)控動(dòng)物，與養(yǎng)殖戶羊群混合飼養(yǎng)，并打上耳號。2015年5-10月每周采血1次，11月至2016年4月每月采血1次，每次每頭動(dòng)物分別采集肝素抗凝血、EDTA抗凝血、全血各1份?？鼓? ℃保存，血清分離后置-20 ℃保存。

1.3 血清學(xué)檢測

用云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的BTV C-ELISA試劑盒按照說明書檢測血清樣品中BTV抗體水平[13]。

1.4 RT-PCR檢測

選擇抗體轉(zhuǎn)陽前2周內(nèi)的EDTA抗凝血，處理后按照Transzol UP試劑說明書提取RNA，使用引物S6-A/S6-B和S6C /S6-D進(jìn)行套式PCR檢測(表1)。先以提取的RNA為模板，采用RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μl：2×Buffer 10 μl，Enzyme Mix 0.4 μl，S6-A 0.5 μl，S6-B 0.5 μl，ddH2O 4.6 μl，RNA模板4 μl。反應(yīng)參數(shù)為45 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。然后以RT-PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μl：10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTPs 2 μl，Taq酶0.5 μl，S6-C 1 μl，S6-D 1 μl，ddH2O 17 μl，模板1 μl。反應(yīng)參數(shù)為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。陽性樣品對應(yīng)的肝素抗凝血用于病毒分離。

表1 RT-PCR檢測用引物

1.5 病毒分離

1.5.1 雞胚接種 吸取0.1 mL肝素抗凝血加1 mL無菌PBS混勻，2000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.9 mL滅菌雙蒸水，振蕩混勻后雞胚靜脈接種0.1 mL，每份血樣接種3枚10日齡SPF雞胚，接種后置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育5 d，逐日觀察雞胚的生長和死亡情況。收獲24 h以后死亡雞胚的肝臟。

1.5.2 細(xì)胞接種 收獲的雞胚肝放入2 mL無菌EP管中，加入0.9 mL無菌PBS，用注射器(帶18G針頭)反復(fù)吹吸后，2000 r/min離心10 min，取上清液0.2 mL接種于6孔板上的C6/36細(xì)胞，37 ℃孵育1 h，加入含2 %胎牛血清M199維持液，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。然后吸取細(xì)胞懸液接種于6孔板上的BHK-21細(xì)胞中，37 ℃孵育1 h，加入含2 %胎牛血清的MEM維持液，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)。出現(xiàn)病變的細(xì)胞樣品收獲后4 ℃保存，未出現(xiàn)CPE的孔7 d后收獲培養(yǎng)物，以2000 r/min離心5 min，取上清液按上述方法繼續(xù)接種BHK-21細(xì)胞傳代2代，出現(xiàn)CPE的孔收獲置4 ℃保存作后續(xù)鑒定，無CPE出現(xiàn)視為陰性。

1.6 分離毒株的鑒定

1.6.1VP7基因檢測 按照Transzol UP試劑說明書提取細(xì)胞分離物的RNA，使用Anthony等[14]報(bào)道的引物S7-FA/S7-RA和S7-FB /S7-RB進(jìn)行RT-PCR檢測(表1)。反應(yīng)體系為20 μl：2×Buffer 10 μl，Enzyme Mix 0.4 μl，引物各0.5 μl，ddH2O 3.6 μl，RNA模板4 μl。反應(yīng)參數(shù)為45 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。陽性樣品對應(yīng)的肝素抗凝血用于病毒分離。

1.6.2 血清型鑒定 參照Maan等[15]設(shè)計(jì)的引物對BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-20、BTV-21、BTV-23的VP2基因序列進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增結(jié)果。回收PCR產(chǎn)物，送南京金斯瑞生物科技有限進(jìn)行測序，利用DNAStar軟件分析測序結(jié)果并進(jìn)行BLAST分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學(xué)監(jiān)測與病毒的分離

用BTV C-ELISA試劑盒對進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測。6月開始動(dòng)物血清學(xué)檢測結(jié)果轉(zhuǎn)陽性，至12月，監(jiān)控動(dòng)物全部轉(zhuǎn)為陽性。用套式RT-PCR檢測轉(zhuǎn)陽前2、1周和轉(zhuǎn)陽本周的血液樣品，共檢測到8份陽性樣品(其中81和83號羊因轉(zhuǎn)陽時(shí)間較晚，無轉(zhuǎn)陽前1周和2周的血樣)。將對應(yīng)日期的肝素抗凝血處理后靜脈注射10日齡雞胚，其中24 h內(nèi)死亡的5枚雞胚和5 d后仍存活的3枚雞胚丟棄，接種后第2～5天有16枚雞胚出現(xiàn)死亡。雞胚全身不同程度的出血(圖1)。將同一樣品的死亡雞胚肝組織混合后勻漿、PBS懸浮、離心，上清接種C6/36細(xì)胞傳1代轉(zhuǎn)到BHK-21細(xì)胞盲傳3代。在BHK-21細(xì)胞傳代到第1、2代分別開始出現(xiàn)CPE，共分離到5份疑似分離物(83號樣品未分離成功)。接毒48 h后被感染細(xì)胞開始呈圓形、聚集成團(tuán)，出現(xiàn)空泡化及呈現(xiàn)網(wǎng)狀或放射狀等典型的CPE，之后大片融合、死亡脫落(圖2 B，C)。檢測與病毒分離情況見表2。

表2 監(jiān)控動(dòng)物BTV檢測與病毒分離情況

注：1)阻斷率大于50 %為陽性；2)未進(jìn)行試驗(yàn)操作。

Note：1)Blocking rate more than 50 % means positive；2)No experiment is conducted.

A. 陰性對照；B. 接毒后3 d；C.接毒后5 dA.Negative control; B. 3dpi; C.5dpi圖2 BTV接種BHK-21的細(xì)胞病變Fig.2 CPE observed in BTV inoculated BHK-21

2.2 分離毒株的鑒定

將5份疑似分離物離心取上清，使用引物S7-FA/S7-RA和S7-FB /S7-RB進(jìn)行RT-PCR鑒定。瓊脂糖凝膠電泳顯示，5份分離株均在1156 bp位置處出現(xiàn)VP7基因的擴(kuò)增條帶，與理論預(yù)期相符(圖3 A)。確認(rèn)5個(gè)分離株均為藍(lán)舌病病毒。

進(jìn)一步對分離毒株的VP2基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得約990和1520 bp的目的條帶(圖3 B)。表明2株(77-1、77-2)為BTV-15、3株(75-1、75-2、600-1)為BTV-21。將測序結(jié)果進(jìn)行Blast檢索進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。

1.75-1；2.75-2；3.600-1；4.77-1；5.77-2；6.陰性對照；M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 plus1.75-1; 2.75-2; 3.600-1; 4.77-1; 5.77-2; 6.Negative control; M.DNA marker DL2000 plus圖3 分離毒株的RT-PCR鑒定(A.VP7基因檢測；B.VP2基因檢測)Fig.3 RT-PCR detection of BTV isolates (A.VP7 gene detection; B.VP2 gene detection)

3 討 論

我國對動(dòng)物蟲媒病毒包括BTV的研究相對滯后，對BTV的分布、流行情況及變化規(guī)律缺乏系統(tǒng)研究。自1979年張念祖等在中國云南省師宗縣首次發(fā)現(xiàn)藍(lán)舌病并成功分離到病毒后，在1983-1993年間，湖北、安徽、廣西、四川省、山西等地先后報(bào)道了該病[16]。但之后鮮有研究報(bào)道。受全球氣候變化及畜產(chǎn)品貿(mào)易增長的影響，藍(lán)舌病呈現(xiàn)出向北方、高緯度蔓延的流行趨勢。有必要對BTV流行分布情況進(jìn)行監(jiān)測。近年來，通過血清學(xué)與病原學(xué)檢測，全國多地報(bào)道了該病的存在并分離到不同血清型的病毒[7-12]。

江蘇省地處亞熱帶，氣候溫暖潮濕，適合蟲媒滋生和疾病傳播。本研究根據(jù)先前調(diào)查結(jié)果，選擇陽性率高的盱眙縣某養(yǎng)殖戶作為監(jiān)控點(diǎn)，該地為丘陵山區(qū)，靠近洪澤湖，且附近有水庫，有利于蟲媒病毒的傳播。牛、綿羊、山羊感染BTV多為持續(xù)性或隱性感染，往往不表現(xiàn)特征性臨床癥狀。這給BTV流行病學(xué)監(jiān)測與防控帶來困難。在高陽性率地區(qū)投入BTV抗體陰性動(dòng)物作為“監(jiān)控動(dòng)物”或“哨兵動(dòng)物”，通過監(jiān)測監(jiān)控動(dòng)物感染情況可以評價(jià)BTV流行情況。本研究發(fā)現(xiàn)在6月之前，BTV抗體一直表現(xiàn)為陰性。6月底開始，監(jiān)控羊群BTV抗體逐漸轉(zhuǎn)陽，至8月份，已有60 %(3/5)轉(zhuǎn)陽，至12月全部轉(zhuǎn)陽，而且BTV抗體水平穩(wěn)定直至監(jiān)測結(jié)束。監(jiān)控動(dòng)物BTV抗體全部轉(zhuǎn)陽，說明了該地區(qū)存在BTV感染，且流行普遍。但本次監(jiān)控的山羊未出現(xiàn)任何藍(lán)舌病癥狀，仍可分離到病毒，表明其可攜帶傳播BTV。

由于藍(lán)舌病病毒血清型多，通過病毒中和試驗(yàn)進(jìn)行血清型鑒定繁瑣、費(fèi)時(shí)，且試驗(yàn)要求苛刻。利用PCR方法檢測病毒核酸簡便、快速、特異性高，已廣泛用于病原檢測與鑒定。不同血清型病毒的VP2基因序列同源性在29 %～59 %，因此可通過檢測VP2基因來進(jìn)行血清型鑒定并結(jié)合測序進(jìn)行分子流行病學(xué)研究[17]。本研究采用先前報(bào)道的方法[10, 17]，利用RT-PCR擴(kuò)增分離毒株的VP2基因，并進(jìn)行測序和BLAST比對分析，將所分離毒株鑒定為BTV-15和BTV-21。

4 結(jié) 論

本研究通過在BTV高流行地區(qū)設(shè)置監(jiān)控動(dòng)物的方法分離到5株BTV，經(jīng)鑒定分別為BTV-15和BTV-21型，豐富了該地區(qū)BTV流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步開展相關(guān)的病原學(xué)和流行病學(xué)研究提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[2]苗志強(qiáng)，鄭明學(xué)，古少鵬，等. 藍(lán)舌病的流行狀況及防控措施[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010(5):28-30.

[3]Saegerman C, Berkvens D, Mellor P S. Bluetongue epidemiology in the European union[J]. Emerging Infect Dis, 2008, 14(4):539-544.

[4]Feenstra F, van Rijn PA. Current and next-generation bluetongue vaccines: Requirements, strategies, and prospects for different field situations[J]. Crit Rev Microbiol. 2017, 43(2):142-155.

[5]Sun EC, Huang LP, Xu QY, et al. Emergence of a novel bluetongue virus serotype, China 2014[J]. Transbound Emerg Dis, 2016, 63(6):585-589.

[6]Savini G, Puggioni G, Meloni G, et al. Novel putative Bluetongue virus in healthy goats from Sardinia, Italy[J]. Infect Genet Evol. 2017, 51: 108-117.

[7]覃紹敏，白安斌，吳健敏，等. 廣西山羊藍(lán)舌病血清學(xué)調(diào)查及流行區(qū)域分布的影響因素分析[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33(1):28-31.

[8]王 慧，覃 嵐，尹 鑫，等. 2012年貴州羊藍(lán)舌病血清流行病學(xué)調(diào)查及影響因素分析[J]. 中國動(dòng)物檢疫，2013，30(11):52-56.

[9]呂敏娜，林麗琴，陳琴苓，等. 廣東地區(qū)藍(lán)舌病流行病學(xué)初步研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，377：499-501.

[10]林麗琴，呂敏娜，孫銘飛，等. 廣東某奶牛場藍(lán)舌病病毒分離株血清型與基因型的鑒定[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2015，45(6)：615-621.

[11]毛 立，李文良，楊蕾蕾，等. 江蘇省部分地區(qū)牛羊藍(lán)舌病血清學(xué)調(diào)查及監(jiān)控[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，28(6)：2784-2787.

[12]張勝男，李華春，朱建波，等. 2015 年內(nèi)蒙古地區(qū)藍(lán)舌病及流行性出血熱流行病學(xué)調(diào)查及血清型鑒定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，38(12)：939-943.

[13]苗海生，李 樂，朱建波，等. 藍(lán)舌病病毒阻斷ELISA抗體檢測方法的建立[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，36(2):111-115.

[14]Anthony S, Jones H, Darpel KE, et al. A duplex RT-PCR assay for detection of genome segment 7 (VP7 gene) from 24 BTV serotypes[J]. J Virol Methods, 2007, 141(2):188-197.

[15]Maan NS, Maan S, Belaganahalli MN, et al. Identification and differentiation of the twenty six bluetongue virus serotypes by RT-PCR amplification of the serotype-specific genome segment 2[J]. PLoS One, 2012, 7(2):e32601.

[16]肖 雷，孟錦昕，李 楠，等. 云南省師宗縣藍(lán)舌病病毒的分離及鑒定[J]. 中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2014，22(4)：1-6.

[17]Maan S, Maan NS, Samuel AR, et al. Analysis and phylogenetic comparisons of full-lengthVP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes[J]. J Gen Virol, 2007, 88(2):621-630.