miR-34a、sirt1 與急性缺血性腦卒中患者側(cè)支循環(huán)及預(yù)后的關(guān)系

曾友才 唐紹軍

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是一種突發(fā)性疾病，多發(fā)于老年人，指腦部血液發(fā)生中斷而引起的腦組織壞死，該疾病具有發(fā)病率高、致死率高的特點(diǎn)[1]。腦側(cè)支循環(huán)是指當(dāng)腦部血管發(fā)生堵塞時(shí)，側(cè)邊潛在的血管開(kāi)通或生成，從而達(dá)到血液代償?shù)淖饔茫哂刑岣吣X血管再通概率，并減少出血轉(zhuǎn)化、改善預(yù)后的重要作用[2]。AIS 的具體發(fā)病機(jī)制尚未明晰，但有研究顯示，頸動(dòng)脈粥樣硬化參與AIS 的進(jìn)程[3]。而頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及其穩(wěn)定性與血清miR-34a、sirt1 水平異常關(guān)系密切[4]。miR-34a 參與血管內(nèi)皮損傷過(guò)程，在心腦血管疾病中具有重要作用[5]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，sirt1）作為miR-34a 的靶基因之一，具有保護(hù)細(xì)胞、抗凋亡、減緩炎癥的作用，參與疾病的進(jìn)展程度[6]。本研究主要通過(guò)檢測(cè)miR-34a、sirt1 的表達(dá)水平，旨在探究二者與AIS 患者側(cè)支循環(huán)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年2 月至2020 年2 月浙江省義烏復(fù)元醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的87 例AIS 患者為研究對(duì)象。根據(jù)側(cè)支循環(huán)評(píng)估結(jié)果將其分為側(cè)支循環(huán)不良組（36 例）和側(cè)支循環(huán)良好組（51 例）。選取同期健康體檢者為對(duì)照組（60 例）。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫審（2017）第05 號(hào)]。所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床確診為AIS[7]；（2）首次病發(fā)AIS；（3）年齡≥18 歲；（4）從發(fā)病到進(jìn)行數(shù)字減影血管造影檢查不超過(guò)7 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有肝腎心嚴(yán)重疾病患者；（2）妊娠期女性；（3）患有惡性腫瘤及感染性疾病者；（4）不積極配合治療者。

1.3 主要試劑及儀器 離心機(jī)購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司（型號(hào)Avanti JXN-30）；超低溫冷藏箱購(gòu)自山東博科（型號(hào)BDF-86V348）；Trizol試劑購(gòu)自于齊一生物科技（上海）有限公司（批號(hào)ml095476）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)4366596）、qRT-PCR 試劑盒（批號(hào)11791200）、qRT-PCR 儀均購(gòu)自于賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司（型號(hào)Pikoreal）；生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成，引物序列：miR-34a 正向：5'-TCTGTCTCTCTTGGCAGTGTCTT-3'，反向5'-AATGGTTGTTCTCCACTCTCTCTC-3'；U6 正向：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；反向5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；sirt1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司（批號(hào)ml038429）。

1.4 觀察指標(biāo) 收集入組者臨床資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、入院時(shí)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（the National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)分[8]、梗死體積。

1.5 方 法

1.5.1 樣品采集 采集所有受試者空腹靜脈血3～5 mL，離心（3000 r/min，10 min）取上清液后，儲(chǔ)存于-80 ℃。

1.5.2 DSA 檢查及側(cè)支循環(huán)評(píng)估 在右側(cè)股動(dòng)脈處進(jìn)行穿刺（改良的Seldinger 穿刺技術(shù)），放入5F 動(dòng)脈鞘。在主動(dòng)脈弓處置入5F 的Pigtail 導(dǎo)管，進(jìn)行造影。雙側(cè)頸總動(dòng)脈、雙側(cè)椎動(dòng)脈處、雙側(cè)鎖骨下動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈在更換5F 椎動(dòng)脈造影管后進(jìn)行DSA 檢查。采用ASITN/SIR 血流分級(jí)系統(tǒng)對(duì)其側(cè)支循環(huán)進(jìn)行評(píng)估[9]，分為側(cè)支循環(huán)不良組（0～1 級(jí)）和側(cè)支循環(huán)良好組（2～4 級(jí)）。

1.5.3 qRT-PCR 法檢測(cè)血清miR-34a 表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)血清miR-34a 水平。在各血清樣品中加入Trizol 試劑進(jìn)行總RNA 的提取，并檢測(cè)其純度。嚴(yán)格按照RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒試驗(yàn)步驟將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)，其中以U6 為對(duì)照。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-34a 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5.4 ELISA 法檢測(cè)血清sirt1 表達(dá)水平 采用特定的ELISA 試劑盒檢測(cè)血清中sirt1 水平，其具體操作步驟嚴(yán)格遵守試劑盒說(shuō)明書。

1.6 隨 訪 對(duì)AIS 患者進(jìn)3 個(gè)月的隨訪評(píng)估其神經(jīng)功能恢復(fù)狀態(tài)，采用改良Rankin 量表評(píng)分[10]，當(dāng)分?jǐn)?shù)≤2 分時(shí)表示預(yù)后良好，＞2 分時(shí)則表示預(yù)后不良。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。miR-34a、sirt1 水平對(duì)AIS 患者預(yù)后的診斷價(jià)值通過(guò)受試者工作特征曲線（ROC）進(jìn)行分析。AIS 患者發(fā)生不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素通過(guò)多因素Logistic 進(jìn)行分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組研究對(duì)象一般臨床資料比較 對(duì)照組、側(cè)支循環(huán)不良組、側(cè)支循環(huán)良好組之間的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），側(cè)支循環(huán)不良組患者入院時(shí)NIHSS 評(píng)分、梗死體積較側(cè)支循環(huán)良好組較高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組研究對(duì)象一般臨床資料比較

2.2 各組研究對(duì)象血清miR-34a、sirt1 表達(dá)水平比較 miR-34a 水平在側(cè)支循環(huán)不良組、側(cè)支循環(huán)良好組中顯著高于對(duì)照組，而且側(cè)支循環(huán)不良組較側(cè)支循環(huán)良好組miR-34a 水平升高（P＜0.05）；sirt1 水平側(cè)支循環(huán)不良組、側(cè)支循環(huán)良好組中顯著低于對(duì)照組，而且側(cè)支循環(huán)不良組較側(cè)支循環(huán)良好組水平下降（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組研究對(duì)象血清miR-34a、sirt1 表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組研究對(duì)象血清miR-34a、sirt1 表達(dá)水平比較（±s）

注：sirt1 為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與側(cè)支循環(huán)良好組比較，bP＜0.05

組別對(duì)照組側(cè)支循環(huán)良好組側(cè)支循環(huán)不良組F 值P 值例數(shù)60 51 36 miR-34a/U6 1.02±0.28 1.69±0.51a 2.46±0.67ab 101.966<0.001 sirt1（μg/L）2.16±0.54 1.06±0.27a 0.64±0.16ab 203.098<0.001

2.3 AIS 預(yù)后良好與預(yù)后不良患者miR-34a、sirt1水平及相關(guān)指標(biāo)比較 預(yù)后良好組73 例，預(yù)后不良組14 例。與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組AIS 患者血清miR-34a 水平、入院時(shí)NIHSS 評(píng)分、梗死體積較高（P＜0.05），而sirt1 水平較低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 AIS 預(yù)后良好與預(yù)后不良患者miR-34a、sirt1 水平及相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表3 AIS 預(yù)后良好與預(yù)后不良患者miR-34a、sirt1 水平及相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

注：sirt1 為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；NIHSS 為美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表

組別預(yù)后良好組預(yù)后不良組t 值P 值例數(shù)73 14 miR-34a/U6 1.86±0.55 2.78±0.71 5.462<0.001 sirt1（μg/L）0.94±0.24 0.61±0.14 4.970<0.001 NIHSS 評(píng)分（分）11.79±3.36 19.75±4.61 7.622<0.001梗死體積（cm3）6.13±2.34 10.57±3.32 6.051<0.001

2.4 ROC 曲線分析miR-34a、sirt1 水平對(duì)AIS 患者預(yù)后的診斷價(jià)值 miR-34a、sirt1 水平對(duì)AIS 患者預(yù)后不良的診斷AUC 分別為0.830、0.840，截?cái)嘀捣謩e為2.216，0.807 μg/L，敏感性分別為85.70%、92.90%，特異性分別為65.80%、69.90%。見(jiàn)表4，圖1。

圖1 miR-34a、sirt1 水平對(duì)AIS 患者預(yù)后診斷價(jià)值的ROC曲線

表4 ROC 曲線分析血清miR-34a、sirt1 水平對(duì)AIS 患者預(yù)后的診斷價(jià)值

2.5 AIS 患者不良預(yù)后多因素Logistic 分析 以NIHSS 評(píng)分、梗死體積、miR-34a 及sirt1 水平為自變量，以表3 中為P＜0.05 的指標(biāo)因變量進(jìn)行Logistic多因素分析，結(jié)果顯示，梗死體積、miR-34a 水平是AIS 患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高水平sirt1 是其獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 AIS 患者不良預(yù)后多因素Logistic 分析

3 討 論

AIS 是指腦部組織局部發(fā)生供血不足或者完全中斷，而造成腦組織環(huán)死的疾病[10]?；颊叩娜毖氚祹?、梗死體積、病情嚴(yán)重程度及預(yù)后與側(cè)支循環(huán)的形成有密切的關(guān)系[11]。目前腦血管造影是臨床上評(píng)估側(cè)支循環(huán)的有效標(biāo)準(zhǔn)，但是需要進(jìn)行侵入操作，部分患者因某些原因并不能接受，因此尋找簡(jiǎn)單、快速有效的生物標(biāo)志物對(duì)側(cè)支循環(huán)的形成及AIS 患者的預(yù)后有重要的意義。

細(xì)胞增殖、分化是新血管生成的重要依據(jù)。miRNA 在轉(zhuǎn)錄后與靶基因結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用，在心腦血管疾病中扮演著重要角色。miR-34a 在腦、心等血管內(nèi)皮生成、細(xì)胞凋亡中有重要作用[12]。趙茹等[13]研究表明，AIS 側(cè)支循環(huán)不良組患者入院時(shí)大面積腦梗死例數(shù)、NIHSS 評(píng)分顯著高于側(cè)支循環(huán)良好組。在本研究中，與對(duì)照組相比，側(cè)支循環(huán)良好組、側(cè)支循環(huán)不良組患者血清miR-34a 明顯上調(diào)，而且側(cè)支循環(huán)不良組較側(cè)支循環(huán)良好組miR-34a 水平、NIHSS評(píng)分、梗死體積較高，提示miR-34a 可能參與了AIS患者側(cè)支循環(huán)的形成。

sirt1 是miR-34a 潛在的靶基因之一，是一種依賴NAD+的去乙?；?，具有保護(hù)細(xì)胞，抗炎癥反應(yīng)的作用[14]。鄢曉麗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，血清sirt1 水平在慢性心力衰竭患者中明顯降低，且心功能分級(jí)越差，sirt1 水平越低。有研究證實(shí)，miR-34a通過(guò)靶向調(diào)節(jié)sirt1，能夠保護(hù)細(xì)胞，從而減少細(xì)胞凋亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，sirt1 水平側(cè)支循環(huán)不良組、側(cè)支循環(huán)良好組中顯著低于對(duì)照組，而且側(cè)支循環(huán)不良組較側(cè)支循環(huán)良好組水平下降，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示sirt1 參與了AIS 患者側(cè)支循環(huán)的形成。

朱艷玲等[17]研究證實(shí)，腦梗死后認(rèn)知功能障礙患者外周血miR-34a、sirt1 水平呈異常表達(dá)，并表明高水平miR-34a 是影響其發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高水平sirt1 是影響其發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組AIS 患者血清miR-34a 水平較高，而sirt1 水平較低，提示miR-34a、sirt1 水平的異常表達(dá)可能與AIS 患者的不良預(yù)后有關(guān)。miR-34a、sirt1 水平診斷AIS 患者預(yù)后不良AUC 分別為0.830、0.840，敏感性分別為85.70%、92.90%，特異性分別為65.80%、69.90%，提示miR-34a、sirt1 對(duì)AIS 患者是否發(fā)生不良預(yù)后有較高的預(yù)測(cè)效能，且當(dāng)miR-34a 水平大于2.216，sirt1 水平<0.807 μg/L 時(shí)，AIS 患者有發(fā)生不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，AIS 患者miR-34a 水平升高，而sirt1水平下降，二者均對(duì)AIS 患者是否發(fā)生不良預(yù)后有較高的預(yù)測(cè)效能。但本研究仍存在一些問(wèn)題，如樣本量較少，患者的隨訪時(shí)間較短，需進(jìn)一步深入研究miR-34a、sirt1 與AIS 復(fù)雜機(jī)制之間的關(guān)系。