參附湯提取物經(jīng)miRNA-1 調(diào)控HSP70 表達對心力衰竭模型大鼠線粒體功能的影響

柴樹人 楊 征 賈旭錦

心力衰竭以心肌收縮力降低、心排出量不足為主要病理改變，是多種心臟疾病的終末階段，我國成人心力衰竭的發(fā)生率大約為0.9%，且隨著我國老齡化的加劇發(fā)病率逐年升高[1]。線粒體能量代謝障礙、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應(yīng)激損傷等均可導(dǎo)致心力衰竭進展，熱休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）具有保護心肌細胞線粒體功能[2-3]。微小RNA-1（MicroRNA-1，miRNA-1）具有促進心肌細胞凋亡的作用，而HSP70 屬于miRNA-1 的靶基因，在抑制miRNA-1 表達后HSP70 升高，可逆轉(zhuǎn)心肌損傷，減少心肌細胞凋亡[4]。參附湯是治療心力衰竭的經(jīng)典方，參附湯提取物人參皂苷Rg1 與去甲烏藥堿（HG）均具有明確的強心、抗細胞凋亡作用[5-6]。本研究探討參附湯提取物HG 聯(lián)合人參皂苷Rg1 通過miRNA-1調(diào)控HSP70 表達對心肌損傷細胞線粒體功能的保護機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 依據(jù)n=[（Zα/2+Zβ）*σ/δ]2實驗動物樣本量計算公式計算本研究所需樣本量[7]，共分5 組，每組20 只，選取無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級SD 大鼠100 只，8～10 周齡，體質(zhì)量200～240 g，雌雄各半，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司[動物許可證號：SCXK（京）2019-0010]，均在明暗周期12 h、22～28℃、45%～50%相對濕度環(huán)境下，自由飲食，預(yù)飼養(yǎng)1 周。所有動物實驗均獲得天津中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的批準（批準號：20220208）。

1.2 主要試劑及儀器 主要試劑：阿霉素（山西普德藥業(yè)有限公司，批號20220501），HG（去甲烏藥堿鹽酸鹽）（純度98%，20 mg/瓶，上海遠慕生物科技有限公司，批號20220612），人參皂苷Rg1（純度＞98%，20 mg/支，成都曼斯特生物科技有限公司，批號20220521），腦鈉肽（Brain natriuretic peptide，BNP）試劑盒（上海酶研生物科技有限公司，批號20220614），HSP70 試劑盒（上海梵態(tài)生物科技有限公司，批號20220724）。主要儀器：小動物超聲儀（X5彩色多普勒超聲成像儀，上海玉研科學(xué)儀器有限公司），顯微鏡（LEXT OLS5100 型，奧林巴斯（中國）有限公司）；酶標儀（LD-96A 型，山東萊恩德智能科技有限公司）；透射電鏡（LVEM 5 型，Quantum Design公司）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）儀（Applied Biosystems 型，賽默飛世爾科技公司）。

1.3 方 法

1.3.1 分組及建模 隨機數(shù)字表法選取100 只中20只作為正常組，剩余80 只大鼠建立阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭模型大鼠，將阿霉素（4 mg/kg）注射入大鼠腹腔注射，1 次/周，連續(xù)6 周[8]。第7、8 周觀察大鼠一般情況，在第8 周末使用超聲心動圖檢驗建模是否成功，若大鼠心功能指標均較正常組有明顯改變則說明心力衰竭模型建立成功。建模成功后分為模型組、HG 組、Rg1 組、HG/Rg1 組，每組各20 只。

1.3.2 給 藥

1.3.2.1 HG 制備 20 mg HG 藥品中加入200 μL二甲基亞砜，振蕩均勻，4 ℃冰箱保存。使用時，15 mL EP 管中加入200 μL HG 溶液，0.9%生理鹽水定容至4 mL，即為5 mg/mL 的溶劑。

1.3.2.2 人參皂苷Rg1 制備 20 mg 人參皂苷Rg1藥品中加入200 μL 二甲基亞砜，振蕩均勻，4 ℃冰箱保存。使用時，15 mL EP 管中加入200 μL 人參皂苷Rg1 溶液，0.9%生理鹽水定容至4 mL，即為5 mg/mL的溶劑。

1.3.2.3 給藥方法 HG 組、Rg1 組分別于左側(cè)大腿股骨溝處注射5 mg/kg HG、人參皂苷Rg1，HG/Rg1組左側(cè)大腿股骨溝聯(lián)合注射HG、人參皂苷Rg1，正常組、模型組注射等劑量的生理鹽水。每天1 次，連續(xù)4 周。

1.4 觀察指標

1.4.1 心功能測定 使用小動物超聲儀測定大鼠心功能，包括左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，EF）、左心室短軸縮短率（left ventricular short-axis shortening rate，F(xiàn)S）。

1.4.2 BNP 測定 采集大鼠腹主動脈血，分離血清后使用BNP 檢測試劑盒測定BNP 水平。

1.4.3 心肌組織采集 給藥結(jié)束后次日，使用40 mg/kg 的戊巴比妥鈉麻醉后脫頸處死大鼠，迅速取心肌組織，冷凍保存后備用。

1.4.4 心肌病理組織學(xué)觀察 取心肌組織，在甲醛中固定后脫水、透明、包埋、切5 μm 的薄片后行蘇木素-伊紅（HE）染色，使用顯微鏡觀察心肌組織病理改變情況。

1.4.5 心肌組織HSP70 測定 取心肌組織，制備為組織勻漿后，使用HSP70 檢測試劑盒測定心肌組織中HSP70 表達水平。

1.4.6 線粒體功能指標測定 取心肌組織，裂解獲得心肌細胞后使用酶標儀測定線粒體功能指標三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）。

1.4.7 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 取心肌組織，固定24 h后脫水、包埋、超薄切片，采用飽和醋酸鈾和枸櫞酸鉛分步染色，各5～10 min，將制作好的超薄切片放在透射電鏡下進行觀察。

1.4.8 心肌組織miRNA-1 測定 使用實時熒光定量PCR 法測定心肌組織miRNA-1 表達量，提取并測定組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為反應(yīng)模板，做PCR 擴增，擴增體系：0.4 μL miRNA-1 上游引物、0.4 μL miRNA-1 下游引物、1 μL cDNA 模板、10 μL SYB Green，加蒸餾水至20 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性1 min、55 ℃1 min、72 ℃1 min，72 ℃延申5 min，40 個循環(huán)，采用2-△△Ct方法計算miRNA-1表達量。miRNA-1 上游引物序列：5'-CTGTGGAATGTAAAGAAGTATGTAT-3'，下游引物序列：5'-CGAGGAAGAAGACGGAAGAAT-3'；內(nèi)參GAPDH 上游引物序列：5'-AATGCATCCTGCCACCAACTGC-3'，下游引物序列：5'-CCAGGCCATGTAGTAGGCCATGAGGTC-3'，引物序列合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0 軟件處理。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較單因素方差分析（ANOVA），兩兩對比采用LSD-t 檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)、四分位間距[M（Q1，Q3）]表示，組間采用Wilcoxon 比較。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心力衰竭模型驗證 心力衰竭模型大鼠心功能參數(shù)較正常組明顯改變（P＜0.05），說明心力衰竭模型建立成功。見表1。

表1 正常組、心力衰竭組大鼠心功能參數(shù)比較（±s）

表1 正常組、心力衰竭組大鼠心功能參數(shù)比較（±s）

注：LVESD 為左心室收縮末期內(nèi)徑；LVEDD 為左心室舒張末期內(nèi)徑；EF 為左室射血分數(shù)；FS 為左心室短軸縮短率；與正常組比較，aP＜0.05

組別正常組心力衰竭組鼠數(shù)20 80 LVESD（mm）3.12±0.78 7.86±0.12a LVEDD（mm）6.10±1.12 11.80±0.31a EF（%）87.68±7.98 56.89±3.42a FS（%）50.98±4.53 25.64±2.12a

2.2 各組大鼠給藥后心功能參數(shù)比較 與正常組比較，模型組LVESD、LVEDD 升高，EF、FS 降低（P＜0.05）；與模型組比較，HG 組、Rg1 組、HG/Rg1 組LVESD、LVEDD 降低，EF、FS 升高（P＜0.05）；與HG組、Rg1 組比較，HG/Rg1 組LVESD、LVEDD 降低，EF、FS 升高（P＜0.05）。HG 組、Rg1 組心功能參數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠給藥后心功能參數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠給藥后心功能參數(shù)比較（±s）

注：HG 組、Rg1 組分別于左側(cè)大腿股骨溝處注射5 mg/kg 去甲烏藥堿、5 mg/kg 人參皂苷Rg1；HG/Rg1 組左側(cè)大腿股骨溝聯(lián)合注射去甲烏藥堿、人參皂苷Rg1；正常組、模型組注射等劑量的生理鹽水；LVESD 為左心室收縮末期內(nèi)徑；LVEDD 為左心室舒張末期內(nèi)徑；EF 為左室射血分數(shù)；FS 為左心室短軸縮短率；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與HG 組比較，cP＜0.05；與Rg1 組比較，dP＜0.05

組別正常組模型組HG 組Rg1 組HG/Rg1 組鼠數(shù)20 20 20 20 20 LVESD（mm）3.14±0.68 9.08±1.12a 7.11±0.24ab 7.18±0.31ab 4.78±0.69abcd LVEDD（mm）6.13±1.14 15.63±2.41a 13.02±2.31ab 13.10±2.18ab 8.85±2.12abcd EF（%）87.96±9.08 50.98±5.62a 61.67±4.53ab 62.43±4.76ab 76.89±7.96abcd FS（%）51.43±3.42 23.54±3.41a 32.98±3.42ab 32.65±3.65ab 45.75±3.42abcd

2.3 各組大鼠給藥后BNP 比較 與正常組比較，模型組BNP 升高（P＜0.05）；與模型組比較，HG 組、Rg1組、HG/Rg1 組BNP 降低（P＜0.05）；與HG 組、Rg1 組比較，HG/Rg1 組BNP 降低（P＜0.05）。HG 組、Rg1 組BNP 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠給藥后BNP 比較（ng/mL，±s）

表3 各組大鼠給藥后BNP 比較（ng/mL，±s）

注：HG 組、Rg1 組分別于左側(cè)大腿股骨溝處注射5 mg/kg 去甲烏藥堿、5 mg/kg 人參皂苷Rg1；HG/Rg1 組左側(cè)大腿股骨溝聯(lián)合注射去甲烏藥堿、人參皂苷Rg1；正常組、模型組注射等劑量的生理鹽水；BNP為腦鈉肽；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與HG 組比較，cP＜0.05；與Rg1 組比較，dP＜0.05

組別正常組模型組HG 組Rg1 組HG/Rg1 組鼠數(shù)20 20 20 20 20 BNP 33.12±3.21 77.89±4.52a 70.42±4.52ab 70.83±6.12ab 43.32±4.86abcd

2.4 各組大鼠給藥后心肌病理組織學(xué)觀察 正常組心肌形態(tài)正常，無病理改變，心肌纖維排列有序。模型組心肌纖維斷裂、疏松，甚至消失，心肌細胞變性、腫大，部分心肌纖維消失。HG 組、Rg1 組、HG/Rg1 組心肌細胞改變較模型組明顯被修復(fù)，心肌纖維有少量斷裂，以HG/Rg1 組修復(fù)更顯著。見圖1。

圖1 心肌病理組織學(xué)HE 觀察圖（200×）

2.5 各組大鼠給藥后線粒體功能指標比較 與正常組比較，模型組ATP、MMP 降低，ROS 升高（P＜0.05）；與模型組比較，HG 組、Rg1 組、HG/Rg1 組ATP、MMP升高，ROS 降低（P＜0.05）；與HG 組、Rg1 組比較，HG/Rg1 組ATP、MMP 升高，ROS 降低（P＜0.05）。HG 組、Rg1 組線粒體功能指標比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠給藥后線粒體功能指標比較（±s）

表4 各組大鼠給藥后線粒體功能指標比較（±s）

注：HG 組、Rg1 組分別于左側(cè)大腿股骨溝處注射5 mg/kg 去甲烏藥堿、人參皂苷Rg1；HG/Rg1 組左側(cè)大腿股骨溝聯(lián)合注射去甲烏藥堿、人參皂苷Rg1；正常組、模型組注射等劑量的生理鹽水；ATP 為三磷酸腺苷；ROS 為活性氧；MMP 為線粒體膜電位；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與HG 組比較，cP＜0.05；與Rg1 組比較，dP＜0.05

組別正常組模型組HG 組Rg1 組HG/Rg1 組鼠數(shù)20 20 20 20 20 ATP（μg/L）745.17±38.89 309.90±32.41a 563.73±45.32ab 560.98±46.22ab 649.07±71.32abcd ROS（U/L）42.34±4.51 70.98±8.94a 53.62±4.51ab 54.24±6.13ab 65.64±6.71abcd MMP（ng/mL）2.65±0.21 0.60±0.12a 1.56±0.19ab 1.60±0.21ab 2.13±0.23abcd

2.6 各組大鼠給藥后線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 正常組大鼠心肌線粒體體積勻稱，大小均衡，排列較規(guī)則，有完整的線粒體嵴、線粒體膜，明暗帶清晰可見。模型組大鼠心肌線粒體體積、大小不一，線粒體腫脹肥大，線粒體嵴斷裂溶解，線粒體膜缺失，肌纖維排列紊亂甚至缺失。HG 組、Rg1 組、HG/Rg1 組線粒體結(jié)構(gòu)較模型組明顯被修復(fù)，線粒體體積增大，以HG/Rg1 組修復(fù)更顯著。見圖2。

圖2 大鼠線粒體超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察圖（15000×）

2.7 各組大鼠給藥后HSP70、miRNA-1 表達比較與正常組比較，模型組HSP70 降低，miRNA-1 升高（P＜0.05）；與模型組比較，HG 組、Rg1 組、HG/Rg1 組HSP70 升高，miRNA-1 降低（P＜0.05）；與HG 組、Rg1組比較，HG/Rg1 組HSP70 升高，miRNA-1 降低（P＜0.05）。HG 組、Rg1 組HSP70、miRNA-1 表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠給藥后HSP70、miRNA-1 表達比較（±s）

表5 各組大鼠給藥后HSP70、miRNA-1 表達比較（±s）

注：HG 組、Rg1 組分別于左側(cè)大腿股骨溝處注射5 mg/kg 去甲烏藥堿、人參皂苷Rg1；HG/Rg1 組左側(cè)大腿股骨溝聯(lián)合注射去甲烏藥堿、人參皂苷Rg1；正常組、模型組注射等劑量的生理鹽水；HSP70 為熱休克蛋白70；miRNA-1 為微小RNA-1；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與HG 組比較，cP＜0.05；與Rg1 組比較，dP＜0.05

組別正常組模型組HG 組Rg1 組HG/Rg1 組鼠數(shù)20 20 20 20 20 HSP70（吸光度）3.38±0.21 0.53±0.05a 1.12±0.10ab 1.15±0.12ab 2.34±0.17abcd miRNA-1 0.78±0.09 3.54±0.23a 2.24±0.35ab 2.20±0.28ab 1.32±0.11abcd

3 討 論

心肌線粒體是為心臟提供ATP 的細胞器，在心力衰竭中心肌細胞凋亡、心肌氧化應(yīng)激等病理改變均與線粒體功能有關(guān)[9]。目前雖然多種藥物已經(jīng)用于心力衰竭的治療，但由于藥物自身毒性、心力衰竭病因的多樣性，臨床應(yīng)用具有一定局限。

中醫(yī)認為心力衰竭本虛標實、虛實夾雜，治療應(yīng)以益氣溫陽為主，參附湯作為益氣溫陽的常用方劑，具有改善心室重構(gòu)、促進心功能恢復(fù)的作用[10]?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參皂苷類具有強心、提高射血分數(shù)、改善心室重構(gòu)、改變血流動力學(xué)的作用，主要通過調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/內(nèi)皮一氧化氮合酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制心肌細胞凋亡，影響肌質(zhì)網(wǎng)、線粒體等的鈣交流，介導(dǎo)心肌細胞內(nèi)線粒體膜電位，從而達到改善心力衰竭的目的[11-13]。HG 是從附子中分離出的有效強心成分，目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，其在心血管方面具有多重作用，如抑制心肌細胞凋亡、增強心力衰竭細胞活性、舒張血管、減輕心肌缺血再灌注損傷等，主要經(jīng)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號通路，作用于線粒體依賴性細胞凋亡相關(guān)細胞色素C 釋放和Bax 活性而發(fā)揮抗心肌細胞凋亡，從而改善心力衰竭[14-15]。在本研究中，將參附湯提取物HG、人參皂苷Rg1 用于心力衰竭大鼠模型中，結(jié)果顯示，在給藥后心力衰竭大鼠心功能均得到明顯改善，心肌損傷明顯被修復(fù)，且與HG、人參皂苷Rg1 單獨給藥相比，兩者聯(lián)合作用更強，此結(jié)果說明，HG、人參皂苷Rg1 配伍更能充分發(fā)揮強心作用。

心肌能量代謝異?？烧T發(fā)心力衰竭，ATP 屬于心肌細胞線粒體的主要能量物質(zhì)來源，而ROS 作用與ATP 相反，ROS 增加可導(dǎo)致心肌氧化損傷、心肌細胞凋亡[16-17]。心力衰竭發(fā)生后，大量的脂肪酸堆積至心肌細胞中，線粒體內(nèi)膜解偶聯(lián)蛋白生成增加，導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)孔持續(xù)開放，ROS 快速分泌，ROS經(jīng)破壞DNA 抑制ATP 生成，此時表現(xiàn)為ROS 含量增加，ATP、MMP 降低[18]。進一步分析HG、人參皂苷Rg1 對心力衰竭大鼠線粒體功能的影響，結(jié)果顯示，使用HG、人參皂苷Rg1 聯(lián)合干預(yù)的大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)改變明顯被修復(fù)，且ATP、MMP 增加，ROS 降低，提示HG、人參皂苷Rg1 可能經(jīng)改善線粒體功能障礙發(fā)揮抗心力衰竭的作用。

報道發(fā)現(xiàn)，在心力衰竭線粒體功能障礙發(fā)生過程中涉及多個分子機制，HSP70 作為熱休克蛋白，在心力衰竭中屬于一種保護性反應(yīng)機制，可維持鈣離子動態(tài)平衡，保護心肌細胞，減少鈣離子減少介導(dǎo)的心肌多位點損傷，同時經(jīng)修復(fù)細胞質(zhì)、核糖體、DNA、RNA 合成損傷，恢復(fù)Na-K-ATP 酶活性[19-21]。而HSP70在心力衰竭中的保護作用受短鏈非編碼RNA 家族的影響，miRNA-1 在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)調(diào)節(jié)鈣離子通道、心臟電活動相關(guān)蛋白質(zhì)誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，而作為HSP70 的下游靶基因，miRNA-1 表達升高抑制HSP70 誘導(dǎo)心肌線粒體自噬，加重心肌損傷[22-23]。在本研究中，進一步分析HG、人參皂苷Rg1 改變心力衰竭大鼠線粒體障礙的途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSP70 在使用HG、人參皂苷Rg1 干預(yù)的心力衰竭大鼠中表達升高，而miRNA-1 表達降低，此結(jié)果提示著參附湯提取物HG 聯(lián)合人參皂苷Rg1 可能經(jīng)抑制miRNA-1上調(diào)HSP70 而維護線粒體結(jié)構(gòu)和功能不受破壞，從而保護心肌細胞。

綜上所述，參附湯提取物HG 聯(lián)合人參皂苷Rg1具有調(diào)節(jié)阿霉素致大鼠心力衰竭心肌細胞線粒體功能的作用，其可能經(jīng)抑制miRNA-1 上調(diào)HSP70 而維護線粒體結(jié)構(gòu)和功能不受破壞，從而保護心肌細胞。