冠心寧治療急性心肌梗死后心力衰竭大鼠作用機(jī)制研究

廖 駿 沈瑋蕓 孫啟銀 柳元化

急性心肌梗死后心力衰竭具有心功能?chē)?yán)重?fù)p傷，治療難度大等特點(diǎn)，也是導(dǎo)致直接經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）患者住院病死的主要原因[1-2]。西醫(yī)在治療急性心肌梗死后心力衰竭時(shí)多通過(guò)擴(kuò)血管、利尿、抑制血小板聚集等方式，其中氯吡格雷可抑制血小板聚集，對(duì)患者的臨床癥狀具有一定的改善效果[3]。炎癥及氧化應(yīng)激會(huì)引發(fā)心肌細(xì)胞死亡及心力衰竭，而磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路也與心力衰竭的發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心力衰竭的病機(jī)與邪痹心絡(luò)，氣血不暢有關(guān)。冠心寧是一種中成藥，具有活血化瘀、通脈養(yǎng)心的功效，且前期研究顯示，冠心寧可促進(jìn)心力衰竭患者氧自由基清除、抑制炎癥反應(yīng)，改善心功能，但關(guān)于其抗心力衰竭的具體機(jī)制仍存在一定爭(zhēng)議[6-7]。本研究探討冠心寧治療急性心肌梗死后心力衰竭大鼠的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 50 只SPF 級(jí)成年雄性SD 大鼠均來(lái)自河南省鄭州市華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量180～220（200.46±15.74）g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2022-0021。均飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房，研究符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理規(guī)定，且經(jīng)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理號(hào)：YFY-DW20210039。造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周，常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 藥品 冠心寧（正大青春寶藥業(yè)，規(guī)格0.38g/片，批號(hào)Z20190028）；氯吡格雷[賽諾菲（杭州）制藥有限公司，規(guī)格75 mg，批號(hào)4A689]。

1.2.2 藥品制備 冠心寧：將0.38g 片劑溶解于20mL超純水中，即每毫升水中含0.019 g 冠心寧。氯吡格雷：將75 mg 氯吡格雷溶解于25 mL 超純水中，即每毫升水中含3 mg 氯吡格雷，需要時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 試 劑 磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抗體（abcam 公司，批號(hào)Ab86714）；蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（CST 公司，批號(hào)#9272）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測(cè)試劑盒，ROS、T-AOC 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司（批號(hào)20210507、20210704）；血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海紀(jì)寧生物科技有限公司（批號(hào)20210408、20210715）。

1.3 儀 器 小動(dòng)物簡(jiǎn)易呼吸機(jī)（美國(guó)Harvard Apparatus 公司，TKR-200C 型）；熒光酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司，SpectraMax M3 型）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，PowerPac HC 型）；電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，Gene Pulser MXcell 型）；灰度掃描儀（美國(guó)GE 公司，Image ScannerⅢ型）；離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，Multifuge X1R）；PowerLab 型生理記錄儀（上海然哲儀器設(shè)備有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica 公司，DMI 3006 型）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 急性心肌梗死后心力衰竭造模 50 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠均采取結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法進(jìn)行造模。術(shù)前禁食禁飲12 h，采用腹腔注射50 mg/kg 2%戊巴比妥鈉麻醉后仰臥位固定，常規(guī)消毒胸部皮膚行氣管插管（連接小動(dòng)物簡(jiǎn)易呼吸機(jī)），在左側(cè)胸部做一斜切口（切口方向從右下至左上），鈍性分離胸肌，第4 肋間切開(kāi)肋間?。ㄑ叵挛焕吖巧暇壏较颍┻M(jìn)入胸腔，并對(duì)第4、5 肋間隙進(jìn)行擴(kuò)大、固定操作，之后采用鑷子撕開(kāi)心包，將心臟擠壓至胸腔外，迅速對(duì)左冠狀動(dòng)脈前降支下2 mm 位置進(jìn)行結(jié)扎，將心臟歸位后觀察心電圖變化，無(wú)異常后，逐層縫合。造模成功判定：術(shù)后左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）＜50%。

2.2 分組及給藥劑量 50 只大鼠中45 只造模成功，5 只死亡，采用隨機(jī)數(shù)字表法將45 只造模成功的大鼠分為空白對(duì)照組、氯吡格雷組及冠心寧組，每組各15 只。參照《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[8]，按照動(dòng)物公斤體質(zhì)量劑量換算公式dB=DA×K（K 為人公斤體質(zhì)量劑量換算系數(shù)，為6.25），設(shè)大鼠為B，人為A，計(jì)算出冠心寧d 大鼠=33.94 mg/kg；氯吡格雷d 大鼠=6.69 mg/kg?？瞻讓?duì)照組：給予超純水1.0 mL/kg 灌胃，每天1 次，連續(xù)喂養(yǎng)4 周。氯吡格雷組：依據(jù)上述換算的給藥劑量及配藥濃度，給予2.23 mL/d 氯吡格雷藥液灌胃，連續(xù)喂養(yǎng)4 周。冠心寧組：每只給予1.78 mL/d 冠心寧藥液灌胃，連續(xù)喂養(yǎng)4 周。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 心肌超微結(jié)構(gòu) 取大鼠心肌組織，在4 ℃環(huán)境中，2.5%戊二醛固定24 h，1%鋨酸固定1 h，包埋切片，取3 片銅網(wǎng)/個(gè)心肌組織，采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.3.2 心肌組織中PI3K、AKT 表達(dá) 取大鼠心肌組織，按150～250 μL 裂解液/20 mg 組織比例提取心肌組織蛋白并測(cè)量濃度，之后對(duì)80 μg 蛋白進(jìn)行SDSPAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜操作，5%脫脂奶粉封閉處理，加入一抗P13K（1∶1000），AKT（1∶1000），在4 ℃環(huán)境中孵育過(guò)夜，加入二抗，37 ℃下孵育1 h，ECL 顯色，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，采用灰度掃描儀分析蛋白條帶灰度值。

2.3.3 心肌組織中氧化應(yīng)激因子 ROS：取大鼠心肌組織缺血部位，剪碎并加入胰酶消化液，37℃下混合裂解、過(guò)濾，離心（1200 r/min，離心10 min）處理后取下層沉淀物，并應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)液制成1×105個(gè)/mL單細(xì)胞懸液。按照體積比1∶1000[27'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2'7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）：無(wú)血清培養(yǎng)液]，培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA探針，加入單細(xì)胞懸液使其最終濃度維持在10μmol/L，37 ℃下孵育20 min 后，采用熒光酶標(biāo)儀在525 nm波長(zhǎng)處測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的熒光值（fluorescence units，F(xiàn)U）。測(cè)量完畢，將組織置于4 ℃下裂解離心后（13000 r/min，離心15 min）取上清液?？偟鞍缀坎捎肂CA 法檢測(cè)，ROS 水平為FU/蛋白含量。T-AOC：取大鼠心肌缺血區(qū)域組織，剪碎，按照100 μL 磷酸鹽緩沖液/20 mg 組織比例放置在4 ℃環(huán)境中勻漿，并以12000 r/min，離心5 min 后取上清液備用。按2020 μL 標(biāo)準(zhǔn)液/個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、20 μL 上清液/個(gè)樣品測(cè)試孔進(jìn)行調(diào)配，室溫孵育15 min 后，采用熒光酶標(biāo)儀在515 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（optical density，OD）值，T-AOC 水平依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算。

2.3.4 血清TNF-α、TGF-β1 水平 按照標(biāo)準(zhǔn)品次序在酶標(biāo)板內(nèi)依次加入100 μL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，空白孔內(nèi)加入100 μL 待測(cè)樣品，空白對(duì)照組加入100 μL PBS。各孔加入50 μL 酶標(biāo)記溶液，將酶標(biāo)板應(yīng)用封閉膜密封后放置在37 ℃環(huán)境中孵育1 h，充分沖洗酶標(biāo)板5 次，洗滌后將酶標(biāo)板徹底拍干再在各孔中分別加入顯色劑A、B 各50 μL，在37 ℃環(huán)境中避光反應(yīng)15 min，各孔分別加50 μL 終止液終止反應(yīng)，15 min 內(nèi)采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度得出血清TNF-α、TGF-β1 水平。

2.3.5 心臟彩超指數(shù) 將大鼠以仰臥位姿勢(shì)固定在恒溫加熱板上，四肢固定在4 個(gè)金屬極片上，充分暴露左前胸，將超聲心動(dòng)圖探頭放置在胸骨左緣，用2D 超聲取左心室長(zhǎng)軸切面，在M 型超聲模式下測(cè)定左室室間隔收縮期厚度（IVSs）、左室室間隔舒張期厚度（IVSd）、左室短軸縮短率（LVFS）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)檢驗(yàn)的連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差進(jìn)行多組間比較，采用LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)比較 激光共聚焦顯微鏡下顯示，空白對(duì)照組心肌細(xì)胞肌源纖維排列紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷嚴(yán)重。氯吡格雷組心肌細(xì)胞肌原纖維排列稍整齊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷稍減輕。冠心寧組肌原纖維排列整齊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)

3.2 各組大鼠心肌組織PI3K、AKT 表達(dá)比較 氯吡格雷組、冠心寧組心肌組織PI3K、AKT 表達(dá)均高于空白對(duì)照組，且冠心寧組高于氯吡格雷組（P＜0.05）。見(jiàn)表1 和圖2。

表1 三組大鼠心肌組織中PI3K、AKT 表達(dá)比較（±s）

表1 三組大鼠心肌組織中PI3K、AKT 表達(dá)比較（±s）

注：空白對(duì)照組給予超純水灌胃；氯吡格雷組給予氯吡格雷藥液灌胃；冠心寧組給予冠心寧藥液灌胃；PI3K 為磷脂酰肌醇3-激酶；AKT為蛋白激酶B；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與氯吡格雷組比較，bP＜0.05

組別空白對(duì)照組氯吡格雷組冠心寧組鼠數(shù)15 15 15 PI3K 0.59±0.05 0.75±0.09a 0.84±0.11ab AKT 0.71±0.04 0.76±0.08a 0.91±0.13ab

圖2 3 組大鼠心肌組織中P13K、AKT 蛋白的電泳條帶注：空白對(duì)照組給予超純水灌胃；氯吡格雷組給予氯吡格雷藥液灌胃；冠心寧組給予冠心寧藥液灌胃；PI3K 為磷脂酰肌醇3-激酶；AKT 為蛋白激酶B；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶

3.3 各組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激因子水平比較 氯吡格雷組、冠心寧組心肌組織ROS 低于空白對(duì)照組，T-AOC 水平高于空白對(duì)照組，且冠心寧組心肌組織中ROS 低于氯吡格雷組，T-AOC 水平高于氯吡格雷組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激因子水平比較（±s）

表2 三組大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激因子水平比較（±s）

空白對(duì)照組給予超純水灌胃；氯吡格雷組給予氯吡格雷藥液灌胃；冠心寧組給予冠心寧藥液灌胃；ROS 為活性氧；T-AOC 為細(xì)胞總抗氧化能力；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與氯吡格雷組比較，bP＜0.05

組別空白對(duì)照組氯吡格雷組冠心寧組鼠數(shù)15 15 15 ROS 39.71±2.46 28.58±2.27a 21.43±2.18ab T-AOC（mmol/mg）0.13±0.03 0.28±0.05a 0.35±0.09ab

3.4 各組大鼠血清TNF-α、TGF-β1 水平比較 氯吡格雷組、冠心寧組血清TNF-α 水平低于空白對(duì)照組，TGF-β1 水平高于空白對(duì)照組，且冠心寧組血清TNF-α 水平低于氯吡格雷組，TGF-β1 水平高于氯吡格雷組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 三組大鼠血清TNF-α、TGF-β1 水平比較（ng/L，±s）

表3 三組大鼠血清TNF-α、TGF-β1 水平比較（ng/L，±s）

注：空白對(duì)照組給予超純水灌胃；氯吡格雷組給予氯吡格雷藥液灌胃；冠心寧組給予冠心寧藥液灌胃；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；TGFβ1 為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與氯吡格雷組比較，bP＜0.05

組別空白對(duì)照組氯吡格雷組冠心寧組鼠數(shù)15 15 15 TNF-α 104.85±10.89 78.64±8.55a 68.85±6.76ab TGF-β1 1652.28±146.93 2176.39±174.39a 2314.71±179.58ab

3.5 各組大鼠心臟彩超指標(biāo)比較 氯吡格雷組、冠心寧組IVSs 低于空白對(duì)照組，LVFS 高于空白對(duì)照組，且冠心寧組IVSs 低于氯吡格雷組，LVFS 高于氯吡格雷組（P＜0.05）。三組IVSd 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 三組大鼠心臟彩超指標(biāo)比較（±s）

表4 三組大鼠心臟彩超指標(biāo)比較（±s）

注：空白對(duì)照組給予超純水灌胃；氯吡格雷組給予氯吡格雷藥液灌胃；冠心寧組給予冠心寧藥液灌胃；IVSs 為左室室間隔收縮期厚度；IVSd 為左室室間隔舒張期厚度；LVFS 為左室短軸縮短率；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與氯吡格雷組比較，bP＜0.05

組別空白對(duì)照組氯吡格雷組冠心寧組鼠數(shù)15 15 15 IVSs（mm）4.18±0.45 3.45±0.37a 2.74±0.31ab IVSd（mm）1.76±0.71 1.62±0.67 1.58±0.57 LVFS（%）35.71±2.52 40.81±2.61a 45.82±2.71ab

4 討 論

急性心肌梗死后心肌組織處于嚴(yán)重的持續(xù)性心肌缺血、缺氧狀態(tài)，致使心臟收縮及舒張功能障礙并引發(fā)心力衰竭[9]。傳統(tǒng)干預(yù)方法雖能在一定程度上控制或減輕急性心肌梗死后心力衰竭患者的臨床癥狀，但其病死率仍居高不下。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展與應(yīng)用，基于傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的中藥制劑在心血管疾病防治方面也逐漸引起重視，其具有多靶點(diǎn)效應(yīng)，可通過(guò)多種途徑來(lái)發(fā)揮治療作用。

中醫(yī)認(rèn)為，心力衰竭屬于“心悸”“心痹”“水腫”等范疇，其病機(jī)與心失所養(yǎng)、邪痹心絡(luò)、氣血不暢等有關(guān)，通過(guò)活血祛瘀、養(yǎng)心通絡(luò)改善患者臨床癥狀[10]。冠心寧中含丹參、川芎，其中丹參具有活血祛瘀、清心等作用，川芎可止痛行氣、活血、祛風(fēng)，共奏活血化瘀，通脈養(yǎng)心之效。

通過(guò)對(duì)大鼠的心肌微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組、氯吡格雷組比較，冠心寧組大鼠的肌原纖維排列整齊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等心肌損傷明顯減輕。說(shuō)明冠心寧可有效改善大鼠心肌組織的病理?yè)p傷，丹參中的丹參酮ⅡA 磺酸鈉可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)自噬來(lái)保護(hù)缺血缺氧的心肌細(xì)胞并改善心功能，且丹參酮ⅡA 可誘導(dǎo)Beclinl 依賴(lài)自噬來(lái)抑制心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕心肌損傷及因缺血缺氧所致的心肌組織病理?yè)p傷程度[11]。研究表明，川芎可通過(guò)調(diào)節(jié)持續(xù)的血管生成來(lái)減輕心肌組織損傷程度[12]。因?yàn)樾律懿蛔闶切募」┭蛔愕奶攸c(diǎn)之一，川芎可通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮（NO）水平來(lái)促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體釋放，進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成并改善心肌細(xì)胞缺氧、缺血情況，抑制心肌細(xì)胞凋亡[13]。

研究證實(shí)，PI3K/AKT 信號(hào)通路在心肌細(xì)胞生長(zhǎng)、修復(fù)過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用[14]。本研究中與空白對(duì)照組、氯吡格雷組比較，冠心寧組心肌組織中PI3K、AKT 表達(dá)顯著升高，說(shuō)明冠心寧可促進(jìn)造模大鼠心肌組織中P13K、ATK 蛋白表達(dá)，這是因?yàn)榈⒅械牡⑼駻 可調(diào)控P13K/AKT 信號(hào)來(lái)參與心肌細(xì)胞能量代謝的調(diào)控[15]。此外，與空白對(duì)照組、氯吡格雷組比較，冠心寧組心肌組織中ROS 顯著降低，TAOC 水平顯著升高，說(shuō)明冠心寧可有效減輕急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。通過(guò)增強(qiáng)Beclinl 依賴(lài)自噬能力，調(diào)節(jié)NO 水平來(lái)減輕線(xiàn)粒體損傷程度進(jìn)而提高心肌組織的抗氧化能力，緩解心肌細(xì)胞的過(guò)氧化損傷達(dá)到減輕心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的目的[16]。相較空白對(duì)照組、氯吡格雷組，冠心寧組血清TNF-α 水平顯著降低、TGF-β1 水平顯著升高，說(shuō)明冠心寧可有效抑制造模大鼠炎癥反應(yīng)。冠心寧抑制多種致炎因子表達(dá)及細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)自噬作用又抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。

此外，通過(guò)超聲心動(dòng)圖發(fā)現(xiàn)冠心寧組IVSs 低于氯吡格雷組、空白對(duì)照組，LVFS 高于氯吡格雷組、空白對(duì)照組，說(shuō)明冠心寧可有效改善造模大鼠的心功能。它可通過(guò)調(diào)控PI3K/ATK 信號(hào)通路及誘導(dǎo)Beclinl依賴(lài)自噬來(lái)發(fā)揮抑制氧化應(yīng)激、抗炎等作用，對(duì)減輕心肌組織缺氧與缺血性損傷、抑制心肌細(xì)胞凋亡均有重要作用，這也是心功能改善的病理基礎(chǔ)。

綜上所述，冠心寧可改善急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)與心功能，降低氧化應(yīng)激水平及炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/AKT 信號(hào)通路、增強(qiáng)線(xiàn)粒體功能有關(guān)。