UPLC-Q Exactive Plus-MS分析高粱殼化學(xué)成分及黃嘌呤氧化酶體外抑制活性篩選

張瀚水 龔本義 南敏倫 赫玉芳 趙昱瑋 吳叢梅 殷玉和*

（1長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 長春 130012）

（2吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院植物化學(xué)研究所， 長春 130012）

（3長春中醫(yī)藥大學(xué)健康管理學(xué)院， 長春 130117）

高粱（Sorghum bicolor（L.） Moench）為禾本科高粱屬，是繼小麥、水稻、玉米和大麥之后的世界第五大谷物［1］，具有雜種優(yōu)勢明顯、抗逆性強(qiáng)、光合作用效率強(qiáng)和用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)［2］。高粱殼中不僅含有蛋白質(zhì)、單寧各種有機(jī)酸，還富含黃酮類物質(zhì)。黃酮類化合物具有抗氧化、降血糖、降壓、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和降尿酸等作用［3］。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域人們利用黃酮研發(fā)出抗心血管藥物、止咳平喘藥等，臨床上用來治療冠心病、心絞痛和高血壓等疾病。黃酮類化合物是高粱殼中主要化學(xué)成分，對其系統(tǒng)研究具有重要意義。高粱殼提取紅色素已有文獻(xiàn)報道，但大都是為了探討高粱紅色素最佳提取工藝條件［2］，未見對高粱殼化學(xué)成分分析及黃嘌呤氧化酶體外抑制活性篩選的報道。本實(shí)驗采用UPLC-Q Exactive Plus-MS 技術(shù)，對高粱殼中黃酮類化學(xué)成分快速鑒定分析。通過高效液相色譜法建立黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系，對6 種已確定的化合物進(jìn)行活性篩選，尋找高粱殼中抑制黃嘌呤氧化酶活性成分，為進(jìn)一步建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器和試劑

UltiMate 3000 型超高效液相色譜儀（UHPLC，美國Thermo 公司）；色譜柱為Hypersil GOLD C18柱（Standard density，美國Thermo公司）；UPLC-Q Exactive Plus-MS型質(zhì)譜儀（MS，美國Thermo公司）；SQP型萬分之一電子分析天平（Electronic analytical balance，德國Sartorius 公司）。高粱殼，取產(chǎn)自吉林省延邊朝鮮族自治州延吉市境內(nèi)高粱脫殼即得；黃嘌呤、別嘌呤醇、黃嘌呤氧化酶均購自上海源葉生物科技有限公司；刺槐素對照品（批號：B20627）、葛根素對照品（批號：B21804）、芹菜素對照品（批號：B20984）、根皮苷對照品（批號：B20449）、異鼠李素對照品（批號：B21557）、3，3'，4'，7-四羥基黃酮對照品（批號：B29127）均購自上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO，分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司）。

1.2 成分檢測條件

1.2.1 色譜條件

Hypersil GOLD C18色譜柱，流速1 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動相A為乙腈，B 為0.1%甲酸水溶液； 梯度洗脫： 0～20 min，8%～10%A，20～35 min，10%～20%A，35～55 min，20%～25%A，55～70 min，25%～35%A，70～80 min，35%～40%A，80～90 min，40%～50%A，90～100 min，50%～60%A，100～110 min，60%～70%A，110～120 min，70%～80%A，120～125 min，80%～8%A。

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子模式（ESI+）： 鞘氣流量為40 L/min； 輔助氣（N2）流量（Aux gas flow rate）為15 L/min；輔助氣溫度為350 ℃； 離子傳輸管溫度為250 ℃； 噴霧電壓為3.25 KV； MS1全掃描范圍為m/z100～1500，分辨率為70000； MS2掃描范圍為Full MS-ddms2（Top 10），分辨率為3500，動態(tài)排除時間為10 s。

1.3 樣品溶液制備

取高粱殼30 g，回流提取3次，每次加10倍量70%乙醇提取1 h，抽濾，合并濾液，濃縮，冷凍干燥，得到粗提取物； 精密稱取粗提取物25 mg，甲醇溶解，配制成2.5 mg/mL，過0.45 μm微孔濾膜至進(jìn)樣瓶中，得到樣品溶液。

1.4 黃嘌呤氧化酶（XO）活性檢測

1.4.1 酶溶液的配制

精密稱取XO 1.88 g，至10 mL 容量瓶中，加入PBS 稀釋，制得1.66 U/mL。分裝至EP 管中于-20 ℃冰箱備用。

1.4.2 底物溶液的配制

精密稱量黃嘌呤7.60 mg，置于50 mL 容量瓶中，加入0.5 mL 氨水，置于水浴鍋加熱溶解，用PBS 定容，得到1 mmol/L的黃嘌呤儲備液。

1.4.3 相關(guān)溶液配制

精密稱取別嘌呤醇17.01 mg，置25 mL 容量瓶中，用PBS 定容至刻度，得到5 mmol/L 別嘌呤醇儲備液，用時稀釋。精密稱取刺槐素18.52 mg、葛根素10.41 mg、芹菜素6.76 mg、根皮苷10.91 mg、異鼠李素7.91 mg和3，3'，4'，7-四羥基黃酮7.16 mg，分別置于5 mL容量瓶中，含0.1% DMSO的PBS溶液溶解，分別制成5 mmol/L溶液。

1.4.4 黃嘌呤氧化酶抑制率及IC50的測定

參考文獻(xiàn)［4］建立反應(yīng)體系，在體系中加入別嘌呤醇或者各對照品溶液（50、100、200、400、800 和1600 μmol/L）0.8 mL，再加入黃嘌呤與XO 溶液各1.6 mL，啟動反應(yīng)，在25 ℃反應(yīng)40 min，反應(yīng)完畢后置于95 ℃熱水中5 min終止反應(yīng)，定容至5 mL，膜過濾，各取10 μL進(jìn)行液相色譜檢測，計算抑制率及IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 成分分析和鑒定

通過質(zhì)譜正離子掃描模式，對高粱殼進(jìn)行成分檢測，并利用Xcalibur 4.1 軟件以及ChemSpider、MassBank 數(shù)據(jù)庫對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得總離子流圖如圖1 所示。共鑒定出27 種化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)該成分以黃酮為主，在正離子模式下有較好的響應(yīng)，具體保留時間、分子式和離子碎片等信息見表1。

表1 QE分析高粱殼化學(xué)成分Table 1 QE analysis of chemical composition of sorghum husk

圖1 高粱殼正離子UPLC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of positive ion UPLC-MS of sorghum husk

2.2 黃酮類

從高粱殼中發(fā)現(xiàn)9 個黃酮類化合物，分別是峰2、3、4、5、6、7、16、17 和26。該類化合物母核的主要質(zhì)譜裂解方式為C環(huán)的RDA 裂解（即C環(huán)的1，3裂解），生成1對互補(bǔ)離子。以峰17為例，正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z271.0606［M+H］+，分子式為C15H10O5，在正離子模式下二級質(zhì)譜中C 環(huán)開裂，裂解成m/z119.0497［C8H6O］+，還可以在能量的轟擊下脫去CO和CO2中性碎片，裂解成m/z243.0657［C14H11O4］+，m/z227.3813［C14H11O3］+，根據(jù)文獻(xiàn)［5-6］及對照品質(zhì)譜信息鑒定該化合物為芹菜素，裂解信息見圖2。同理，峰2 在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z255.0655［M+H］+，在正離子模式下發(fā)生RDA 裂解，形成主要特征碎片離子m/z119.0290，C 環(huán)丟失CO 生成碎片離子m/z227.0705，C 環(huán)丟失CO2形成碎片離子m/z211.0649，根據(jù)碎片離子信息推測該化合物為6，2'-二羥基黃酮。峰5 和峰6 互為同分異構(gòu)體，峰3和峰5、6在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z285.0765［M+H］+和m/z269.0812［M+H］+，丟失—CH3生成碎片離子m/z270.0524［M-CH3］+和m/z254.0578［M-CH3］+，再連續(xù)丟失CO，生成碎片離子m/z242.0576［M-CH3-CO］+和m/z226.0628［M-CH3-CO］+，根據(jù)碎片離子信息推測為刺槐素與5-羥基-3'-甲氧基黃酮［7］、3-羥基-3'-甲氧基黃酮。峰4在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z313.0714［M+H］+，分別丟失1分子H2O 和—OCH3生成碎片離子m/z295.0609［M-H2O］+和m/z280.0378［M-OCH3］+，根據(jù)碎片信息推測該化合物為6，2'，3'-三甲氧基黃酮。峰7 和峰16 在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z283.0970［M+H］+和m/z299.0922［M+H］+，分別丟失—CH4—CO 離子和—CH3離子，生成碎片離子m/z239.0707［M-CH4-CO］+、m/z255.0652［M-CH4-CO］+和m/z268.0734［M-CH3］+、m/z284.0687［M-CH3］+，據(jù)文獻(xiàn)［7］推測該化合物為5，2'-二甲氧基黃酮與7，3'-二甲氧基-3-羥基黃酮。峰26 在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z317.1030［M+H］+，C 環(huán)發(fā)生RDA 裂解，失去1分子—OCH3生成碎片離子m/z121.6167、m/z183.0295與m/z217.4342，根據(jù)文獻(xiàn)［8］推測該化合物為異鼠李素。

圖2 芹菜素質(zhì)譜圖及主要裂解途徑Fig.2 Mass spectrometry and main cleavage pathway of apigenin

2.3 黃烷醇類

從高粱殼中發(fā)現(xiàn)2種黃烷醇類，分別是峰10和14。以峰14為例，母離子峰［M+H］+為m/z291.0812，在能量碰撞下，由分子離子峰m/z291.0812 脫一分子水后再脫C2H2獲得m/z247.0812，連接B 環(huán)和C 環(huán)的鍵斷裂生成m/z181.0431和m/z111.0324，m/z181.0431脫水形成m/z163.0765，根據(jù)文獻(xiàn)［9］推測，該化合物為兒茶素沒食子酸酯。峰10同理，母離子峰［M+H］+為m/z307.0724，生成碎片離子m/z127.0357和m/z181.0682，推測該化合物為3，3'，4'，5，5'，7-六羥基-黃烷-3-沒食子酸酯。

2.4 異黃酮類

從高粱殼中發(fā)現(xiàn)了4種異黃酮類，分別是峰9、11、12和13。異黃酮類裂解方式與黃酮類基本相同，發(fā)生RDA裂解，得到1對互補(bǔ)離子，還能失去CO，還易失去H2O的反應(yīng)。以峰11為例，峰11屬于一種天然異黃酮碳苷，正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z417.1340［M+H］+，脫去1 分子糖，形成碎片離子m/z255.8625，根據(jù)文獻(xiàn)［10-11］推測該化合物為葛根素，裂解信息見圖3。峰9 在正離子模式準(zhǔn)分子離子峰m/z355.1186［M+H］+，C 環(huán)發(fā)生RDA 裂解，生成碎片離子m/z152.5128［C7H4O4］+，根據(jù)離子碎片信息，該化合物為7-羥基異黃酮。峰12 在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z281.0817［M+H］+，易失去—CH3，在連續(xù)失去CO 反應(yīng)，生成碎片離子m/z239.0707，根據(jù)碎片信息，該化合物為7-異丙氧基異黃酮。峰13與峰11分子式相同，裂解相似，根據(jù)碎片信息，該化合物為豆苷。

圖3 葛根素質(zhì)譜圖及主要裂解途徑Fig.3 Mass spectrometry and main cleavage pathway of puerarin

2.5 查爾酮類

從高粱殼中發(fā)現(xiàn)了2 種查爾酮類，分別是峰19 與22。查爾酮類裂解方式一般連接2 個苯環(huán)的單鍵進(jìn)行裂解，生成3對互補(bǔ)離子，查爾酮類裂解還有一個特點(diǎn)，是失去1個H 原子。如峰19，在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z437.1210［M+H］+，連接苯環(huán)的單鍵裂解，失去氫原子，生成碎片離子m/z166.4701［C9H9O3］+與m/z257.1169［C15H12O4］+，根據(jù)碎片離子信息，推測化合物為根皮苷。峰22，在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z339.0506［M+H］+，單鍵斷裂，失去氫原子，形成碎片離子m/z94.0770［C6H5O］+，根據(jù)碎片信息，推測該化合物為甘草查爾酮A。

2.6 黃酮醇類

從高粱殼中發(fā)現(xiàn)了2 種黃酮醇類，分別是峰21 與25。峰21 在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z287.0555［M+H］+，C 環(huán)可發(fā)生RDA 裂解，再失去1 個—OH，得到碎片離子m/z251.0127 和m/z149.0602，根據(jù)文獻(xiàn)［12］推測，該化合物為3，3'，4'，7-四羥基黃酮。峰25在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z315.0868［M+H］+，失去CO2中性碎片，生成碎片離子m/z271.0605，還易發(fā)生失H2O 反應(yīng)，產(chǎn)生碎片離子m/z300.0636，根據(jù)離子碎片信息，該化合物為3，7-二羥基-3'，4'-二甲氧基黃酮。

2.7 糖苷類

從高粱殼中發(fā)現(xiàn)了2 種糖苷類化合物，分別是峰20 和23。以峰23 為例，正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z433.1290［M+H］+，脫1分子糖獲得m/z271.0535，根據(jù)離子碎片信息，推測該化合物為芹菜素7-葡萄糖苷，裂解信息見圖4。峰20在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z509.1247，脫去1分子糖，生成碎片離子m/z347.0661，根據(jù)碎片離子信息，推測該化合物為丁香亭-3-O-葡糖苷。

圖4 芹菜素7-葡萄糖苷質(zhì)譜圖及主要裂解途徑Fig.4 Mass spectrometry and main cleavage pathway of apigenin-7-O-glucoside

2.8 其他化合物的鑒定

正離子模式下峰1保留時間36.90 min處有準(zhǔn)分子離子峰m/z198.1281［M+H］+，二級質(zhì)譜下所產(chǎn)生的m/z91.0549和m/z106.0657碎片離子信息； 峰8保留時間57.29 min處有準(zhǔn)分子離子峰m/z241.0976［M+H］+及m/z167.0610，185.0715，213.0663； 峰15保留時間66.29 min處有準(zhǔn)分子離子峰m/z215.0343［M+H］+及m/z95.0135； 峰18 保留時間72.80 min 處有準(zhǔn)分子離子峰m/z301.0712［M+H］+及m/z258.0529，286.0477； 峰24 保留時間80.85 min 處有準(zhǔn)分子離子峰m/z297.0764［M+H］+及153.0186； 峰27 保留時間97.97 min 處有準(zhǔn)分子離子峰m/z194.1180［M+H］+及m/z107.0497，135.0444，以上所得數(shù)據(jù)與ChemSpider及MASSBANK 數(shù)據(jù)庫匹對，推測出上述化合物分別為2-（3-苯丙基）吡啶［13］、1，5-二羥基蒽醌、2，4-二羥二苯甲酮、蒽醌、6-乙氧基-3（4'-羥基苯基）-4-甲基鉻-2-酮［14-15］和4-（二甲氨基）苯甲酸乙酯［16］。

2.9 高粱殼乙醇提取物6種化合物對XO抑制率的測定

現(xiàn)研究報道芹菜素、槲皮素等黃酮類化合物［17-18］對XO表現(xiàn)出較好的抑制活性，故初步分析已知的6種物質(zhì)抑制XO 活性水平，測定6 種成分對XO 的抑制率，實(shí)驗結(jié)果表明，各抑制率隨各樣品濃度升高均有提升，其中異鼠李素和刺槐素具有較弱的抑制活性，異鼠李素IC50大于100，刺槐素IC50為90.53 μmol/L；芹菜素和3，3'，4'，7-四羥基黃酮則表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，IC50分別為18.11、34.59 μmol/L，見表2。

表2 各樣品抑制率及IC50Table 2 Inhibition rate and IC50 of each sample

3 結(jié) 論

為探討高粱殼乙醇提取物中對XO 的抑制活性成分，本實(shí)驗采用UPLC-Q Exactive Plus-MS 分析技術(shù)，根據(jù)碎片信息、文獻(xiàn)及ChemSpider、MassBank 數(shù)據(jù)庫，實(shí)現(xiàn)了對高粱殼乙醇提取物中復(fù)雜成分的分析，共推測出27個化合物，主要以黃酮為主。根據(jù)分析出的27個化合物選取6種物質(zhì)進(jìn)行活性篩選，芹菜素和3，3'，4'，7-四羥基黃酮表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，異鼠李素和刺槐素具有較弱的抑制活性。本研究方法與結(jié)果對高粱殼乙醇提取物抗痛風(fēng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一定的理論依據(jù)，為深入開發(fā)高粱殼及其提取總黃酮實(shí)際應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。