基于氮化碳量子點/羅丹明B系統(tǒng)檢測汞離子的比率熒光探針

周葉紅 張旭藝 蘆冬濤 徐會文 劉 洋* 董 川*

（1山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所， 太原 030006）

（2太原重工軌道交通設(shè)備有限公司， 太原 030032）

汞離子（Hg2+）是一種易溶于水的劇毒型重金屬離子［1-2］，一旦Hg2+通過呼吸道或者皮膚進入人體內(nèi)，將會對人的大腦、視力和神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆轉(zhuǎn)的損害［3-7］。生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB5749-2022 規(guī)定飲用水中的Hg2+濃度應(yīng)不高于5 nmol/L。目前，用于Hg2+檢測的方法主要有原子吸收/發(fā)射光譜法［8］、X射線吸收光譜法［9］、電感耦合等離子體質(zhì)譜法［10］、離子色譜法［11］以及冷蒸汽原子吸收光譜法［12］等，這些方法的實際應(yīng)用極大程度上受到其儀器價格和設(shè)備操作難度的限制［13］。因此，需要開發(fā)操作簡便、成本低廉、易制備和檢出限低的Hg2+檢測方法。

近年來，集良好的生物兼容性、光吸收性、穩(wěn)定性與低毒害、低成本以及易于制備與表面修飾等優(yōu)點于一身的石墨相氮化碳量子點（CNQDs）在傳感分析領(lǐng)域備受青睞［14-16］。目前，已報道有檢出限低、靈敏度高、制備簡單、操作方便和抗干擾能力強的氮化碳量子點熒光探針被合成?；贑NQDs 的熒光探針已被廣泛應(yīng)用于金屬離子和生物分子的檢測［16-18］。羅丹明B（RhB）是一種可以在紫外照射下，發(fā)出耀眼紅色的熒光染料［19］。由于RhB 對Hg2＋無響應(yīng)，可以作為比率熒光探針的內(nèi)參比信號［20］，提高檢測的靈敏度，并消除背景干擾［21］。將RhB 引入氮化碳量子點，來提高氮化碳量子點對Hg2＋檢測的選擇性［22-23］。因此，本課題選擇開發(fā)一種靈敏、高效的CNQDs/RhB的比例熒光探針用于Hg2+的痕量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Nicolet iS5 型傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，美國 Thermo 公司）；UH-5300 型紫外可見分光光度計（UV-Vis，日本日立公司）；F-7100 型熒光分光光度計（日本日立公司）；JEM-2100F 型透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社）；D8 ADVANCE A25 型X 射線粉末衍射儀（XRD，北京愛科思瑞技術(shù)有限公司）；AXIS ULTRADLD 型X 射線光電子能譜儀（XPS， 英國Kratos公司）；ST3100型pH 計（常州Auhaus儀器有限公司）；FD8-3a 型冷凍干燥箱（美國SIM 公司）；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；SC-05 型低速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Molcell1820c 型超純水機（上海康路儀器設(shè)備有限公司）；1000D型透析袋（美國仕必純有限公司）。

二水合檸檬酸鈉、尿素、羅丹明B、無水乙醇和硝酸汞均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉購自天津市北辰方正試劑廠；磷酸和磷酸鈉購自南京化學(xué)試劑有限公司；0.22 μm微孔濾膜購自默克有限公司。在本實驗中使用的所有化學(xué)品均為分析純，沒有進一步的純化。汞離子樣品通過將硝酸汞溶于水配制而成，其余金屬離子現(xiàn)配現(xiàn)用。實驗用水均為超純水（電阻率為18.25 MΩ·cm）。自來水、湖水水樣分別取自山西大學(xué)東山校區(qū)瞻明樓實驗室、迎澤公園湖。

1.2 CNQDs的制備

稱取0.81 g 二水合檸檬酸鈉與1.01 g 尿素固體于研缽中研磨至粉末狀態(tài)，使二者充分混勻后放入反應(yīng)釜中，在180 ℃下反應(yīng)1 h，待反應(yīng)釜冷卻至室溫，將反應(yīng)物用無水乙醇洗滌3 次。取沉淀加入純化水直到沉淀物完全溶于水中成為淡黃色溶液。用0.22 μm 微孔濾膜過濾淡黃色溶液后用透析袋（截留相對分子質(zhì)量為1000）透析24 h得到純凈的CNQDs溶液，放置于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?，冷凍干燥后得到CNQDs粉末。

1.3 CNQDs的表征

用TEM 觀察CNQDs 的形態(tài)外貌。XRD 分析CNQDs 的衍射圖譜得到晶型信息。通過XPS 分析CNQDs 的各個元素化學(xué)狀態(tài)和表面元素。FT-IR 測定氮化碳量子點的化學(xué)鍵合性質(zhì)、表面官能團。紫外可見分光光度計和熒光分光光度計分析CNQDs 的光學(xué)性質(zhì)，測定設(shè)置的參數(shù)為： 紫外可見分光光度計的掃描范圍是200～800 nm，熒光發(fā)射光譜掃描范圍是390～720 nm。

1.4 CNQDs/RhB對Hg2+的熒光檢測

以CNQDs為母體與羅丹明B（RhB）構(gòu)成比率熒光探針CNQDs/RhB，在熒光比色皿中加入10.0 μL Hg2+溶液（1.0×10-3mol/L）、5.0 μL CNQDs量子點溶液（20 μg/mL）和20 μL RhB溶液（0.20 μmol/L），用PBS緩沖液（pH=6.0）將其定容至2.0 mL。待混合溶液充分反應(yīng)后，在室溫下掃描其熒光光譜，熒光分光光度計的參數(shù)設(shè)置如下：最佳激發(fā)波長為370 nm、發(fā)射波長447和581 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫均為10 nm?；贑NQDs/RhB（447 nm/581 nm）的熒光強度比值F0=（F447/F581）的變化情況對汞離子（Hg2+）進行定量測定。

1.5 實際樣品檢測

收集到的水樣處理方法如下： 過濾不同的水樣，收集濾液，煮沸 30 min，冷卻至室溫后用0.22 μm微孔濾膜過濾，4 ℃條件下儲存?zhèn)溆?。使用CNQDs/RhB 比率熒光探針在實際樣品中對Hg2+熒光檢測的過程如下： 在比率熒光探針中加入自來水和湖水樣品。再將5.00、10.00和35.00 μmol/L 濃度的Hg2+溶液加入到上述實際樣品中，檢測其熒光強度。

2 結(jié)果與討論

2.1 CNQDs的表征及其光學(xué)性質(zhì)

CNQDs 的TEM 如圖1A 所示，CNQDs 分散均勻，HRTEM 可清楚觀察到其晶格為0.33 nm。圖1B 和1C 分別為CNQDs 的XRD 譜圖和XPS 譜圖。CNQDs 的XRD 顯示CNQDs 的晶型結(jié)構(gòu)，在2θ值為29（°）時它顯示CNQDs的最強的尖銳衍射峰［24］。CNQDs的FT-IR 如圖1D 所示，探討CNQDs的化學(xué)鍵合性質(zhì)、表面官能團： 3500～3200 cm-1處的特征吸收峰對應(yīng)O—H 和N—H 的拉伸振動，1623 cm-1是N—H 的拉伸振動，1399 cm-1峰是C—N彎曲振動。1260和1075 cm-1是C—O的拉伸振動峰。在C—H的表面彎曲振動，峰值出現(xiàn)在1000～500 cm-1附近［14］； 圖1E 為CNQDs 的紫外-可見吸收光譜圖和熒光激發(fā)、發(fā)射光譜圖：在波長為332 nm 處出現(xiàn)吸收峰，熒光激發(fā)（Ex）波長在373 nm 處，發(fā)射（Em）波長為447 nm 時，CNQDs的熒光強度最大；圖1F為CNQDs在不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜圖。

圖1 （A） CNQDs 的TEM 圖， 內(nèi)插圖為CNQDs 的HRTEM； （B） CNQDs 的XRD 表征； （C） CNQDs 的XPS 表征；（D） CNQDs的FT-IR 光譜圖； （E） CNQDs的紫外-可見吸收光譜、熒光激發(fā)和發(fā)射圖； （F） CNQDs的激發(fā)波長依賴性熒光光譜圖Fig. 1 （A） TEM image of CNQDs， inset is the HRTEM； （B） XRD spectrum of CNQDs； （C） XPS spectrum of CNQDs；（D） FT-IR spectrum of CNQDs；（E） The absorption， excitation and emission spectra of CNQDs；（F） The excitation dependent fluorescence spectra of CNQDs

2.2 CNQDs/RhB檢測Hg2+的條件優(yōu)化

水溶性CNQDs 以373 nm 激發(fā)，在447 nm 處有強烈的熒光發(fā)射，Hg2+的存在導(dǎo)致熒光猝滅。RhB 作為內(nèi)標(biāo)熒光參比，在580 nm 處有較強的熒光發(fā)射。如圖2A 所示，CNQDs 與RhB 二者耦合，CNQDs/RhB探針在373 nm 激發(fā)下， 分別在447 和581 nm 處出現(xiàn)雙重?zé)晒夥?。為了得到最佳的熒光發(fā)射光譜，對實驗條件進行以下優(yōu)化。

圖2 （A） CNQDs/RhB的熒光光譜圖； （B） pH值對CNQDs/RhB體系檢測Hg2+熒光強度的影響Fig.2 （A） The fluorescence spectra of CNQDs/RhB； （B） The effect of pH on the fluorescence intensity of Hg2+ sensed by CNQDs/RhB systems

2.2.1 溶液pH值對Hg2+檢測的影響

溶液pH 值對探針的檢測靈敏度有影響，同時過高的pH 值會使Hg2+發(fā)生水解反應(yīng)生成HgO 沉淀，影響檢測靈敏度，因此需要對檢測體系的pH 值進行討論。向pH 值為2.0～11.0 的PBS 緩沖溶液中依次加入CNQDs 溶液與Hg2+溶液，掃描記錄Hg2+加入前后溶液熒光強度的變化情況，探究CNQDs/RhB-Hg2+體系的最適pH 值。在圖2B 中，F(xiàn)0=（F447/F581）表示未加入Hg2+之前，F(xiàn)=（F447/F581）表示熒光被淬滅之后，F(xiàn)0/F值是熒光探針F0和F的FL 強度比［25］；在pH 值2.0～5.0 的范圍中，F(xiàn)0/F值大約為0.9，表示在加入Hg2+前后，熒光強度幾乎沒變，說明在此pH 值范圍不影響Hg2+熒光猝滅CNQDs 的強度。但當(dāng)pH 值約為6.0 和9.0 時，F(xiàn)0/F值達到最大，表示加入Hg2+后，會使熒光強度下降最大，說明在此pH 值范圍中Hg2+熒光猝滅CNQDs 的效果最好，且pH=6.0 時，Hg2+熒光猝滅CNQDs 的效果最佳。

2.2.2 反應(yīng)時間對Hg2+檢測的影響

通過對CNQDs 和Hg2+反應(yīng)達到平衡時間的研究，繪制熒光強度隨時間變化的函數(shù)，研究了CNQDs 與Hg2+之間的反應(yīng)動力學(xué)行為［26］，實驗結(jié)果如圖3 所示，加入Hg2+后CNQDs 迅速發(fā)生熒光猝滅，反應(yīng)5 min 后，體系的熒光強度趨于穩(wěn)定。所以，在之后Hg2+檢測選擇5 min作為反應(yīng)平衡時間。

圖3 反應(yīng)時間對CNQDs/RhB 體系檢測Hg2+熒光強度的影響Fig.3 The effect of reaction time on the fluorescence intensity of Hg2+ detected by CNQDs/RhB systems

2.2.3 反應(yīng)濃度對Hg2+檢測的影響

在pH=6.0的PBS緩沖液、反應(yīng)時間5 min的條件下，探究了不同濃度的CNQDs 對CNQDs/RhB+Hg2+體系相對熒光強度的影響，如圖4所示，隨著CNQDs的濃度增大，F(xiàn)0-F的差值也隨之增大，說明熒光猝滅效果逐漸顯著；當(dāng)質(zhì)量濃度到達0.166 mg/mL 時，F(xiàn)0-F差值最大，表明Hg2+可高效的猝滅CNQDs 的熒光。所以，CNQDs 質(zhì)量濃度控制在0.166 mg/mL 時比率探針對Hg2+的響應(yīng)最靈敏。當(dāng)質(zhì)量濃度超過0.166 mg/mL 時，F(xiàn)0-F的差值也在下降，探針對Hg2+的響應(yīng)靈敏度隨之下降。所以，選擇CNQDs 的質(zhì)量濃度為0.166 mg/mL 進行之后的實驗； RhB 作為參比材料，在CNQDs/RhB 體系中對Hg2+檢測的選擇性以及靈敏度存在不確定性，所以研究了不同濃度的RhB（0.30～0.90 μmol/L）對CNQDs/RhB+Hg2+體系相對熒光強度的影響。如圖5 所示，隨著RhB 濃度的逐漸增大，F(xiàn)0-F的差值也隨之增大，說明熒光猝滅效果顯著；當(dāng)濃度至0.60 μmol/L 時，F(xiàn)0-F差值最大，表明CNQDs/RhB 體系中Hg2+可高效的猝滅CNQDs 的熒光。所以，RhB 濃度控制在0.60 μmol/L 時比率探針對Hg2+的響應(yīng)最靈敏。當(dāng)濃度超過0.60 μmol/L 時，F(xiàn)0-F的差值也在下降，探針對Hg2+的響應(yīng)靈敏度隨之下降。因此，選擇RhB的濃度為0.60 μmol/L進行后續(xù)實驗。

圖4 CNQDs質(zhì)量濃度對檢測Hg2+熒光強度的影響Fig.4 The effect of CNQDs mass concentration on the fluorescence intensity of Hg2+ detection

圖5 RhB濃度對檢測Hg2+熒光強度的影響Fig.5 The effect of RhB concentration on the fluorescence intensity

2.3 CNQDs/RhB對Hg2+的檢測

測定不同濃度Hg2+（0～50 μmol/L）對CNQDs/RhB 體系猝滅后的熒光強度如圖6 所示，隨著c（Hg2+）在0～50 μmol/L 范圍內(nèi)逐漸增加，CNQDs 的熒光強度逐漸下降，且RhB 的熒光發(fā)射強度（581 nm）保持不變，呈良好的線性關(guān)系，如圖7 所示。此結(jié)果表明，Hg2+能猝滅氮化碳量子點（CNQDs）在447 nm處的熒光發(fā)射，以熒光染色劑羅丹明B（RhB）作為內(nèi)參比信號，可以構(gòu)建比率熒光探針［22］。構(gòu)建比率型熒光探針的主要目的是以RhB 為內(nèi)參比，避免其它實驗條件帶來的可能的干擾。熒光強度（F0/F）隨濃度變化的線性回歸方程為F0/F=0.03087c（Hg2+）+0.95661（R2=0.9946）。根據(jù)公式LOD=3s/k［27］，其中，s為標(biāo)準(zhǔn)差，k為此線性回歸方程的斜率，該探針對Hg2＋的檢測線性范圍為2～40 μmol/L，檢出限為1.95 μmol/L。

圖6 不同濃度Hg2+對CNQDs/RhB體系熒光強度的影響Fig.6 The concentration effect of Hg2+ on the fluorescent intensity

圖7 CNQDs/RhB體系的熒光強度與Hg2+濃度的線性曲線Fig.7 The plot of fluorescent intensity ration against the concentration

2.4 CNQDs/RhB檢測Hg2+的選擇性和干擾性

選擇性和干擾性是熒光探針檢測離子的必要考察方面。對CNQDs/RhB 體系檢測存在潛在干擾的各種離子［15］，包括Ca2+、Al3+、Ba2+、Fe3+、Zn2+、Na+和Cu2+等。考察了常見金屬離子和陰離子對CNQDs/RhB體系熒光強度的響應(yīng)，如圖8 和9 所示，除Hg2+得CNQDs 的熒光強度下降甚至猝滅外，其它常見金屬離子和陰離子均幾乎不影響CNQDs 的熒光強度。通過考察常見金屬離子和陰離子與Hg2+共存時對CNQDs/RhB 體系的熒光強度的影響，如圖10 和11（離子的濃度均為1.0×10-3μmol/L）所示，可以發(fā)現(xiàn)隨著各種常見陰、陽離子的引入干擾Hg2+對CNQDs熒光的猝滅，CNQDs的熒光猝滅強度幾乎沒有變化，說明干擾離子并沒有干擾到Hg2+對CNQDs 的熒光猝滅。綜上所述，此比率探針對Hg2+的檢測具有很高的選擇性和抗其它離子干擾的能力。

圖8 常見金屬離子對CNQDs/RhB體系的選擇性Fig.8 The selectivity of CNQDs/RhB towards different metal ions

圖9 陰離子對CNQDs/RhB體系選擇性Fig.9 The selectivity of CNQDs/RhB towards different anions

圖10 常見金屬離子與Hg2+共存時對體系檢測Hg2+的干擾性Fig. 10 The interference of different metal ions for the detection of Hg2+

圖11 陰離子與Hg2+共存時對體系檢測Hg2+的干擾性Fig.11 The interference of different anions for the detection of Hg2+

2.5 CNQDs/RhB與Hg2+相互作用機理

熒光猝滅機制主要分為動態(tài)猝滅（碰撞猝滅）［28］、靜態(tài)猝滅（形成基態(tài)締合物）［29］和激發(fā)態(tài)的能量/電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。Hg2+在400～550 nm 區(qū)間有較強的可見吸收，碳量子點的發(fā)射光譜與Hg2+的吸收光譜有重疊，所以碳量子點的猝滅機制可能包含動態(tài)、靜態(tài)猝滅以及激發(fā)態(tài)的能量轉(zhuǎn)移。碳量子點猝滅的Stern-Volmer 方程如圖12 所示，在不同溫度（20、30 和45 ℃）條件下，CNQDs/RhB 體系相對熒光強度（F0/F）隨著線性范圍內(nèi)（2～40 μmol/L）Hg2+濃度增加呈現(xiàn)線性關(guān)系，這說明熒光猝滅屬于單一機理。進一步區(qū)分動態(tài)或者靜態(tài)猝滅，最簡單的方法是測量碳量子點的熒光壽命，如圖13 所示，對不同濃度（0、10、15、20和25 μmol/L）Hg2+作用下的熒光探針位于447 nm 處的熒光壽命進行了測量，隨著Hg2+濃度的不斷增大，熒光壽命基本不變，說明猝滅機理屬于靜態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅是因為碳量子點和Hg2+形成了基態(tài)締合物，而沒有發(fā)生反應(yīng)的部分碳量子點，其熒光壽命基本不變； 如果是動態(tài)猝滅，隨著Hg2+的加入，碳量子點的熒光壽命會縮短，實驗數(shù)據(jù)說明不存在動態(tài)猝滅。對于靜態(tài)猝滅，隨著溫度的升高，Hg2+與碳量子點締合物的穩(wěn)定性降低，不利于猝滅，所以熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)會隨溫度升高而減小，如圖12 所示，隨著溫度升高，Stern-Volmer曲線的斜率降低，綜上，Hg2+對量子點熒光猝滅是靜態(tài)猝滅。

圖12 不同溫度下，CNQDs/RhB 體系+Hg2+的相對熒光強度變化圖Fig. 12 The emission spectra of CNQDs/RhB sensing system at different temperature

圖13 CNQDs/RhB 體系檢測Hg2+熒光壽命的變化圖Fig. 13 The lifetime of sensing system at different temperature

2.6 CNQDs/RhB在實際樣品中對Hg2+的檢測

Hg2+易溶于水，常常會危害人類的健康，所以需要對真實存在的樣品進行檢測［28］。通過加標(biāo)回收法驗證CNQDs/RhB 比率熒光探針對自來水和湖水中Hg2+的檢測能力，檢測結(jié)果如表1 所示。數(shù)值證實了CNQDs/RhB比率熒光探針在實際水樣中對Hg2+的檢測具有準(zhǔn)確性和高選擇性［20］。

表1 CNQDs/RhB比率熒光探針對水樣中Hg2+的檢測能力Table 1 The detection ability of CNQDs/RhB ratio fluorescent probes for Hg2+ in water samples

3 結(jié) 論

通過簡單的方法，成功地合成了氮化碳量子點（CNQDs），得到的CNQDs 發(fā)出藍色熒光并具有良好的熒光性能。所構(gòu)建的CNQDs/RhB 比率熒光探針具有良好的線性關(guān)系，檢測范圍為2～40 μmol/L，檢測限較低為1.95 μmol/L。相比較于其它金屬離子和陰離子，此CNQDs/RhB體系對Hg2+具有高選擇性。同時，也探究了Hg2+猝滅CNQDs/RhB 體系熒光的機理主要是靜態(tài)猝滅，將該熒光探針應(yīng)用于實際水樣中Hg2+的微量檢測，回收率為98.8%～110.2%。與已報道的Hg2+檢測方法相比較，本課題所制備的Hg2+比率型熒光探針檢出限更低、靈敏度更高，且制備簡便、成本低廉和操作簡單等優(yōu)點，使得該方法在Hg2+的實際檢測中更具應(yīng)用價值。