傷科黃水/聚乙烯醇靜電紡絲納米纖維創(chuàng)面敷料的制備及其性能

雷凱君 強(qiáng)潤(rùn)潤(rùn) 李懷國(guó) 鄭芳昊 焦自學(xué) 王宗良王 宇 何明豐* 章培標(biāo)*

（1佛山市中醫(yī)院， 佛山 528000）

（2中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所， 生態(tài)環(huán)境高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)春 130022）

傷口愈合是創(chuàng)傷修復(fù)的關(guān)鍵因素，創(chuàng)傷創(chuàng)面的修復(fù)又是創(chuàng)傷骨科的重要問題之一。 傷科黃水（Shangkehuangshui， HS）是基于傳統(tǒng)中藥理論的驗(yàn)方，作為佛山市中醫(yī)院自制的一種純中藥院內(nèi)制劑，臨床上可用于治療各種開放性軟組織損傷，在改善骨折圍手術(shù)期的病情方面效果顯著［1］。 但是，傷科黃水為洗劑，目前臨床對(duì)于傷科黃水的應(yīng)用僅限于紗布濕敷、灌洗和散劑外敷等，對(duì)于骨傷導(dǎo)致的皮膚組織創(chuàng)傷，為了保護(hù)創(chuàng)面，減少感染，加速傷口愈合，一般采用無菌紗布或浸有中藥黃水的紗布處理傷口，這種治療手段藥效短，需要反復(fù)用藥。 同時(shí)，紗布易與傷口粘連，形成結(jié)痂，換藥時(shí)常常破壞新生肉芽組織，病人疼痛難忍，然而，浸有中藥黃水的紗布無法在吸收創(chuàng)口分泌物的同時(shí)防止水分和電解質(zhì)的流失，限制了傷科黃水的應(yīng)用和效果。

高壓靜電紡絲技術(shù)可制備納米纖維，所得納米纖維具有高比表面積、小孔徑、高孔隙率和易制備等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程、過濾材料、催化反應(yīng)和傳感器等領(lǐng)域［2-4］。

水溶性高分子材料聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol， PVA）是一種具有生物可降解和生物親和性的生物醫(yī)用材料，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、生物相容性、低毒性和成膜性，其水溶液能在物理、化學(xué)或輻照的條件下交聯(lián)形成水凝膠，由PVA 制備的水凝膠無溶血作用，對(duì)肝、腎無明顯影響，已被廣泛用作組織填充材料、藥物包膜和藥物載體［5-6］。 水凝膠可作為創(chuàng)口敷料使用，具有以下優(yōu)點(diǎn)： ①主要成分是水，熱容量大，使人感覺涼爽； ②吸收傷口分泌物而不易粘連； ③透光性好，便于觀察傷口愈合情況；④對(duì)水和氧有良好通透性，同時(shí)能阻隔細(xì)菌，防止感染； ⑤具有空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可將藥物包埋其中，緩慢持續(xù)釋放到病變區(qū)，達(dá)到治愈傷口和其它皮膚疾病的目的［7-9］； ⑥良好的生物相容性，不會(huì)造成排異反應(yīng)或?qū)е聜诟腥尽?/p>

針對(duì)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)于傷科黃水應(yīng)用方式的局限及應(yīng)用過程中所存在的問題，通過靜電紡絲，制備了一種擔(dān)載傷科黃水、可用于開放性骨傷創(chuàng)口修復(fù)的醫(yī)用級(jí)聚乙烯醇靜電紡絲納米纖維創(chuàng)面敷料。本文旨在拓寬院內(nèi)制劑中藥“傷科黃水”的應(yīng)用形式，對(duì)傷科黃水/PVA靜電紡絲納米纖維創(chuàng)面敷料的制備方法進(jìn)行了闡述，探究了不同PVA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下傷科黃水/PVA 靜電紡絲納米纖維膜的可紡性，選出適宜應(yīng)用于傷科黃水/PVA 靜電紡絲納米纖維醫(yī)用敷料的紡絲液，在此基礎(chǔ)上討論了不同含藥量的傷科黃水/PVA 靜電紡絲納米纖維膜的生物相容性、吸水性、藥物釋放和對(duì)大鼠皮膚全層缺損的修復(fù)效果等性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

ESEM XL-30 型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，荷蘭飛利浦公司）；S6000 型高效液相色譜儀（HPLC，華譜科儀（北京）科技有限公司）；Thermo MK3 型酶標(biāo)儀（熱電上海儀器有限公司）；WDW-5 型微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)（長(zhǎng)春新特試驗(yàn)機(jī)有限公司）；V-750型紫外分光光度計(jì)（UV，日本JASCO 公司）；靜電紡絲制備裝置（自制）；PLUSS Zeiss 型正置顯微鏡（奧地利TissueGnostics 公司）；E100 型顯微鏡（尼康儀器有限公司）；QYC-2102 C 型恒溫立式搖床（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；ZGD-50B-7 型紫外臭氧箱（順德索奇實(shí)業(yè)有限公司）。

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%（傷科黃水原液）的傷科黃水溶液，加入聚乙烯醇粉末，配制成PVA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8%、10%和12%的PVA/2%傷科黃水紡絲液，備用，分別命名為PVA/HS 8%-2%、PVA/HS 10%-2%和PVA/HS 12%-2%，以探究不同PVA含量的PVA/2%傷科黃水紡絲液的可紡性。

針對(duì)某零售企業(yè)配送中心存在的流程問題、信息系統(tǒng)問題和車輛調(diào)度問題，對(duì)其配送中心的配送流程，包括配送作業(yè)流程，倉儲(chǔ)作業(yè)信息化，配送車輛配裝和運(yùn)輸線路等方面進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 傷科黃水/聚乙烯醇PVA復(fù)合纖維敷料的制備

國(guó)企并購私企屬于某種意義上的重組，有助于企業(yè)在會(huì)計(jì)核算和財(cái)務(wù)管理過程中的工作有效、規(guī)范開展，有助于加快工作效率。國(guó)企并購私企卻不可避免的導(dǎo)致企業(yè)的內(nèi)部的管理制度出現(xiàn)了較多問題，使得企業(yè)在管理和決策過程中出現(xiàn)失誤，給企業(yè)造成較大的損失。

1.2.1.1 紡絲液的配制

用去離子水、PVA 粉末配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、8%、10%、12%和14%的PVA 紡絲液，室溫靜置冷卻除泡，備用，以探究不同濃度PVA紡絲液的可紡性。

聚乙烯醇（藥輔級(jí)1799 型）購自江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司；傷科黃水由佛山市中醫(yī)院提供；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4，自制）；去離子水（自制）；NIH-3T3成纖維細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)上海細(xì)胞庫。

實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)SD大鼠35只（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格號(hào)： wish-2021040），體重（250±20） g，腹腔注射速眠新麻醉（0.4 mL/kg）。 每只大鼠背部皮膚去毛后雙側(cè)制作直徑為15 mm 的全層皮膚缺損創(chuàng)面，以背脊為中心左右各一組，一組兩個(gè)創(chuàng)面。 術(shù)后觀察大鼠皮膚修復(fù)情況，于第3、7和14 d處死大鼠，取皮膚組織樣品，用多聚甲醛溶液固定，作組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)觀察。 本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：［2022］年動(dòng)審［0089］號(hào)）。

1.2.1.2 靜電紡絲

不同載藥量的傷科黃水/PVA 靜電紡絲納米纖維膜（PVA/HS-2%、PVA/HS-1%和PVA/HS-0.5%）的藥物累計(jì)釋放曲線如圖5所示。 從圖5A可以看出，釋放初期各樣品組藥物釋放曲線的斜率隨著載藥量的增加而增大。這說明隨著纖維中藥物濃度的增加，藥物從纖維中擴(kuò)散出來的速率也增加。 藥物持續(xù)釋放0.5 h 后，釋放曲線斜率逐漸變小，釋放速率逐漸減慢。 可能是隨著藥物的釋放，纖維內(nèi)部的藥物含量逐漸減少，包裹在纖維內(nèi)部的藥物向外擴(kuò)散的路徑變長(zhǎng)，所以釋放速率逐漸減慢。 在藥物釋放初期，靠近纖維表面的藥物首先擴(kuò)散出來，引起藥物的突然釋放，從釋放曲線圖5B 可以看出，由這種擴(kuò)散作用引起的最初的藥物釋放量也隨著載藥量的增加而增加。 從整個(gè)釋放曲線可以看出： 該傷科黃水/PVA靜電紡絲納米纖維膜不僅在初期有較高的藥物釋放速度，還能在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)平穩(wěn)釋放藥物。 對(duì)于創(chuàng)面修復(fù)藥物的控制釋放來說，這種釋放行為是很理想的。 開始的突釋適合快速抑制炎癥反應(yīng)，后期很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)的持續(xù)釋放能進(jìn)一步促進(jìn)組織修復(fù)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。 因此，這種劑型特別適合用于急、慢性創(chuàng)面的修復(fù)［11］。

圖1 靜電紡絲裝置結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of electrostatic spinning device

1.2.2 吸液能力測(cè)定

將已知干重的靜電紡絲纖維膜根據(jù)含藥濃度進(jìn)行分組，每組6 個(gè)平行樣切割成相同的大小，放入PBS溶液（模擬傷口滲出液）中，37 ℃恒溫放置不同時(shí)間間隔后將材料取出，用濾紙除去溶脹薄膜表面的多余液體，稱重，直至恒重。測(cè)定樣品吸液能力（S）的計(jì)算公式為（1）：

式中，m0為樣品干燥后的初始質(zhì)量（g），mt為樣品在溶液中浸泡不同時(shí)間后的質(zhì)量（g）。

其二，通過具體的事例，引導(dǎo)社會(huì)各群體理性地看待他人的文化習(xí)俗、道德理念、價(jià)值觀念以及行為方式，在底線倫理的范圍內(nèi)，排除以群體的優(yōu)勢(shì)對(duì)其他非主流的文化習(xí)俗、道德理念、價(jià)值觀念以及行為方式橫加干涉的作法，并以“不同的生活方式崇尚不同的善和德性這一事實(shí)”作為各參與主體政治經(jīng)濟(jì)生活中的基本價(jià)值指導(dǎo)和道德支持，為社會(huì)多元一致的實(shí)現(xiàn)獲得共識(shí)上的保障。

1.2.3 體外釋放實(shí)驗(yàn)

在具體的復(fù)習(xí)教學(xué)過程中，教師可以引導(dǎo)學(xué)生重新觀看教學(xué)視頻，通過視頻找到習(xí)題應(yīng)用的知識(shí)點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行反復(fù)觀察以及記錄，以提升學(xué)生的學(xué)習(xí)質(zhì)量以及自主學(xué)習(xí)能力。在此過程中，學(xué)生還可以根據(jù)自身的學(xué)習(xí)能力對(duì)視頻的速度以及內(nèi)容進(jìn)行調(diào)整，提升復(fù)習(xí)工作的人性化，進(jìn)而提升自身的習(xí)題學(xué)習(xí)效率。

以上，我們分析了將多媒體應(yīng)用到計(jì)算教學(xué)中的策略，并對(duì)多媒體環(huán)境下的計(jì)算教學(xué)進(jìn)行了反思。如今的教學(xué)離不開多媒體，但是如何更有效地利用多媒體來輔助教學(xué)，值得我們進(jìn)一步探索。希望本文的研究能夠?yàn)閿?shù)學(xué)教師的教學(xué)提供一些參考，從而更充分地利用多媒體提高學(xué)生的計(jì)算能力，為學(xué)生今后的數(shù)學(xué)學(xué)習(xí)打牢基礎(chǔ)。

傷科黃水由黃連、黃柏、梔子、紫草、白礬和薄荷6味中藥組成，這6味藥材的主要成分是6種重要的生物堿（黃柏堿、藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿）和梔子苷，根據(jù)《中國(guó)藥典》對(duì)傷科黃水中6味藥材主要成分的含量要求，選擇含量高且在藥效上起到主要作用的小檗堿、梔子苷等，通過HPLC檢測(cè)來評(píng)估紡絲膜樣品的藥物釋放情況［10］。

建立河道管理執(zhí)法基地，加強(qiáng)河道管理裝備建設(shè)和河道管理隊(duì)伍能力建設(shè)。為加強(qiáng)河道管理裝備建設(shè)，市水利局積極協(xié)調(diào)市財(cái)政局，將市級(jí)和區(qū)縣級(jí)水行政主管部門歸集的河道砂石資源費(fèi)完全用于河道管理能力建設(shè)，購買河道巡查車輛，配置采砂在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)、攝像照相等設(shè)備。各級(jí)河道管理站作為河道管理監(jiān)督主管單位，要秉承服務(wù)至上的理念，努力為管理對(duì)象提供優(yōu)質(zhì)服務(wù)。一是提升協(xié)調(diào)能力，加強(qiáng)與相關(guān)單位的橫向聯(lián)系，建立定期溝通制度，主動(dòng)為服務(wù)對(duì)象排憂解難。二是加強(qiáng)培訓(xùn)和考察，拓寬河道管理人員的知識(shí)面，提高應(yīng)對(duì)復(fù)雜問題的處置能力，培養(yǎng)一批綜合型人才，促進(jìn)河道管理人員的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

傷科黃水的體外釋放實(shí)驗(yàn)在37 ℃的PBS 溶液中進(jìn)行。稱取不同傷科黃水濃度的PVA/傷科黃水靜電紡絲纖維樣品各20 mg，裁剪成 2 cm×1.5 cm大小，浸泡于裝有4 mL PBS溶液的Eppendorf管中封好（每個(gè)樣品4 個(gè)平行樣），置于恒溫?fù)u床中，在37 ℃下，以90 r/min 振蕩，取0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128 h，共10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的材料釋放液，用HPLC法測(cè)藥物的釋放，評(píng)估傷科黃水/PVA 靜電紡絲纖維膜的釋放行為（模擬體液釋放）。

1.2.4 材料浸提液的細(xì)胞毒性檢測(cè)

當(dāng)時(shí)，火鍋的質(zhì)地有陶瓷、純銀、銀鍍金、銅、錫、鐵數(shù)種。其基本形式有兩種：一種為組合式，由鍋、爐支架、爐圈、爐盤、酒精碗5部分組成，可以同時(shí)上桌燒煮食物，也可單獨(dú)用鍋溫食品。另一種為鍋中帶爐，爐內(nèi)燒炭火，能把水燒開，生魚、生肉、蔬菜等放入沸水中可以煮熟。

傷科黃水/PVA 靜電紡絲膜作為一種創(chuàng)面敷料，應(yīng)當(dāng)具有良好的生物相容性。 由圖6 細(xì)胞毒性分析可以看出，傷科黃水/PVA 靜電紡絲納米纖維膜組的細(xì)胞存活率均在75%以上，各組材料浸提液的細(xì)胞存活率大小為PVA＞PVA/HS-0.5%＞PVA/HS-1%＞HS＞PVA/HS-2%。 PVA/HS-2%組的細(xì)胞存活率略低于HS 組，這可能與PVA 吸水使浸提液中藥物濃度變大有關(guān)，但參照《美國(guó)藥典》細(xì)胞毒性分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)RGR≥75%時(shí)，細(xì)胞毒性等級(jí)為0/1 級(jí)，屬于無明顯細(xì)胞毒性范疇，作為醫(yī)用材料使用屬于可以接受的范圍，可見本文中各濃度傷科黃水/PVA 靜電紡絲膜均沒有毒性可應(yīng)用于創(chuàng)面敷料。

參考GB/T 16886.5-2017/ISO 10993-5：2009標(biāo)準(zhǔn)和MTT 法，用NIH-3T3成纖維細(xì)胞測(cè)試?yán)w維膜樣品的體外細(xì)胞毒性。首先，制備浸提液。根據(jù)GB/T 16886.12-2017/ISO 10993-12：2012標(biāo)準(zhǔn)，按照樣品表面積（樣品的上下兩面面積之和）與浸提介質(zhì)的體積比為6 cm2/mL。浸提材料的介質(zhì)采用無血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基。將純PVA纖維膜和擔(dān)載不同濃度傷科黃水的PVA纖維膜樣品裁剪成1.0 cm×3.0 cm的形狀，通過紫外臭氧箱進(jìn)行消毒，在超凈工作臺(tái)中將材料放入無菌的浸提管內(nèi)，使材料完全浸泡在培養(yǎng)基中。浸提24 h后，過濾除菌，將處理后的浸提液密封后置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

采用SD 大鼠全層皮膚切除創(chuàng)面模型模擬嚴(yán)重創(chuàng)面損傷。 將構(gòu)建的靜電紡絲纖維敷料植于成年大鼠背部皮膚缺損處，于3、7和14 d時(shí)間點(diǎn)，觀察創(chuàng)面修復(fù)情況。 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)立空白對(duì)照組、傷科黃水原藥組、PVA、PVA/HS-0.5%、PVA/HS-1%和PVA/HS-2%組。

取出后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育4 h。 選擇490 nm波長(zhǎng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值（OD值），與對(duì)照組對(duì)比，按照公式（2）計(jì)算細(xì)胞存活率（Cell viability， CV）。

式中， ODs為實(shí)驗(yàn)組值， OD0為對(duì)照組值。

1.2.5 大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面修復(fù)實(shí)驗(yàn)

將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的NIH-3T3成纖維細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，然后將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，更換培養(yǎng)液，按以下方式進(jìn)行換液： 1）培養(yǎng)對(duì)照組，換無血清培養(yǎng)基，不加任何藥物，每組6 孔； 2）空白材料組，即不含傷科黃水的PVA 纖維膜浸提液，每組6 孔； 3）擔(dān)載傷科黃水的PVA 纖維膜組，即PVA/HS-2%、PVA/HS-1%和PVA/HS-0.5%靜電紡絲纖維膜組，換對(duì)應(yīng)的浸提液，每組6孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

取去離子水及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1%和2%的傷科黃水溶液各90 g，分別加入10 g PVA粉末，恒溫加熱攪拌使其充分溶解，以獲得PVA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的不同含藥量PVA/傷科黃水紡絲液，室溫靜置冷卻除泡，備用，分別命名為PVA、PVA/HS-0.5%、PVA/HS-1%和PVA/HS-2%。

運(yùn)用思維地圖進(jìn)行教學(xué)是培養(yǎng)學(xué)生形成清晰思路的一種方法，但不是唯一方法。沒有一種教學(xué)方法是萬能的，教師在課堂上需要根據(jù)實(shí)際情況，把這種方法與其他教學(xué)方法搭配使用，在不斷嘗試的過程中探索出效果最佳的教學(xué)路徑。思維地圖在課堂上展現(xiàn)的是教師講解知識(shí)的思路，把本來孤立零散的知識(shí)通過圖示方式實(shí)現(xiàn)具體化，更有效激發(fā)學(xué)生的思維，加強(qiáng)思考和不斷聯(lián)系，讓學(xué)生快速抓住重點(diǎn)，并不斷向外延伸。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶液可紡性及SEM表征

在PVA 溶液的靜電紡絲過程中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜8%或＞12%時(shí)，表現(xiàn)出不穩(wěn)定的泰勒錐和不連續(xù)的射流，或出現(xiàn)針頭堵塞等現(xiàn)象，成膜狀態(tài)較差，作為創(chuàng)面敷料的加工性和可操作性均不理想。 因此，本文后續(xù)工作中首先采用8%、10%和12%PVA溶液進(jìn)行中藥傷科黃水的靜電紡絲纖維膜制備研究。

通過SEM 對(duì)靜電紡絲纖維膜的表面進(jìn)行表征。 如圖2 所示，10% PVA 靜電紡絲纖維膜纖維粗細(xì)較勻，表面光滑（圖2A 和2E），而載藥PVA 靜電紡絲膜纖維表面粗糙，可見明顯藥物聚集的顆粒狀表面結(jié)構(gòu)（圖2F-2H）。 載藥組中，當(dāng)PVA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%（PVA/HS 8%-2%）時(shí)，所得藥膜纖維間存在串珠（圖2B和2F），纖維直徑分布為（172.03±31.13） nm； 當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%（PVA/HS 10%-2%）時(shí)，紡絲無節(jié)點(diǎn)串珠等結(jié)構(gòu)缺陷（圖2C 和2G），纖維直徑分布為（280.90±79.19） nm，紡絲質(zhì)量明顯改善，表現(xiàn)出最優(yōu)異的表面構(gòu)型； 當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12% （PVA/HS 12%-2%）時(shí)（圖2D和2H），紡絲液黏度變大，纖維直徑分布為（537.34±139.89） nm。 結(jié)果表明，PVA/HS 10%-2%組的纖維形貌、尺寸以及成膜效果最為理想。

圖2 10%PVA（A、E）、PVA/HS 8%-2%（B、F）、PVA/HS 10%-2%（C、G）、PVA/HS 12%-2%（D、H）靜電紡絲膜的4KX（A-D）和25KX（E-H）的SEM圖Fig.2 SEM images of 4KX （A-D） and 25KX （E-H） of the electrospinning films of 10%PVA（A， E）， PVA/HS 8%-2% （B， F）， PVA/HS 10%-2% （C， G）， PVA/HS 12%-2% （D， H）

2.2 力學(xué)性能

理想的敷料需要具備良好的貼附性和延展拉伸性能，以便更好地固定在創(chuàng)面上，避免肉芽組織的過度增生而得以控制傷口創(chuàng)面的收縮和變形。 圖3為不同PVA含量的傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線（圖3A-3C）以及拉伸強(qiáng)度（圖3D）、彈性模量（圖3E）和斷裂伸長(zhǎng)率（圖3F）分析結(jié)果，可見PVA/HS 10%-2%靜電紡絲纖維膜的拉伸強(qiáng)度和彈性模量均明顯高于PVA/HS 8%-2%和PVA/HS 12%-2%，并且具有（57.81±7.38）%的斷裂延伸率，表明具有良好的機(jī)械性能和延展性。 由于所紡得的纖維膜應(yīng)用于醫(yī)用敷料，必須具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和適當(dāng)?shù)难诱剐砸詽M足關(guān)節(jié)或皮膚的運(yùn)動(dòng)，結(jié)合SEM 結(jié)果，PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜更適合用于創(chuàng)面敷料。

圖3 PVA/HS 8%-2%（A）、PVA/HS 10%-2%（B）和PVA/HS 12%-2%（C）靜電紡絲膜的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線；拉伸強(qiáng)度分析（D）； 彈性模量分析（E） ； 斷裂伸長(zhǎng)率分析（F）。 *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001Fig. 3 The tensile stress-strain curves of the electrospinning films of PVA/HS 8%-2% （A）， PVA/HS 10%-2% （B），PVA/HS 12%-2% （C）； Tensile strength analysis （D）； Elastic modulus analysis （E）； Elongation at break analysis （F）.*P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001

2.3 不同含藥量傷科黃水/PVA靜電紡絲納米纖維敷料的吸液能力

不同的吸液率可以決定靜電紡絲纖維敷料吸收創(chuàng)口滲出的能力，是作為良好創(chuàng)面覆蓋物的一個(gè)影響因素。由圖4 可知，10%溶液的純PVA 靜電紡絲膜具有更強(qiáng)的吸水溶脹性能。擔(dān)載藥物后的傷科黃水/PVA 復(fù)合靜電紡絲纖維膜的吸液能力有所下降，但初始吸液能力仍可達(dá)自身重量的8 倍以上，黃水含量不同的PVA/HS-2%、PVA/HS-1%和PVA/HS-0.5%靜電紡絲纖維膜，其吸液能力相當(dāng)。 說明傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜適合用于創(chuàng)面敷料，吸收創(chuàng)口滲出。

圖4 傷科黃水/PVA靜電紡絲納米纖維敷料的吸液能力Fig.4 Fluid absorption capacity of Shangkehuangshui/PVA composite fiber membrane in trauma department

2.4 體外藥物釋放性能

依照?qǐng)D1 所示，搭建高壓電場(chǎng)靜電紡絲裝置，取紡絲液進(jìn)行靜電紡絲，與接收屏上收集靜電紡絲纖維［2］。 具體紡絲工藝參數(shù)為： 電場(chǎng)電壓18～24 kV，紡絲距離20 cm，進(jìn)樣速度0.019 mL/min，針頭內(nèi)徑為0.4 mm，溫度25 ℃，空氣相對(duì)濕度25%，制得靜電紡絲納米纖維膜。 將納米靜電紡絲纖維膜從鋁箔表面分離，對(duì)所得紡絲膜進(jìn)行SEM 表征觀測(cè)其表面形態(tài)，用電子萬能試驗(yàn)機(jī)測(cè)試其力學(xué)性能（每組樣品的平行樣本數(shù)≥5），篩選出適宜做藥膜的相關(guān)參數(shù)，并進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞生物學(xué)、病理學(xué)等相關(guān)性能測(cè)試。

圖5 不同載藥量傷科黃水/PVA靜電紡絲納米纖維膜的（A）藥物累計(jì)釋放百分比和（B）累計(jì)藥物釋放量Fig. 5 （A） The percentage of cumulative drugs released and （B） the amount of cumulative drugs released of Shangkehuangshui/PVA electrospinning nanofiber films in traumatology with different drug load

2.5 細(xì)胞毒性檢測(cè)分析

新會(huì)計(jì)制度中添加了預(yù)算會(huì)計(jì)管理，原有會(huì)計(jì)要素從5個(gè)變成了8個(gè)，由此看出國(guó)家在逐步加強(qiáng)對(duì)行政事業(yè)單位的預(yù)算管理監(jiān)管力度。固定資產(chǎn)管理在本次會(huì)計(jì)制度變更中也有較大變化，因此加強(qiáng)固定資產(chǎn)的預(yù)算管理也十分重要。

圖6 不同含藥量傷科黃水/PVA靜電紡絲納米纖維敷料的細(xì)胞毒性分析，*P＜0.05， ****P＜0.0001Fig. 6 Cytotoxicity analysis of different drug content of traumatology Shangkehuangshui/PVA electrostatic spinning nanofiber dressing， *P＜0.05， ****P＜0.0001

2.6 大鼠全層皮膚缺損修復(fù)能力評(píng)價(jià)

2.6.1 創(chuàng)面外觀觀察

如圖7A 所示，從不同時(shí)期的創(chuàng)面照片可以直觀地看出，隨著時(shí)間的增加，各組創(chuàng)面均有愈合的趨勢(shì)。 傷口閉合在傷口愈合中具有最重要的意義，收縮的傷口可以提供一個(gè)屏障，防止微生物的入侵。在所有組中，均觀察到創(chuàng)面面積減小，而傷科黃水/PVA 靜電紡絲纖維膜組創(chuàng)面愈合速度最快。 其中，14 d 后，傷科黃水/PVA 靜電紡絲纖維膜組創(chuàng)面恢復(fù)最好，表現(xiàn)為新形成的皮膚，皮膚附著物再生，而其它組創(chuàng)面仍有明顯的創(chuàng)口殘余，圖7B 為通過修復(fù)面積計(jì)算得出的創(chuàng)面愈合率。 創(chuàng)面愈合過程中，特別是第3-7 天，傷科黃水/PVA 靜電紡絲纖維膜組的愈合速率明顯高于其它組。 傷科黃水/PVA 靜電紡絲纖維膜組的創(chuàng)面愈合率在第14 天均達(dá)到80%以上。 這些結(jié)果表明，傷科黃水/PVA 靜電紡絲纖維膜組可以通過更快的再上皮化和更短的傷口閉合時(shí)間來加速傷口修復(fù)。

圖7 （A）第3-14 天不同材料修復(fù)創(chuàng)面效果代表性照片； （B）第3-14 天創(chuàng)面愈合率。 *P＜0.05， **P＜0.01，***P＜0.001， ****P＜0.0001Fig. 7 （A） Representative photos of wound healing effects of different materials on days 3-14； （B） Wound healing rate on the 3rd to 14th day. *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001， ****P＜0.0001

2.6.2 病理學(xué)觀察

為從病理學(xué)角度分析傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜組相比其它治療方法的顯微療效，評(píng)價(jià)創(chuàng)面的愈合病理，進(jìn)行H&E染色、Masson's染色、α-SMA和CD31免疫組化染色、TNF-α和IL-6免疫熒光染色試驗(yàn)（圖8）。

圖8 （A） 第7 天和第14 天創(chuàng)面邊緣組織H&E 染色（標(biāo)尺： 100 μm）。 （B） 第14 天Masson's 三色染色和放大圖。 （C） 第7 天和第14 天α-SMA 免疫組化染色（標(biāo)尺： 100 μm）。 （D） 第7 天和第14 天CD 31 免疫組化染色（標(biāo)尺： 100 μm）。（E） 第3天和第7天TNF-α和IL-6免疫熒光雙標(biāo)（標(biāo)尺： 50 μm）Fig. 8 （A） H&E staining of wound margin on days 7 and 14 （the bar indicates 100 μm）. （B） Masson's trichromatic staining and magnification on day 14. （C） α-SMA immunohistochemical staining on days 7 and 14 （the bar indicates 100 μm）. （D） Immunohistochemical staining of CD 31 on days 7 and 14 （the bar indicates 100 μm）.（E） TNF-α and IL-6 immunofluorescence on days 3 and 7 （the bar indicates 50 μm）

首先，使用蘇木精和伊紅（H&E）染色評(píng)估第7、14天的組織樣本（圖8A）。 術(shù)后第7天空白組、HS組和PVA 組仍可見較明顯的炎癥反應(yīng)，新生組織中可見大量的新生毛細(xì)血管和纖維母細(xì)胞，并伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。 所有組可見肉芽組織填充傷口，其中PVA/HS-2%組最厚。 傷科黃水/PVA 靜電紡絲纖維膜PVA/HS-0.5%、PVA/HS-1%和PVA/HS-2%組炎癥反應(yīng)明顯減弱，而且傷科黃水/PVA 靜電紡絲纖維膜組的微血管數(shù)量明顯多于其它組，呈現(xiàn)PVA/HS-2%＞PVA/HS-1%＞PVA/HS-0.5%趨勢(shì)。

術(shù)后第14 天，可見含傷科黃水原藥組及傷科黃水/PVA 靜電紡絲纖維膜組基底細(xì)胞增生形成單層上皮覆蓋于肉芽組織表面，同時(shí)可見微血管數(shù)量開始減少，特別是PVA/HS-2%組的愈合效果明顯好于其他各組，可見纖維母細(xì)胞數(shù)量減少，表皮組織再生，肉芽組織已逐漸生長(zhǎng)成熟。

展覽期間，“紀(jì)念譚建丞先生誕辰120周年座談會(huì)”在湖州市博物館舉行，受邀專家學(xué)者與譚老的學(xué)生共同緬懷這位藝術(shù)先賢。

如圖8B所示，采用Masson's三色染色（Masson's trichrome， Masson）觀察術(shù)后第14天的膠原沉積及組織情況。 空白組、PVA 組仍可見較明顯的炎癥反應(yīng)，并伴有豐富的微血管。 高倍視野觀察可見，PVA/HS-2%組膠原蛋白沉積量明顯高于其它各組，并可觀察到新生組織中膠原纖維粗大致密，松散分布在真皮組織中，表現(xiàn)出更成熟的表型，具有規(guī)則的方向和膠原網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洌?2-13］。 膠原蛋白沉積總量排列順序?yàn)椋?PVA/HS-2%＞PVA/HS-1%＞HS＞PVA/HS-0.5%＞空白組＞PVA 組。 以上組織學(xué)結(jié)果表明，PVA/HS-2%傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜組對(duì)全層創(chuàng)面具有較好的愈合效果。

在創(chuàng)面閉合的中間階段，肌成纖維細(xì)胞的高水平表達(dá)通常與創(chuàng)口收縮的持續(xù)時(shí)間有關(guān)，最終導(dǎo)致更好的創(chuàng)面愈合，需要注意的是α-SMA 的表達(dá)具有時(shí)間依賴性［14-15］。 用α-SMA 免疫組化染色檢測(cè)第7 天和第14 天的組織樣本，如圖8C 所示。 HS 組、PVA 組處理的創(chuàng)面α-SMA 表達(dá)在第14 天仍然較高，表明這些創(chuàng)面仍處于創(chuàng)面修復(fù)的增殖期。 相比之下，傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜組在第14天出現(xiàn)α-SMA表達(dá)明顯下調(diào)，并且α-SMA 表達(dá)量排列順序?yàn)镻VA/HS-0.5%＞PVA/HS-1%＞PVA/HS-2%。 這表明傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜組進(jìn)入重塑期，肌成纖維細(xì)胞凋亡，肉芽組織收縮減弱，從而防止異常瘢痕形成［16］。

對(duì)上下左右四個(gè)方向產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估方式為建立多個(gè)子算法加權(quán)得分，而得分最高的方向即為當(dāng)前行動(dòng)的最佳方向，下一步向該方向移動(dòng)，為局部最優(yōu)策略。由于不同子算法之間評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)的不同，可能出現(xiàn)相互干擾，甚至相互對(duì)立的情況，同時(shí)不同時(shí)期受到的影響也可能不同，所以我們需要通過調(diào)整數(shù)字權(quán)重以及子算法權(quán)重完成優(yōu)化，找到較好的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，提高勝率。

血管的浸潤(rùn)和生長(zhǎng)是皮膚功能再生的關(guān)鍵。 CD31可以識(shí)別傷口處新形成的血管［17-19］。 為了評(píng)價(jià)傷科黃水/PVA 靜電紡絲纖維膜對(duì)新生血管的影響，在術(shù)后第7天、14天，通過CD31免疫組化染色，研究皮膚缺損區(qū)的血管分布［20-21］。 如圖8D 所示，第7天，各組創(chuàng)面的新生組織中出現(xiàn)了大量的微血管，數(shù)量多且孔徑較小，而且傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜組處理的創(chuàng)面的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和微血管明顯多于其他組。 隨著血管的生成成熟，血管數(shù)在術(shù)后第14天迅速減少，其中傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜組處理的創(chuàng)面的毛細(xì)血管數(shù)減少幅度最大，并且微血管數(shù)排列順序?yàn)镻VA/HS-0.5%＞PVA/HS-1%＞PVA/HS-2%。 該結(jié)果與H&E 染色結(jié)果一致，表明從微血管數(shù)量變化情況分析，PVA/HS-2%傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜組處理的創(chuàng)面愈合速度明顯快于其他組。

大量研究表明，炎癥因子等細(xì)胞因子與傷口愈合密切相關(guān)。 TNF-α和IL-6是促炎細(xì)胞因子，TNF-α和IL-6 的過度表達(dá)會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，阻礙皮膚修復(fù)。 第3 天和第7 天用IL-6、TNF-α雙標(biāo)免疫熒光染色法檢測(cè)各組大鼠創(chuàng)口處的炎癥反應(yīng)，來評(píng)估預(yù)防炎癥的療效（圖8E）。 術(shù)后第3 天，各組均有明顯的陽性表達(dá)，而且表達(dá)強(qiáng)度相似，說明傷口處出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。 術(shù)后第7 天，IL-6 炎性表達(dá)進(jìn)一步增加，其中空白組和PVA 組明顯高于其他各組，PVA/HS-2%組在第7 天的IL-6、TNF-α免疫熒光表達(dá)均低于其它各組，說明PVA/HS-2%具有良好的抗炎能力，在創(chuàng)面植入PVA/HS-2%傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜，可降低創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，縮短炎癥反應(yīng)時(shí)間，使創(chuàng)面能夠更快地進(jìn)入再生階段。

經(jīng)過激烈的角逐，最終，洛川縣鳳棲鎮(zhèn)西井村果農(nóng)王建云的蘋果，憑借縱橫比0.95、糖度18.6、硬度7.9的內(nèi)在品質(zhì)，以及外觀、口感綜合9.7的專家評(píng)審最高分，摘得首屆洛川蘋果親土狀元的桂冠。

3 結(jié) 論

通過高壓靜電紡絲的方式制備了傷科黃水/PVA 靜電紡絲納米纖維敷料。 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，該創(chuàng)面敷料具有良好的機(jī)械性能、吸液能力和藥物緩釋功能。 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和大鼠皮膚全層缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜具有較好的生物相容性，不會(huì)造成排異反應(yīng)，且與傳統(tǒng)臨床應(yīng)用傷科黃水的方法相比可起到類似人工皮膚的作用，進(jìn)而防止創(chuàng)口感染，易于吸收創(chuàng)口恢復(fù)前期滲出，加速皮膚缺損修復(fù)。 其中，PVA/HS-2%傷科黃水/PVA靜電紡絲纖維膜組，有更好的創(chuàng)面修復(fù)效果。

綜上可見，傷科黃水/PVA 靜電紡絲纖維膜具有作為一種良好的創(chuàng)面覆蓋物、吸收創(chuàng)口滲出和加速皮膚缺損修復(fù)的巨大潛力，在拓寬院內(nèi)制劑中藥“傷科黃水”的應(yīng)用形式，增強(qiáng)其使用效果方面具有十分廣闊的前景，后期將進(jìn)行中試放大實(shí)驗(yàn)并重點(diǎn)關(guān)注其在臨床上用于骨傷導(dǎo)致的輕度皮膚創(chuàng)傷或嚴(yán)重皮膚組織創(chuàng)傷的即時(shí)關(guān)閉及修復(fù)效果。