人參皂苷CK的生物制備及抗腫瘤作用機制研究進展＊

陳胤臣，任晗歸，席志超＊＊，徐宏喜＊＊

（1. 上海中醫(yī)藥大學中藥學院 上海 201203；2. 中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心 上海 201203）

根據(jù)GLOBOCAN 2020 年發(fā)布的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，中國的癌癥發(fā)病數(shù)和死亡人數(shù)占全球的23.7%和30.2%，且發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)不斷上升的趨勢[1]。研發(fā)安全有效的抗腫瘤藥物一直以來都是癌癥研究的重點和難點。天然藥物是發(fā)現(xiàn)活性先導(dǎo)化合物的寶庫，為藥物創(chuàng)新提供寶貴資源[2]，其中不乏結(jié)構(gòu)新穎，低毒高效的天然藥效物質(zhì)，值得更深入地研究。

人參（Panax ginsengC. A. Meyer）為五加科人參屬植物人參的根和根莖，被譽稱為“中藥百草之王”。中醫(yī)認為其具有大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血和安神益智等功效[3]。20 世紀60 年代，F(xiàn)ujita 等[4]日本天然藥物化學家首次分離出了多種人參皂苷，并鑒別出化學結(jié)構(gòu)。隨后越來越多的學者開始著眼于人參皂苷的藥理活性研究，如Rb1 被證明對心血管疾病和代謝類疾病等均具有一定的治療作用[5]。其中，CK被發(fā)現(xiàn)具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗糖尿病和神經(jīng)保護等作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景[6]。1997 年，Wakabayashi 等[7]首次發(fā)現(xiàn)CK 可以抑制黑色素瘤細胞的肺轉(zhuǎn)移，從此開啟了研究CK 抗腫瘤活性及作用機制研究的熱潮。迄今，CK 已經(jīng)被證實對肝癌、肺癌和胃癌等多種癌癥具有顯著的抑制作用[8]，并且與順鉑（Cisplatin，DDP）[9]、環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）[10]等常用化療藥物聯(lián)合使用時，可以有效地提高治療效果。進一步深入的機制研究發(fā)現(xiàn)，CK 具有多重抗腫瘤作用機制，如促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯等。

作為一種腸道代謝產(chǎn)物，CK 不能從人參中直接提取獲得，需要由Rb1 等天然人參皂苷經(jīng)腸道轉(zhuǎn)化而成[11]。盡管Akao 等[12]的實驗證明，CK 比Rb1 具有更高的生物利用度，但是代謝動力學研究表明，CK 在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化速率有限，并且一些腸道細菌會影響CK的生物轉(zhuǎn)化效率[13]。因此，實現(xiàn)CK 的體外人工制備，提升CK 的產(chǎn)量，將對降低CK 價格和促進CK 開發(fā)成有潛力的臨床藥物具有重要意義。目前，通過生物轉(zhuǎn)化或生物合成是獲得CK 的主要途徑。多種酶和微生物已被用于提高CK 的生物轉(zhuǎn)化效率，實現(xiàn)了多種天然人參皂苷向CK 的轉(zhuǎn)化的過程。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)了生物合成CK 的多種途徑及關(guān)鍵酶和基因，可將結(jié)構(gòu)相對簡單化合物合成為CK，這大大加快了制備CK的研究進展。

近年來，徐宏喜教授團隊一直致力于人參的化學、作用機制和臨床應(yīng)用的研究。在化學研究方面，課題組利用包括UPLC-QTOF-MS/MS 在內(nèi)的多種方法，成功發(fā)現(xiàn)用于區(qū)分生曬參與紅參的9 種人參皂苷標志物和特征性組分，進一步完善了生曬參與紅參的質(zhì)量評價標準[14-15]。為了促進林下山參年份鑒定檢測方法的發(fā)展，課題組基于UPLC-Q-TOF/MS 的非靶向代謝組學技術(shù)，鑒定出可用于區(qū)分4-10 年、11-15 年、16-20 年林下參的指標成分群，為山參的年份鑒定提供了新方法?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，課題組進一步改進了人參皂苷的提取方法以及檢測條件，優(yōu)化了野山參提取液的制備工藝并實現(xiàn)了野山參口服液的成果轉(zhuǎn)讓。此外，還開展了一系列人參臨床應(yīng)用的研究，發(fā)現(xiàn)紅參復(fù)方提取物具有降血脂的功效，對于“虛證”的患者具有抗疲勞的功效，且沒有明顯“上火”副作用和其他不良事件[16]。這些研究為規(guī)范人參質(zhì)量，促進人參從傳統(tǒng)中草藥向現(xiàn)代臨床應(yīng)用提供了科學依據(jù)?；谏鲜鯟K 的重要藥理活性，課題組著重開展了CK的藥理藥效研究，發(fā)現(xiàn)CK 可以有效緩解缺血性腦卒中導(dǎo)致的神經(jīng)損傷，緩解腦損傷后導(dǎo)致的身體機能障礙；CK 還可以特異性殺傷休眠期癌細胞，從而抑制腫瘤的增殖和復(fù)發(fā)。以上研究成果將進一步闡明“百草之王”人參藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，揭示CK 的藥效作用機制，促進以CK為主要成分的新型藥物研發(fā)及應(yīng)用。

本篇綜述系統(tǒng)梳理并總結(jié)了CK 的生物制備及抗腫瘤作用機制研究進展。按照不同生物制備方法，對近10 年來CK 生物制備的最新研究成果進行了歸類，整理了各方法的反應(yīng)條件和效率產(chǎn)量，同時對不同方法的優(yōu)勢和不足進行了探討。在CK 抗腫瘤研究方面，本文根據(jù)CK 的作用機制進行歸納分類，分別從CK 誘導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和調(diào)控腫瘤細胞自噬等方面進行闡述，并對其成藥潛力進行了分析與評價。

1 CK生物制備的研究進展

CK 的生產(chǎn)制備方法主要為化學合成法、生物轉(zhuǎn)化法以及生物合成法（圖1）[17]。通過化學合成法合成CK 具有反應(yīng)速度快和成本低廉的特點，但該方法步驟繁瑣、產(chǎn)率較低且副產(chǎn)物多，因此相關(guān)的研究及報道較少[18]。相較而言，采用生物轉(zhuǎn)化法和生物合成法制備CK 是更常用的方法。生物轉(zhuǎn)化法主要通過酶解其他二醇型人參皂苷C-3 和C-20 位上的多余糖基得到CK，所用的生物催化劑多為酶和微生物。生物轉(zhuǎn)化法具有專屬性高、制備流程簡便和產(chǎn)率高的特點，但通過生物轉(zhuǎn)化法制備CK 的成本較高且對轉(zhuǎn)化前體的純度有一定要求。生物合成法則是通過將結(jié)構(gòu)相對簡單且價格低廉的化合物合成為CK，目前已經(jīng)實現(xiàn)了從葡萄糖到CK 的從頭生物合成。這大大縮減了生產(chǎn)成本，使CK 可以由價格低廉的原料合成獲得，但是生產(chǎn)周期仍然較長[19]。

圖1 CK的生物制備示意圖

1.1 CK的生物轉(zhuǎn)化法

根據(jù)使用的生物催化劑種類，CK 的生物轉(zhuǎn)化法可以分為酶轉(zhuǎn)化法和微生物轉(zhuǎn)化法。酶轉(zhuǎn)化法是利用不同種類和來源的酶，酶解其他人參皂苷或人參皂苷結(jié)構(gòu)類似物，從而獲得CK 的方法。主要使用的酶包括單一糖苷酶（如β-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等）和混合酶（黑曲霉胞外酶、蝸牛酶等）（表1）。

表1 CK的生物轉(zhuǎn)化

β-葡萄糖苷酶是一類最常用的單一糖苷酶，它能將多種人參皂苷或人參皂苷類似物轉(zhuǎn)化為CK。Zhong等[20]通過在大腸桿菌BL21 中克隆表達β-葡萄糖苷酶基因（bgy1）來獲得β-葡萄糖苷酶，發(fā)現(xiàn)其能將絞股藍苷XVII 轉(zhuǎn)化成為CK。Zhang 等[21]從短雙岐桿菌ATCC 15700（BbBg1）中獲得的新型β-葡萄糖苷酶，可以將人參皂苷Rd 轉(zhuǎn)化為CK，其12 小時內(nèi)的摩爾轉(zhuǎn)化率高達96%。此外，Shin 等[22]從嗜熱厭氧菌中獲得了一種能夠水解人參皂苷多位點上糖基團的β-葡萄糖苷酶，該酶可以將Rb1、Rb2 和Rc 轉(zhuǎn)化為CK，轉(zhuǎn)化率達100%。Choi 等[23]通過改造β-葡萄糖苷酶得到L213A變異型酶，該酶能更高效地將Rc轉(zhuǎn)化為CK，轉(zhuǎn)化效率是自然酶的1.5倍。

除使用單一生物酶進行生物轉(zhuǎn)化外，一些復(fù)合酶也被用于制備CK。如Zheng 等[24]發(fā)現(xiàn)柚皮苷酶（鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶的混合物）可以酶解二醇型絞股藍苷，將其轉(zhuǎn)化成CK。Li等[25]通過蝸牛酶（纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖醛酸酶的復(fù)合物）將二醇型人參皂苷水解為CK。Jiang 等[26]和Jeong 等[27]發(fā)現(xiàn)黑曲霉胞外酶對于人參皂苷有很強的生物催化活性，能將含量較大的人參皂苷如Rb1 等轉(zhuǎn)化為CK。Shin 等[28]將α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶同β-葡萄糖苷酶聯(lián)合使用，大大增強了紅參提取物中Rb1、Rb2 和Rc 轉(zhuǎn)化為CK 的效率，摩爾轉(zhuǎn)化率達到100%，產(chǎn)率為348 mg·L-1·h-1。

微生物轉(zhuǎn)化法是利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的一系列生物酶，對含量較高的人參皂苷進行有目的的結(jié)構(gòu)改造與修飾，從而得到稀有人參皂苷的方法（表1）。如LH4 是從韓國泡菜中分離得到的類食品乳桿菌，其可以在30℃、pH 6.0 的條件下將Rb1 水解成CK，摩爾轉(zhuǎn)化率為88%[29]。類似地，Yoo 等[30]用從泡菜中分離得到的短乳桿菌發(fā)酵人參細根，能高效地制備CK。Wang 等[31]利用冬蟲夏草菌將Rb1 轉(zhuǎn)化為CK，摩爾轉(zhuǎn)化率可達82%。

1.2 CK的生物合成法

CK 的生物合成法是利用合成生物學在微生物中構(gòu)建異源途徑生產(chǎn)CK[32]，以達到降低生產(chǎn)成本和提升產(chǎn)量的目的的方法（表2）[33]。CK的生物合成首先通過對CK 的生物合成酶基因等進行表征與鑒定，精確控制CK 的生物合成途徑。其次需選取適合實現(xiàn)生物合成途徑的細胞工廠，多項CK 的生物合成研究已證實，通過基因工程技術(shù)獲得的人參酵母，其安全性高和遺傳背景較為明確，已被公認為是常用來生產(chǎn)CK 的細胞工廠[34]。

表2 CK的生物合成

CK 生物合成的主要難點在于對專一生產(chǎn)CK 的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶類（Uridine diphosphate glucosyltransferase，UGTs）的篩選，因各二醇型人參皂苷結(jié)構(gòu)相近，基本母核均為四環(huán)三萜，CK 的特異性主要體現(xiàn)在C-20 位的糖苷鍵。而各類UGTs 能夠通過催化不同種原人參二醇，將不同糖苷鍵連在特定位點，最終生產(chǎn)出各類人參皂苷[35]。因而，從各類UGTs中篩選出能將葡萄糖特異地修飾在原人參二醇的C-3及C-20位點的UGTs對CK的生物合成至關(guān)重要。

2014 年，Yan 等[36]成功鑒定出UDP 糖基轉(zhuǎn)移酶——UGTPg1，這是首個用于植物四環(huán)三萜類底物糖基化的UGT，成功實現(xiàn)了從葡萄糖到CK 的生物從頭合成。在此基礎(chǔ)上，Li 等[37]利用解脂耶氏酵母構(gòu)建了一條制備CK 的生物合成途徑，通過增加天然甲羥戊酸途徑關(guān)鍵基因的表達，促進細胞色素P450氧化還原酶生成，進而提升了CK 的合成產(chǎn)量。Wang 等[38]通過增強酵母中UDP-葡萄糖合成基因的表達，構(gòu)建了能特異性生產(chǎn)CK 的菌株—YS01-CK，使CK 的產(chǎn)量達到了1.17 g·L-1。Nan等[39]在釀酒酵母菌株WLT-MVA5中誘導(dǎo)PGM2、UGP1和UGTT基因表達，獲得了能高效合成CK 的菌株WLN1。通過進一步對酵母培養(yǎng)基的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中甘油提供的碳含量達到20%時，CK的產(chǎn)量最高（1.7 g·L-1），摩爾轉(zhuǎn)化率為77.37%。

CK 的生物制備（包括生物轉(zhuǎn)化和生物合成）在近年來取得了長足的發(fā)展，使CK 的制備更為簡便和高效，為其大規(guī)模生產(chǎn)提供了可能。在CK 的生物轉(zhuǎn)化方面，其發(fā)展主要體現(xiàn)在：拓寬轉(zhuǎn)化途徑、提升摩爾轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)量和簡化反應(yīng)步驟等[40]。例如，引入黑曲霉胞外酶拓寬了轉(zhuǎn)化底物譜，不但可以轉(zhuǎn)化Rb1，還可以轉(zhuǎn)化Rc、Compound Y 和Compound O[26-27]。在生物合成CK 方面，其進步主要體現(xiàn)在CK 細胞工廠及生物合成酶方面的優(yōu)化，尤其是對UGTs 研究的深入，使葡萄糖修飾能特異性地定位在原人參二醇的C-20 位點，提升了CK 合成的特異性。此外，多種生物合成新技術(shù)的應(yīng)用如基因組工程和代謝工程等，也使CK 的合成更加高效。例如，采用基因干擾手段提高菌株中特定基因的表達，使改造過的菌株成為特異性生產(chǎn)CK 的菌株，可顯著提升CK合成的專屬性和產(chǎn)量[39]。

2 CK抗腫瘤機制研究進展

研究證實，CK 對于多種腫瘤都具有顯著地抑制作用，并通過不同的作用機制發(fā)揮療效（圖2），在癌癥治療中有一定的臨床應(yīng)用前景。本文從腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、自噬及耐藥等方面，對CK 的抗腫瘤藥理活性進行了系統(tǒng)地總結(jié)與闡述。

圖2 抗腫瘤活性及作用機制

2.1 誘導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯

細胞周期異常引起的細胞增殖失控是腫瘤細胞的重要特征之一[41]，因此阻滯腫瘤細胞的周期進程是抑制腫瘤細胞增殖的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)，CK 對于多種腫瘤細胞的周期均具有調(diào)控作用。例如，CK 可通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的轉(zhuǎn)錄因子1（Bcl2-associated transcription factor 1，Bclaf1）和抑制低氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）介導(dǎo)的糖酵解代謝途徑，誘導(dǎo)肝癌Bel-7404 細胞和Huh7 細胞發(fā)生G0/G1期周期阻滯，從而抑制肝癌細胞的增殖。動物實驗證明CK 可呈劑量依賴地抑制腫瘤生長，并顯著降低了腫瘤組織中Bclaf1及糖酵解相關(guān)蛋白的表達[42]。Wang 等[43]發(fā)現(xiàn)CK 能顯著抑制結(jié)腸癌HCT-116細胞和腫瘤抑制因子p53 突變型SW480 細胞的增殖，將腫瘤細胞阻滯在G1期。此外，腎癌RCC細胞中的睪丸相關(guān)的高度保守的致癌性長鏈非編碼RNA（Testisassociated highly-conserved oncogenic long non-coding RNA，THOR）與非癌細胞相比表達異常升高。Chen等[44]發(fā)現(xiàn)CK 能顯著抑制THOR 的表達，并呈劑量依賴地阻滯RCC細胞從G2向M期的轉(zhuǎn)化。

2.2 誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主而有序的程序性死亡，細胞增殖與凋亡的失衡是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因之一[45]。研究表明，CK 可通過調(diào)控多種蛋白及分子通路誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。如CK 可呈劑量依賴地誘導(dǎo)卵巢癌CAOV3 細胞發(fā)生含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）Caspase-8 介導(dǎo)的外源性途徑以及Caspase-9調(diào)控的內(nèi)源性凋亡，進一步激活Caspase-3 蛋白，誘導(dǎo)多聚（ADP-核糖）聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]的剪切，導(dǎo)致細胞凋亡[46]。CK 通過激活肝癌SMMC-7721 細胞中的轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路，引起Caspase-3 蛋白剪切，誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡[47]。此外，在鼻咽癌HK-1 細胞中，CK 可同時激活Caspase 蛋白級聯(lián)反應(yīng)、誘導(dǎo)細胞凋亡誘導(dǎo)因子（Apoptosis inducing factor，AIF）易位和線粒體功能損傷，并在體內(nèi)證實了CK 對HK-1細胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用[48]。另有研究發(fā)現(xiàn)，CK還可通過誘發(fā)持續(xù)且高強度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。如Yin 等[49]證實CK 可以增加宮頸癌Hela細胞中的鈣離子濃度，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子紊亂，降低蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、肌醇必需酶1α（Inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）蛋白，增加磷酸化α 亞基的真核起始因子2（Phosphorylated α subunit of eukaryotic initiation factor 2，p-eIF2α）、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（Enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）和Caspase-12 蛋白的表達水平，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡。

2.3 抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移

腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特征[50]，其主要標志物有基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）MMP-2 與MMP-9、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）和E-鈣粘蛋白（E-cadherin）等。研究發(fā)現(xiàn)，CK 可以通過減少腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移來抑制多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如Lee等[51]發(fā)現(xiàn)CK減少了膠質(zhì)瘤U87MG細胞和U373MG 細胞中腫瘤干細胞標記物CD133、同源盒轉(zhuǎn)錄因子Nanog、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（Octamer binding protein 4，OCT4）和性別決定區(qū)Y 框蛋白2（Sex determining region Y-box 2，SOX2）的表達，同時降低MMP-2 和MMP-9 的表達，從而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞表型獲得間質(zhì)細胞特征的過程，其中當上皮細胞標志物（E-cadherin）表達減少，間質(zhì)細胞標志物（N-cadherin）表達增加，腫瘤細胞的侵襲和遷移能力增強[52]。研究發(fā)現(xiàn)，CK可抑制乳腺癌MCF-7細胞中的EMT 轉(zhuǎn)化，顯著上調(diào)E-cadherin 的mRNA 表達水平，減少N-cadherin 和波形蛋白（Vimentin）的mRNA 表達。其作用機制可能與CK 抑制磷脂酰肌醇三激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB，又稱Akt）信號通路有關(guān)[53]。類似地，彭等發(fā)現(xiàn)CK 顯著下調(diào)人肝癌HepG2 細胞中磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷酸化Akt蛋白以及N-cadherin蛋白的表達水平，上調(diào)E-cadherin蛋白表達水平，通過抑制EMT 過程降低HepG2 細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[54]。此外，在裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型中，CK 通過降低信息沉默調(diào)節(jié)因子2 同源物蛋白1（Silent information regulator 2 homologue 1，SIRT1）的表達抑制了非小細胞肺癌A549細胞的轉(zhuǎn)移[55]。

2.4 調(diào)控腫瘤細胞自噬

自噬是一種細胞內(nèi)降解系統(tǒng)，能將受損的蛋白質(zhì)或細胞器等在溶酶體中降解以供細胞進行循環(huán)利用[56]。大量研究表明，自噬對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有雙重調(diào)控作用[57]。有趣的是，CK 對于腫瘤細胞的自噬也具有雙重調(diào)控作用。一方面，CK 可通過誘導(dǎo)自噬抑制腫瘤細胞增殖，例如CK 通過激活A(yù)549 細胞和肺腺癌H1975 細胞中的腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5’ -monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路，增強c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）蛋白的磷酸化水平，促進細胞自噬發(fā)生，抑制肺癌細胞的增殖[58]。另一方面，Oh 等[59]研究發(fā)現(xiàn)，CK 可以通過阻斷神經(jīng)母細胞瘤SK-N-BE 和SH-SY5Y 細胞中自噬過程晚期的自噬體和溶酶體融合，抑制腫瘤細胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.5 增加抗腫瘤藥物敏感性

鑒于CK 在多種腫瘤中被證實具有潛在的治療作用，越來越多的研究著眼于將CK 與臨床抗腫瘤藥物進行聯(lián)合使用。研究發(fā)現(xiàn)，CK 與化療藥物聯(lián)用不僅可以增強化療藥物的敏感性還可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥。例如，CK 與5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）聯(lián)用可顯著增強對胰腺癌PANC-1 細胞的增殖抑制作用，減少EMT 轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[60]。將CK 與治療乳腺癌的常用藥物順鉑聯(lián)用，可增強順鉑對乳腺癌MCF-7 細胞的增殖抑制作用[9]。此外，CK 還可增加對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Recombinant tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）藥物耐受的結(jié)腸癌HT-29 細胞的敏感性，聯(lián)用導(dǎo)致促進細胞存活的蛋白表達下降，促凋亡蛋白的表達上升，進而誘導(dǎo)死亡受體5（Death receptor 5，DR5）在細胞表面的表達增加[61]。值得注意的是，在使用CK作為聯(lián)用藥物時需考慮常規(guī)抗腫瘤藥物的使用劑量，避免產(chǎn)生拮抗作用。例如在CK 同順鉑聯(lián)合治療A549 細胞時發(fā)現(xiàn)，較大劑量順鉑與CK 聯(lián)用（50 μg·mL-1CK+20 μg·mL-1順鉑）可協(xié)同誘導(dǎo)A549 細胞凋亡，而當使用較小劑量順鉑同CK 聯(lián)用（1.5625 μg·mL-1CK+0.625 μg·mL-1順鉑）時會產(chǎn)生拮抗[62]。

以上研究表明，CK 在癌癥治療中通過不同的作用機制發(fā)揮療效，包括誘導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移、調(diào)控腫瘤細胞自噬和增加抗腫瘤藥物敏感性等，具有顯著的抗腫瘤作用。盡管現(xiàn)有研究已證實CK 對于多個蛋白和信號通路具有調(diào)控作用，但其直接作用的靶蛋白仍不明確，需對其抗癌作用機制進行更加深入的研究。例如CK 可通過調(diào)控細胞自噬抑制腫瘤細胞增殖，但具體影響了自噬過程中的哪一環(huán)節(jié)尚未闡明；CK 導(dǎo)致的細胞凋亡是否和自噬存在信號通路間的調(diào)控；線粒體是否為CK 作用的關(guān)鍵細胞器等問題仍有待研究。此外，研究發(fā)現(xiàn)CK在免疫性疾病中能夠抑制T細胞及免疫趨化因子的表達[63]，減輕自身免疫性關(guān)節(jié)炎。隨著近年來腫瘤免疫治療的發(fā)展，其在免疫應(yīng)答中的作用值得更詳細的研究。綜上所述，通過對CK 抗腫瘤作用機理的系統(tǒng)闡述進一步提升了CK 的藥用價值，為其日后的臨床開發(fā)應(yīng)用具有積極意義。

3 討論與展望

CK 是二醇型人參皂苷在腸道內(nèi)的主要代謝物，具有較好的抗腫瘤活性，對治療結(jié)腸癌、肝癌和乳腺癌等具有潛在的應(yīng)用價值[11]。隨著近年來對CK 抗腫瘤機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)CK 不僅能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯[42-44]和細胞凋亡[46-49]，還具有調(diào)控細胞自噬[58-59]和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[51,53-55]等作用。此外，CK 作為輔助用藥在與臨床常規(guī)抗腫瘤藥物如順鉑[9]和環(huán)磷酰胺[10]等聯(lián)用時展現(xiàn)出了良好的協(xié)同抗腫瘤作用，具有增強常規(guī)抗腫瘤藥物療效和逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性等作用。有研究表明，在多種腫瘤細胞中，CK 的有效治療劑量往往小于其他人參皂苷[64]，且CK表現(xiàn)出更好的生物利用度。盡管目前尚無證據(jù)表明CK 發(fā)揮抗腫瘤作用的效應(yīng)基團是什么，但相對于其他二醇型人參皂苷，CK含有的糖基較少，僅在C-20上連有一個葡萄糖基。這使得CK 比其他人參皂苷的分子量更小和極性較小[65]，更易透過細胞膜[65]，這可能是CK 對于具有較高抗腫瘤生物活性的潛在原因。

由于CK 不能從人參中直接提取獲得，研發(fā)高效制備CK 的方法十分必要。目前通過化學合成法制備CK 的產(chǎn)率較低、步驟繁瑣，因此優(yōu)化CK 的化學合成路線、工藝條件和提高合成產(chǎn)率非常重要。相比之下，生物轉(zhuǎn)化法和生物合成法發(fā)展迅速，且各有優(yōu)勢。其中，生物轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化流程簡便、中間產(chǎn)物少、選擇性好。除了使用β-葡萄糖苷酶等單一酶外，一些復(fù)合酶以及微生物也可以將不同類型人參皂苷轉(zhuǎn)化為CK，不僅提高了CK 的產(chǎn)量還增加了轉(zhuǎn)化途徑，未來如何進一步開發(fā)能夠同時轉(zhuǎn)化多種二醇型皂苷的酶和微生物，或許是CK 生物制備法實現(xiàn)突破的關(guān)鍵點。另外，生物合成法所用原料（葡萄糖、甘油等）廉價易得，大大降低了CK 的生產(chǎn)成本，為CK 的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，后續(xù)仍可進一步降低生產(chǎn)周期與生產(chǎn)步驟的工藝條件進行優(yōu)化。

盡管目前對CK 的生物制備到抗腫瘤活性已有了較為全面的認知，但尚存在一系列科學問題需要更加深入和系統(tǒng)的研究，如提高CK 抗腫瘤活性評價的精確性、進一步明確CK 抗腫瘤的作用靶點、進行系統(tǒng)的毒理評價及臨床療效研究等。在今后的CK 抗腫瘤活性研究中可采用更精準的細胞和動物腫瘤模型對其抗腫瘤活性進行更準確地評價，如建立臨床來源的腫瘤細胞株、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤自發(fā)模型和原位轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)模型等。關(guān)于CK 的抗腫瘤作用靶點研究，現(xiàn)有研究往往限定于經(jīng)典通路如PI3K/Akt[53]、AMPK/mTOR[54]等，沒有對其特異性靶點深度挖掘，后續(xù)研究應(yīng)著重探究其關(guān)鍵作用靶點，為臨床藥物開發(fā)提供支持。此外，還可通過CK 的構(gòu)效關(guān)系研究，明確其抗腫瘤的活性基團，進一步優(yōu)化CK 的結(jié)構(gòu)。目前CK 抗腫瘤研究大多停留于藥效研究，應(yīng)加強系統(tǒng)的動物毒理學研究及臨床研究，為后續(xù)CK 開發(fā)成抗腫瘤藥物提供科學權(quán)威的藥效學和毒理學數(shù)據(jù)。并且，還可探究人體CK 轉(zhuǎn)化過程中起重要作用的腸道菌群，研究這些腸道菌群是否會影響CK 的生物活性進而影響其抗腫瘤的效果。在藥劑學方面，或可通過納米載藥及抗體偶聯(lián)藥物等靶向劑型的開發(fā)，可幫助CK 實現(xiàn)增效減毒的作用，促進其藥物的研發(fā)與轉(zhuǎn)化。

綜上所述，在癌癥高發(fā)病率及抗腫瘤藥物研發(fā)成本居高不下的大背景下[66]，需要積極開發(fā)新的抗腫瘤活性先導(dǎo)化合物。CK 在抗腫瘤活性方面已經(jīng)積累了較好的前期研究基礎(chǔ)，未來值得進行更深入和系統(tǒng)的研究，最終服務(wù)于不幸罹患癌癥的患者。