SCX-SPE結(jié)合UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS分析草烏中的四類二萜生物堿＊

周紅燕，徐 靜，崔議方，宋書祎，蘭先明，汪 冰，張加余＊＊

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 濟南 250300；2. 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 煙臺 264003；3. 山東省食品藥品檢驗研究院 濟南 250101）

烏頭類中藥是重要的傳統(tǒng)中藥，藥用歷史悠久，資源豐富，且臨床應(yīng)用廣泛。草烏始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，其味辛、苦，性熱，有大毒，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功效。2020 版《中國藥典》一部規(guī)定草烏（Radix Aconiti Kusnezoffii）為毛茛科植物北烏頭Aconitum kusnezoffiiReichb.的干燥塊根。其多于秋季北烏頭莖葉枯萎時采挖，除去須根和泥沙，干燥而成[2]。現(xiàn)代研究表明，草烏的主要藥理活性為鎮(zhèn)痛、抗炎、抗心律不齊、抗癌和強心作用[3-4]；在農(nóng)藥領(lǐng)域可用于毒殺害蟲、忌避、拒食、抑制昆蟲生長發(fā)育等[4]。草烏化學(xué)成分組成復(fù)雜，主要為二萜生物堿，其次還有揮發(fā)油[5]、氨基酸[6]、多糖[7-8]等化學(xué)成分。其中，二萜生物堿藥理活性顯著，具有較好的研究潛力與價值。因此，近年來專家學(xué)者們對二萜生物堿進行了集中研究，不僅從烏頭屬植物中發(fā)現(xiàn)了大量新化合物，而且還對二萜生物堿進行了歸納分類，將其按結(jié)構(gòu)類型分為C-18 型、C-19 型、C-20 型及雙二萜生物堿等[9]。研究發(fā)現(xiàn)，二萜生物堿是草烏中主要的藥理活性成分，具有抗菌抗炎、鎮(zhèn)痛麻醉、抗腫瘤等生物活性[10]。

目前，液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)在烏頭類生物堿鑒定方面已有較多報道[11-17]。例如，葉先文等[11]、葉協(xié)滔等[12]利用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)分別對烏頭屬植物川烏、草烏炮制前后的化學(xué)成分進行了比較，發(fā)現(xiàn)了生品及制品的主要成分差異。Yue 等[13]采用HPLCESI-MSn在附子中發(fā)現(xiàn)了117種化合物，并結(jié)合質(zhì)譜裂解途徑鑒定或推斷出了其中的111種化合物。雖然有關(guān)烏頭屬植物成分的研究較多，然而，由于部分二萜類生物堿含量低，且存在大量的同分異構(gòu)體，純化分離難度大，目前對草烏所含的二萜生物堿成分的結(jié)構(gòu)表征并不全面，在草烏中發(fā)現(xiàn)的二萜生物堿數(shù)量較少[18-27]。

二萜生物堿是草烏的重要成分，在中性或酸性條件以陽離子形式存在，能與陽離子交換樹脂的氫離子交換而吸附于樹脂上，從而與其他非離子性成分分離，達到精制純化草烏中二萜生物堿的目的。因此，本文采用具有分離機理明確、專屬性強、成本低、操作簡便等優(yōu)勢的強酸性陽離子交換樹脂固相萃取柱（SCX-SPE）分離純化草烏中的生物堿類成分，以期提高生物堿的提取效率，使一些低含量生物堿得以純化富集，從而大大增加LC-MS 的檢出容量；采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜（UHPLC-QExactive Orbitrap MS）技術(shù)對草烏中的二萜生物堿成分進行分析鑒定，以期為其全面的成分分析表征及其相關(guān)作用機制研究提供參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

R200D型十萬分之一電子分析天平：德國Sartorius公司產(chǎn)品；Thermo Fisher DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀與Q-Exactive 組合型四極桿Orbitrap 質(zhì)譜儀：美國Thermo Scientific 公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源（ESI）及Xcalibur 2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；TGL20M型高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；旋渦混合器QL-861：江蘇其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；KQ-250 DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

草烏為中國食品藥品檢定研究院民族藥室2019年中藥飲片抽檢工作中所收集，并經(jīng)中國食品藥品檢定研究院民族藥室鄭健研究員鑒定為毛茛科植物北烏頭（Aconitum kusnezoffiiReichb.）的干燥塊根。

苯甲酰新烏頭原堿（批號111785-201805，純度93.1%）；苯甲酰烏頭原堿（批號111794-201705，純度99.1%）；苯甲酰次烏頭原堿（批號111796-201705，純度98.6%）；烏頭雙酯型生物堿對照提取物（112029-201601，其中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的含量分別為31.8%、31.7%、30.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院。

屈臣氏蒸餾水：廣州屈臣氏食品飲料有限公司產(chǎn)品；氨水、乙腈：色譜純，天津康科德科技有限公司產(chǎn)品。SPE固相萃取柱：型號StrataX-C，平均粒徑33 μm，平均孔徑85 ?，Polymetric strong cation 200 mg/3 mL。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35℃；流動相為0.1%氨水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0-3 min，15% B；3-10 min，15-40% B；10-16 min，40-70% B；16-20 min，70-90%B；20-23 min，90-15% B；23-25 min，15% B；流速0.25 mL·min-1；進樣量1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；Full MS/dd-MS2掃描模式進行采集，一級掃描分辨率為70000，傅立葉高分辨掃描范圍m/z50-1200，歸一化碰撞能量（NCE）為20、40、60 eV；正離子檢測模式；毛細管溫度320℃；鞘氣流速35 Arb；輔助氣流速10 Arb；噴霧電壓3.8 kV。

1.4 對照品溶液制備

稱取烏頭雙酯型生物堿對照提取物以及3種單酯型生物堿（苯甲酰烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿）各5 mg，分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，即得各對照品母液。分別精密吸取各對照品母液0.1 mL，定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.01 mg·mL-1的草烏混合對照品溶液。

1.5 供試品溶液制備

1.5.1 生物堿類成分的提取

取草烏粉末（過三號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1%鹽酸-甲醇（7∶3）混合溶液25 mL，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz；水溫40℃以下）30 min，放冷，搖勻后，離心（4000 r/min）15 min，取上清液，即得。

1.5.2 SPE活化

用固相萃取洗脫裝置，負壓泵減壓洗脫，依次以甲醇、水各3 mL 及0.1 mol·L-1鹽酸溶液6 mL 對SCXSPE柱進行活化處理。

1.5.3 供試品溶液的制備

精密量取上述草烏生物堿提取液10 mL，分次加入已活化的強陽離子吸附樹脂固相萃取柱中，用0.1 mol·L-1鹽酸溶液6 mL分次洗滌，再分別用水、甲醇各6 mL 洗滌，棄去洗滌液，最后用氨水-無水乙醇（1∶6）混合溶液10 mL 洗脫，收集全部洗脫液（約9 mL），減壓回收溶劑（40℃以下）至干，殘渣精密加入含有0.1%甲酸的甲醇溶液3 mL溶解，濾過，即得。

1.6 數(shù)據(jù)采集處理

利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術(shù)采集數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Thermo Xcalibur Qual Browser 軟件，對數(shù)據(jù)進行色譜峰提取、質(zhì)譜碎片離子峰匹配。相關(guān)參數(shù)設(shè)定為C [0-70]、H [0-120]、O [0-40]、N [0-5]、環(huán)不飽和雙鍵數(shù)（RDB）[0-15]，質(zhì)量精度誤差在5×10-6以內(nèi)。

2 結(jié)果

本文采用SCX-SPE 結(jié)合UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 聯(lián)用技術(shù)對草烏中的二萜生物堿進行提取與分析，獲得了正離子模式下草烏藥材樣品溶液的基峰圖（Base Peak Chromatogram，BPC）（圖1）。結(jié)合精確分子量、多級質(zhì)譜裂解規(guī)律、對照品及ClogP值并參考相關(guān)文獻，對各質(zhì)譜峰進行歸屬。結(jié)果共從草烏提取物中鑒定出99 個二萜生物堿（見表1），其中包括C19 型二萜生物堿（78 個）和C20 型二萜生物堿（21個）。從二萜生物堿分類來看，則包括四類二萜生物堿，即雙酯型二萜生物堿（DDA）27 個，單酯型二萜生物堿（MDA）29 個，酰胺型二萜生物堿（ADA）40 個，多酯型二萜生物堿（PDA）2 個以及長鏈酯型二萜生物堿（LDA）1個。

表1 草烏中鑒定的的二萜生物堿類成分

續(xù)表

圖1 草烏樣品中二萜生物堿類成分的BPC圖

2.1 雙酯型二萜生物堿的鑒定

雙酯型二萜生物堿是草烏抗炎、鎮(zhèn)痛的主要藥效成分，對心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)具有較強的藥理作用，同時這類成分也具有極大的毒性。研究發(fā)現(xiàn)，C-14 位的苯甲?；?OCOC6H5）和C-8 位的乙?；?OCOCH3）在致毒方面起關(guān)鍵作用。

常見的雙酯型二萜生物堿有烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等。以對照品烏頭堿為例，對其質(zhì)譜裂解途經(jīng)和規(guī)律進行分析。在正離子檢測模式下，其二級質(zhì)譜圖觀察到m/z646 [M+H]+、m/z614 [M+H-CH3OH]+、m/z554[M+H-AcOH-CH3OH]+、m/z414 [M+H-C6H5COOHAcOH-CH3OH-H2O]+、m/z105 [C7H5O]+及m/z58 [C3H8N]+等碎片離子（見圖2）。研究結(jié)果表明，雙酯型二萜生物堿骨架上的取代基多為羥基、甲氧基、C8-乙?；14-苯甲?；?，在二級質(zhì)譜裂解過程中易脫掉這些取代基，從而造成18 Da（H2O）、32 Da（CH3OH）、60 Da（AcOH）和122 Da（BzOH）等質(zhì)量丟失，產(chǎn)生相應(yīng)的特征碎片離子。此外，碎片離子m/z105 [C7H5O]+為苯甲?；奶卣麟x子。

圖2 烏頭堿二級質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律圖

本文利用SCX-SPE 結(jié)合LC-MS 技術(shù)從草烏中共鑒定出27種雙酯型二萜類生物堿。其中，通過對照品比對，可將化合物M60、M71、M92 分別準確鑒別為新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿。此外，M55 和M60 具有相同的分子式C33H45NO11，推測M55 為新烏頭堿的同分異構(gòu)體。在M55 的二級質(zhì)譜圖中觀察到碎片離子m/z600 [M+H-CH3OH]+、m/z572 [M+H-CH3OH-CO]+、m/z512[M+H-CH3OH-CO-AcOH]+、m/z390 [M+H-CH3OHAcOH-CH3OCH3-C7H4O]+，未發(fā)現(xiàn)C3位羥基的丟失，參考文獻[20,27]及ClogP值（新烏頭堿ClogP值1.9076；10-羥基次烏頭堿ClogP值1.6321），最終推測M55 為10-羥基次烏頭堿。同樣地，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻報道[11,14,16,19-20,27-28]，其他23個雙酯型生物堿也被逐一鑒定。

2.2 單酯型二萜生物堿的鑒定

單酯型二萜生物堿主要表現(xiàn)在C-14 位上的羥基被酯化，多數(shù)為苯甲酰基，少數(shù)為乙?；蚬鹌；Ｖ饕沓煞譃楸郊柞躅^堿、苯甲酰新烏頭堿和苯甲酰次烏頭堿等。

本文從草烏中共鑒定出29 個單酯型二萜類生物堿。通過對照品比對，化合物M28、M49和M84可被準確鑒定為苯甲酰中烏頭堿、苯甲酰烏頭堿和苯甲酰次烏頭堿。此處對苯甲酰烏頭堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律進行了細致分析，以便于其他單酯型二萜生物堿的結(jié)構(gòu)鑒定。在正離子檢測模式下，M49 的二級質(zhì)譜圖中可觀察到碎片離子m/z604 [M+H]+、m/z554 [M+H-H2OCH3OH]+、m/z416 [M+H-C7H6O-2CH3OH-H2O]+、m/z384 [M+H-C7H6O-3CH3OH-H2O]+、m/z105 [C7H5O]+和m/z58 [C3H8N]+等，見圖3。結(jié)合其他參考文獻發(fā)現(xiàn)，單酯型二萜生物堿容易脫去失去C6H5COOH 或AcOH、H2O、CH3OH 等中性分子，形成[M+H-122]+（[M+H-106]+）或[M+H-60]+、[M+H-18]+、[M+H-32]+、[M+H-50]+、[M+H-64]+、[M+H-82]+等碎片離子[17]。

圖3 苯甲酰烏頭堿的二級質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律圖

在正離子模式下，檢測到M3、M6、M11、M14 具有相同的分子式，且在此4 個化合物的二級質(zhì)譜圖中均檢測到m/z328 [M+H-AcOH]+、m/z310 [M+H-AcOHH2O]+、m/z282 [M+H-AcOH-H2O-CO]+等碎片離子，表明化合物的結(jié)構(gòu)中含有乙?；?，符合C-14 位為乙酰基的單酯型生物堿的裂解規(guī)律，最終將他們鑒定為關(guān)附Y(jié) 素及其同分異構(gòu)體。同樣地，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和單酯型二萜生物堿的裂解規(guī)律，結(jié)合文獻報道[17,19,22-23,29-30]，其他22 個單酯型二萜類生物堿也被逐一鑒定。

2.3 醇胺型二萜生物堿的鑒定

醇胺型二萜生物堿是草烏中主要的無毒活性成分。采用SCX-SPE 結(jié)合LC-MS 技術(shù)，在草烏中共鑒別出40個醇胺型二萜生物堿，主要代表成分為烏頭原堿、尼奧寧、牛扁堿等。

醇胺型二萜生物堿容易失去CH3OH、H2O和CO等中性分子。M2 的二級質(zhì)譜圖可觀察到m/z486 [M+H]+、m/z436 [M+H-CH3OH-H2O]+、m/z354 [M+H-2H2O-3CH3OH]+等碎片離子，見圖4，結(jié)合參考文獻，初步鑒定M2為新烏頭原堿。化合物M12、M17和M25的色譜峰相對較高，含量較高，分子式相同，推測它們互為同分異構(gòu)體，且主要表現(xiàn)在甲氧基和羥基的位置異構(gòu)[19]。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合參考文獻[11]及ClogP值，推測它們分別為10-羥基尼奧寧（ClogP值-1.0020）、弗斯生（ClogP值-0.5706）、附子靈（ClogP值-0.5346）。附子靈又名森布星C，在其二級質(zhì)譜圖中觀察到m/z422 [M+H-CH3OH]+、m/z404 [M+H-CH3OH-H2O]+、m/z344 [M+H-2CH3OH-CH3OCH3]+等離子，表明其結(jié)構(gòu)上具有甲氧基、羥基及甲基氧基等基團。

圖4 新烏頭原堿的二級質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律圖

同樣地，其他醇胺型二萜生物堿化合物具有類似的裂解規(guī)律，根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合文獻報道，其他38個醇胺型二萜生物堿逐一被鑒定。

2.4 長鏈酯型生物堿的鑒定

長鏈酯型生物堿在結(jié)構(gòu)上和雙酯型生物堿類似，僅有的區(qū)別為C8位乙酰基被脂肪?；〈?，在裂解過程中，長鏈酯型生物堿首先脫去脂肪酸，進一步的裂解途徑與相應(yīng)的雙酯型生物堿相同。

在正離子模式下，M99 的準分子離子峰為m/z852[M+H]+，二級裂解碎片為m/z572 [M+H-C18H32O2]+、m/z540 [M+H-C18H32O2-CH3OH]+、m/z512 [M+H-C18H32O2-CO]+、m/z374 [M+H-C18H32O2-C6H5COOH-CH3OH-CO2]+、m/z105 [C7H5O]+等，見圖5。根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合文獻報道[20]，推測M99為8-亞油酸殘基-苯甲酰新烏頭堿。

圖5 8-亞油酸殘基-苯甲酰新烏頭堿的二級質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律圖

3 討論

中藥成分復(fù)雜，傳統(tǒng)的色譜法雖然能夠?qū)⑵浞蛛x開來，但無法準確地進行定性和結(jié)構(gòu)分析，對于未知成分的結(jié)構(gòu)鑒定十分困難。固相萃取技術(shù)是一種樣品前處理新技術(shù)，相比傳統(tǒng)的液液萃取，固相萃取具有操作更加方便、除雜效果更好、目標成分回收率更高等優(yōu)點。本文利用SCX-SPE 分析方法，選用氨水-無水乙醇（1∶6）混合溶液為洗脫液，有效消除了草烏中生物堿測定時的陰性干擾，顯著改善了方法的專屬性、靈敏度、重復(fù)性和準確度，快速實現(xiàn)了對烏頭屬植物草烏中二萜生物堿的富集純化。此外，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥成分分析研究發(fā)揮了巨大作用，其將液相色譜的高分離度與質(zhì)譜高選擇性、高靈敏度和能夠提供物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的特性進行優(yōu)勢互補，具有分析范圍廣、分離能力強、定性分析結(jié)果可靠、自動化程度高等優(yōu)點。同時能夠得到化合物保留時間、分子量及特征二級結(jié)構(gòu)碎片等豐富的信息。本文利用UHPLC-QExactive-Orbitrap MS 技術(shù)，對草烏二萜生物堿成分進行了全面表征，并對其進行了快速、準確地定性研究。結(jié)果從草烏提取物中鑒定出99個二萜生物堿類成分，包括27 個DDA，29 個MDA，40 個ADA，2 個PDA 以及1個LDA。

研究發(fā)現(xiàn)草烏BPC 圖中某些化合物的色譜峰較高，響應(yīng)值較高，相對含量可能較多，且大多為毒性較強的雙酯型生物堿（如烏頭堿、次烏頭堿、N-去甲基次烏頭堿等）及少數(shù)醇胺型生物堿（附子靈、尼奧寧、宋果靈等）。本研究將SCX-SPE 與UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS/MS 結(jié)合起來，不僅檢測到在烏頭屬植物中具有代表性的二萜生物堿（如烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿等），而且發(fā)現(xiàn)了一些生物活性較好低含量成分（如3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿等）。其中，3-乙酰烏頭堿屬于三酯型生物堿，為烏頭堿的簡單衍生物，具有優(yōu)良的鎮(zhèn)痛活性，已成為非成癮性鎮(zhèn)痛藥應(yīng)用于臨床。研究表明，3-乙酰烏頭堿還具有抗腫瘤活性，可抑制人肝癌細胞的生長[31]。去氧烏頭堿具有抗炎陣痛和解熱作用，且抗炎和鎮(zhèn)痛效果顯著高于3-乙酰烏頭堿[32]。關(guān)附甲素具有抗氧化和抗房顫作用，可作為抗心律失常藥物應(yīng)用于臨床[33]。此外，本研究還檢測到了草烏所含的一些微量生物堿（如草烏甲素）及部分生物堿的微量同分異構(gòu)體（如關(guān)附Y(jié) 素，檢測到包括其在內(nèi)的4 個同分異構(gòu)體）。由于同分異構(gòu)體僅通過二級碎片離子較難鑒定出其準確結(jié)構(gòu)，后續(xù)會結(jié)合核磁共振技術(shù)繼續(xù)對這些同分異構(gòu)體進行鑒定。本研究還發(fā)現(xiàn)了一種長鏈酯型生物堿8-亞油酸殘基-苯甲酰新烏頭原堿。但是，本研究發(fā)現(xiàn)的該類成分數(shù)量很少，可能原因是一方面它們在提取過程中可能會發(fā)生水解脫去一分子的脂肪酸碎片，另一方面可能是由于該類成分極性小在色譜柱上難以被洗脫下來而無法被檢測到。

生草烏毒性較大，目前相關(guān)的開發(fā)利用相對較少，臨床上通常采用炮制及配伍的方法達到減毒增效的目的。充分研究草烏中的化學(xué)成分，有利于豐富烏頭屬植物的化學(xué)成分譜系，還有利于為藥物研發(fā)提供活性先導(dǎo)化合物進而指導(dǎo)新藥的研究與開發(fā)。在今后的工作中可以著重對生草烏及制草烏中新的活性成分和多成分、多靶點、多療效進行深入研究，為草烏藥材的臨床應(yīng)用提供更充分的科學(xué)依據(jù)。