電針次髎、耳甲調節(jié)大鼠胃內壓和心率變異性效應方向一致性的實驗研究＊

詹 錚，潘彥宏，姜勁峰

（南京中醫(yī)藥大學針藥結合教育部重點實驗室 南京 210023）

迷走/副交感神經支配范圍廣泛，亦參與調節(jié)人類記憶、認知、情感和情緒功能[1-4]，其活性高低甚至可作為預測和評價人類生理和心理健康的重要指標[5-6]，因此，調節(jié)迷走神經張力具有治療疾病的潛力。迷走神經體表唯一分支（迷走神經耳支）支配的耳甲作為直接調節(jié)迷走神經的體表接口[7]，其迷走神經調控效應已被用于癲癇[8]、抑郁癥[9]、胃腸動力障礙[10]、膿毒血癥[11]和糖尿病[12]等疾病的治療。機體是否還存在調節(jié)迷走神經張力的其它腧穴（部位）？

自迷走神經參與電針足三里拮抗膿毒血癥全身性炎癥反應的機制[13]發(fā)現以來，足三里已被視為除耳甲外調節(jié)迷走神經的另一重要體表接口。最新研究顯示，四肢腧穴（足三里和手三里）的迷走神經調節(jié)效應依賴于腧穴深部筋膜組織中PROKR2 神經元分布和電流刺激強度[14-15]。換言之，臨床上能否準確地把握針刺（電針）足三里的深度、組織解剖層次和刺激強度，可能會影響其迷走神經調節(jié)效應的發(fā)揮，甚至可能因刺激強度的差異而產生效應方向迥異的交感神經調節(jié)效應。此外，在迷走神經調節(jié)效應（例如胃內壓）的腧穴配伍研究[16]中，單獨電針下肢腧穴上巨虛或上肢腧穴曲池均升高胃內壓，但兩者聯合電針卻并未出現1+1>1的協同增效作用。四肢腧穴在臨床應用上是否均存在這些問題呢？

基于針灸臨床觀察，本團隊于前期理論研究中提出“八髎與外耳均可作為刺激迷走神經的體表接口”的觀點[17]。隨后的實驗研究亦表明，迷走神經參與了電針次髎拮抗內毒素血癥的全身性炎癥反應[18]。結合“骶神經傳入-迷走神經傳出”的神經通路介導骶神經刺激（SNS）顯著改善潰瘍性結腸炎癥狀[19]的研究前沿，以及電針中髎、會陽改善尿失禁[20]、慢性前列腺炎/盆腔疼痛綜合征[21]等局部內臟功能的臨床研究，提示以次髎為代表的八髎穴區(qū)域很可能是靶向迷走/副交感神經的另一重要體表部位，能否作為迷走神經調節(jié)效應腧穴配伍領域除四肢腧穴外新的腧穴配伍選擇和補充呢？

基于此，本研究選取耳甲電針作為參照，以胃內壓和心率變異性（Heart rate variability，HRV）作為指標，進一步明確電針次髎調控迷走神經的效應方向，并擬以兩者聯合電針是否具有協同增效作用來進一步闡述次髎調控迷走神經的效應方向，以期為臨床迷走神經調控提供新的腧穴配伍選擇。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

選取健康成年雄性SD 大鼠24 只（體質量220-250 g），由浙江省醫(yī)學科學院提供，動物生產許可證編號：SCXK（浙）2020-0002，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心，保持室溫25℃，相對濕度50%-70%，自由獲取飼料和水。動物適應性飼養(yǎng)1 周后，將24 只雄性SD 大鼠按體質量由高到低依次編號1-24，再配以隨機數字表，隨機分為耳甲組、次髎組和“耳甲+次髎”組，每組8 只。實驗過程嚴格遵循“3R”原則和科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》規(guī)定。本實驗通過了南京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會的倫理審查（批號：012071001617）。具體實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程示意圖

1.2 主要試劑和儀器

烏拉坦（氨基甲酸乙酯，上海麥克林生化科技有限公司）；韓氏電針儀（HANS-200A，南京濟生醫(yī)療科技有限公司）；多道生理信號采集系統(tǒng)（RM6240，成都儀器廠）；壓力換能器（YPJ01，成都儀器廠）；恒溫板（ST-1 型，成都儀器廠）；生物信號采集分析系統(tǒng)（Microl401-3，CED，英國）；無菌針灸針（0.35 mm×25 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司）；自制胃內置球囊測壓探頭。

1.3 實驗方法

實驗前大鼠禁食12 h，允許自由飲水。腹腔注射20%烏拉坦（0.5 mL·100 g-1）麻醉后，剃凈其上腹部毛并常規(guī)消毒，再將其仰臥位放于恒溫板（37±1）℃上。

1.3.1 胃內壓檢測

采用囊內壓實驗法檢測胃內壓[22]：①于大鼠劍突下1 cm、腹部正中線左側肋緣處，作長0.5 cm 左右的切口。用玻璃分針小心地挑起十二指腸，在其距幽門0.5-1 cm 處用手術剪刀對十二指腸作約0.2 cm 長的縱向切口；②把連接多道生理信號采集系統(tǒng)的壓力換能器前端的球囊從切口處緩緩置入，并沿十二指腸向上輕推，直到球囊準確置入胃竇區(qū)，再縫合手術切口、固定導管，并用無菌紗布覆蓋切口；③將約0.1 mL 的水注入球囊，緩慢調節(jié)囊內水容量使其基礎壓力保持在0.8 kPa 左右。當胃內壓波形圖維持穩(wěn)定狀態(tài)30 min以上時，記錄囊內1 min 的壓力值作為胃內壓基線值。穩(wěn)定狀態(tài)下的胃內壓波形圖見圖2。

圖2 正常大鼠穩(wěn)定狀態(tài)下的胃內壓波形圖

1.3.2 HRV檢測

采用Ⅱ導聯心電圖模式檢測HRV[23]：①無菌針灸針分別刺入大鼠的右上肢、右下肢和左下肢皮下，并依次連接NEG、EARTH 和POS 電極；②打開生物信號采集分析系統(tǒng)，在Lab Chart 計算機軟件上輸入參數[濾波：2 k·s-1，量程：5 mV，低通道：500 Hz；高頻（HF）：0.75-2.5 Hz，低頻（LF）：0.2-0.75 Hz，極低頻（VLF）：0-0.2 Hz]，在記錄胃內壓的同時，同步記錄HRV（HF、LF、VLF、LF/HF）。

1.4 干預方法

于大鼠左側耳甲腔和耳甲艇的中心區(qū)域，針灸針分別沿皮刺入約6 mm[24]；大鼠只有3對骶后孔，其次髎穴/中髎穴位于S2-S3 棘突間隙正中偏上旁開5-10 mm（第2 骶后孔）處，針灸針直刺約15-20 mm[25]，左右各一針。因大鼠需在仰臥位行球囊置入術以檢測胃內壓，故預先將針灸針刺入次髎[26]。連接韓氏電針儀，30 Hz，2 mA，波寬0.2 ms±30%，連續(xù)波[23]，電針2 min。具體電針操作見圖3。

圖3 耳甲、次髎定位及電針操作示意圖

1.5 數據采集和分析

以30 s為一個觀察單位導出數據并分析電針干預前和干預時胃內壓和HRV 的變化，用變化倍率（變化倍率=電針干預時數值/干預前基線值×100%）分析不同干預方式效應的差異[27]。

1.6 統(tǒng)計與作圖

采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism 8 軟件作圖。計量資料以均數±標準誤（xˉ±SEM）表示，數據均進行正態(tài)分布檢驗。組內數據統(tǒng)計分析，若服從正態(tài)分布，則采用配對t檢驗，否則采用非參數檢驗；組間數據統(tǒng)計分析，若服從正態(tài)分布且方差齊，則采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，否則采用非參數檢驗。P≤0.05 時，認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 電針各穴位對大鼠胃內壓的影響

與電針前相比，各組胃內壓在電針干預期間均顯著升高（見圖4）。耳甲組：電針干預可顯著升高胃內壓，尤其在干預的30-60 s（P<0.05）、60-90 s 期間（P<0.05）（見圖4A）。次髎組：電針干預可顯著升高胃內壓，尤其在干預的60-90 s 期間（P<0.05）（見圖4A）?！岸?次髎”組：電針干預可顯著升高胃內壓，尤其在干預的60-90 s（P<0.01）、90-120 s 期間（P<0.05）（見圖4A）。

圖4 電針各穴位對大鼠胃內壓的影響（xˉ±SEM，n=8）

胃內壓變化倍率：“耳甲+次髎”組的胃內壓變化倍率，在電針干預的30-60 s 期間開始高于同期耳甲組、次髎組，并在干預的60-90 s（P<0.01）、90-120 s 期間（P<0.01）顯著高于同期耳甲組，在干預的60-90 s（P<0.05）、90-120 s 期間（P<0.05）顯著高于同期次髎組。耳甲電針干預升高胃內壓起效更快，但在電針后期，“耳甲+次髎”電針干預的胃內壓比耳甲電針、次髎電針的胃內壓更高，且“耳甲+次髎”電針干預的胃內壓增幅更高、增加更快（見圖4A、4C）。

2.2 電針各穴位對大鼠HRV的影響

耳甲組：與電針前相比，耳甲電針干預的HF 在干預全程均顯著升高（P<0.01，P<0.05，P<0.01，P<0.05）、LF 在干預全程均顯著升高（P<0.01，P<0.01，P<0.05，P<0.05）、VLF 在干預全程均顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）。耳甲電針干預可顯著降低LF/HF，尤其在干預的0-30 s（P<0.01）、30-60 s（P<0.05）、60-90 s期間（P<0.05）（見圖5A、5B、5C、5D）。

圖5 電針各穴位對大鼠HRV的影響（xˉ±SEM，n=8）

次髎組：與電針前相比，次髎電針干預的HF 在干預全程均顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）、LF 在干預全程均顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）、VLF 在干預全程均顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）。次髎電針干預可顯著降低LF/HF，尤其在干預的0-30 s 期間（P<0.05）（見圖5A、5B、5C、5D）。

“耳甲+次髎”組：與電針前相比，“耳甲+次髎”電針干預的HF在干預全程均顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）、LF 在干預全程均顯著升高（P<0.001，P<0.05，P<0.01，P<0.01）、VLF 在干預全程均顯著升高（P<0.05，P<0.01，P<0.05，P<0.05）。“耳甲+次髎”電針干預可顯著降低LF/HF，尤其在干預的30-60 s（P<0.05）、60-90 s（P<0.01）、90-120 s 期間（P<0.01）（見圖5A、5B、5C、5D）。

LF/HF變化倍率：“耳甲+次髎”組的LF/HF變化倍率，在電針干預的30-60 s 期間開始低于同期耳甲組、次髎組，并在干預的90-120 s 期間（P<0.05）顯著低于同期耳甲組，在干預的60-90 s（P<0.05）、90-120 s 期間（P<0.05）顯著低于同期次髎組。在電針后期，耳甲組、次髎組的LF/HF 略有升高，但仍明顯低于電針干預前，而“耳甲+次髎”組的LF/HF 則持續(xù)降低，且降幅更高、降低更快（見圖5D、5E）。

3 討論

自主神經系統(tǒng)（Autonomic nervous system，ANS）在針刺（電針）調節(jié)機體功能穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用[28]。研究表明，特異性地調節(jié)迷走神經，能獲得對神經-內分泌-免疫網絡可靠而又穩(wěn)定的調節(jié)能力[29]。目前，侵入式迷走神經刺激術（VNS）因存在創(chuàng)傷和副作用以及高成本等弊端，導致其在臨床廣泛開展受到限制。針刺（電針）作為一種操作簡便且安全的ANS 調節(jié)手段[30]，可輕易避免VNS 的諸多弊端，具有天然優(yōu)勢。由于針刺（電針）調節(jié)ANS 的效應方向與其所刺激的腧穴密切相關，即存在迷走效應和交感效應兩種效應方向。因此，明確腧穴的具體效應方向顯得尤為重要。

HRV 常用于定量評估人和動物的ANS 功能，其中，HF 反映迷走神經張力，LF 和VLF 代表交感神經活性，LF/HF 則反映交感-迷走神經平衡移動[31-32]。鑒于迷走神經分支在胃部分布豐富且胃運動由其主導[33-34]，胃內壓的增減可具體量化和反映迷走神經調節(jié)效應的強弱，故選擇胃內壓和HRV作為評估迷走神經調控效應的指標。

本研究中，電針次髎或耳甲，HF 升高，提示迷走神經張力增加。由于胃運動主要由迷走神經支配，因此，胃內壓的升高亦印證了迷走神經張力增加的結果。這表明，次髎和耳甲均可作為激活迷走神經（副交感神經）的體表接口。此外，與部分研究[10]未將交感神經活性納入針刺（電針）對ANS 影響的觀察指標不同，本研究中LF 和VLF 升高，提示電針次髎或耳甲亦提高了交感神經活性。然而，LF/HF比值卻降低，表明交感-迷走神經平衡向迷走神經方向移動，提示電針次髎或耳甲對ANS 的調節(jié)是以大幅度地提高迷走神經張力、同時小幅度地提高交感神經活性的方式進行。換言之，電針次髎或耳甲以迷走神經作為調控ANS 的入口，通過上調調定點（Set point）水平來重建交感-迷走神經平衡，而非通過單純地削弱一方或增強一方來實現，表明該調控效應是一種基于整體調節(jié)的優(yōu)勢迷走神經調控效應。

迷走效應主要由耳甲（迷走神經耳支）和以足三里（坐骨神經）為代表的下肢腧穴先將感覺信息上傳至中樞NTS 整合，再由迷走神經背核（DMV）下行傳遞調節(jié)信息，最后由增強的傳出迷走神經末梢釋放神經遞質（乙酰膽堿，Ach）作用于相應靶器官（胃腸等）而觸發(fā)（膽堿能抗炎通路或胃腸動力調節(jié)效應）[35]。解剖學研究表明，骶內臟神經、骶前神經和盆內臟神經共同構成盆叢[36-37]。其中，由S2-S4副交感纖維在骶孔構成的盆內臟神經具有副交感屬性；由于部分S2-S3 軀體纖維常伴行盆內臟神經，因此，骶叢神經的傳出屬性尚存在爭議[38-39]，但后續(xù)一系列研究仍傾向于骶叢具有副交感屬性[40]。從八髎穴的臨床應用來看，針刺（電針）八髎穴常用于包括潰瘍性結腸炎[41-42]、盆腔炎[43-44]等多種炎癥性疾病以及女性圍絕經期潮熱、汗出[17]等疾病的治療，提示臨近骶叢的八髎穴區(qū)可能具有副交感屬性。離斷迷走神經，電針次髎拮抗內毒素血癥的抗炎效應明顯減弱，全身炎癥因子水平顯著上升，說明迷走神經參與了電針次髎的全身性抗炎效應[18]；另一項研究顯示，SNS 導致潰瘍性結腸炎大鼠NTS中c-fos表達增加，并顯著降低了全身炎癥因子水平，但離斷迷走神經后，SNS 抗炎效應消失[19]。故與VNS 作用途徑相似，電針次髎可能亦通過“脊髓上行傳入——中樞整合——迷走神經傳出——增強的迷走效應輸出”途徑，產生全身性迷走神經調控效應[18-19]。本研究中，由于骶神經并不支配上消化道[45]，但迷走神經張力（HF）增加，而胃運動由迷走神經主導，故胃內壓增高可能是通過脊髓上中樞通路激動迷走神經導致，這也是對上述次髎的全身性迷走神經調控效應實驗的進一步補充。不過，電針次髎在升高胃內壓的時效性上要遲于電針耳甲，即次髎電針60 s 后胃內壓才明顯升高。其原因可能是：電針次髎需通過脊髓上中樞才可以激活迷走神經，而電針耳甲具有直接作用于脊髓上中樞的“捷徑”優(yōu)勢[17]。

此外，本研究顯示，在聯合電針的后期，與單獨電針次髎或耳甲相比：胃內壓變化倍率增加，提示胃內壓持續(xù)增高且增幅更大；LF/HF 變化倍率降低，提示LF/HF持續(xù)降低且降幅更大。這表明在迷走神經調控方面，次髎與耳甲聯合電針具有顯著的協同增效作用，即1+1>1。兩穴同用的協同增效作用，也從側面進一步驗證了次髎與耳甲調節(jié)迷走神經（副交感神經）效應方向基本一致的結論。

迷走神經張力降低、交感神經活性增加所致的ANS 失衡是眾多疾病的核心病理環(huán)節(jié)[46]，明確腧穴調節(jié)ANS 的具體效應方向對于疾病的治療顯得格外重要。目前，重建ANS 平衡取穴多以腹部腧穴、耳甲和四肢腧穴為主。腹部腧穴以天樞穴為代表，只能激活交感效應，且只有高強度而非低強度電針才能將其激活，體現出一定的強度依賴性[15]。耳甲迷走神經調節(jié)效應雖顯著，但其效應可能受到迷走神經耳支分布區(qū)域狹小的限制。四肢腧穴中，觸發(fā)交感效應，腧穴取穴上肢多于下肢，以內關穴（正中神經）為代表，可抑制交感神經異常放電；觸發(fā)迷走效應，腧穴取穴下肢多于上肢，以足三里（坐骨神經）為代表[35]。最新研究顯示，足三里的迷走效應受到腧穴深層筋膜組織中PROKR2 神經元分布的影響，亦具有明顯的刺激強度依賴性，即不同電流強度分別激活交感、迷走神經環(huán)路，這對針刺（電針）的深度、組織解剖層次和刺激強度提出了較高的要求[14-15]。

八髎穴受解剖位置影響，其主治病種多集中于泌尿生殖系統(tǒng)和肛腸系統(tǒng)疾病[47]。本研究通過進一步明確次髎的全身性迷走神經調控效應，為八髎穴廣泛地用于特異性迷走神經調控提供了新的實驗證據，從而在一定程度上拓寬了八髎穴的適用病種。此外，在迷走神經調節(jié)效應的腧穴配伍研究[16]中，上肢腧穴（曲池）與下肢腧穴（上巨虛）配伍，在升高胃內壓方面并未出現1+1>1 的協同增效作用。而次髎和耳甲聯合電針產生1+1>1 的協同增效作用，為針刺（電針）介入相關疾病提供了除四肢腧穴外新的腧穴配伍選擇。

本研究亦有不足之處，比如只研究了單一電流強度下電針次髎對ANS 的影響，那么其是否也存在強度依賴性呢？此外，本研究于生理狀態(tài)下的大鼠身上進行，其調控效應能否適用于病理狀態(tài)下的大鼠呢？都需要進一步探索和明確。