基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究溫膽湯治療失眠潛在靶點(diǎn)＊

李 莉，劉 茹，何 晶，陳 云，郭 娟，紀(jì) 可，劉 玲＊＊

（1. 湖北省中醫(yī)院 武漢 430061；2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 武漢 430061；3. 湖北省中醫(yī)藥研究院 武漢 430074）

失眠（Insomnia）是常見的睡眠障礙現(xiàn)象，長(zhǎng)期失眠會(huì)影響生活、工作或造成惡性事故的發(fā)生[1]。失眠的發(fā)病機(jī)制較多，中醫(yī)將失眠的病因歸為郁、火、虛，并與心、肝、腎器官相關(guān)[2]。中醫(yī)上失眠被分為七種類型[3]，根據(jù)不同類型的病癥，皆有對(duì)應(yīng)的中醫(yī)湯劑治療，可見中醫(yī)藥治療失眠療效顯著[4-9]。失眠的非中醫(yī)治療方法為藥物聯(lián)合治療和非藥物治療[10-12]。藥物聯(lián)合治療常使用處方藥，所有處方藥都有副作用，僅能短期使用[13-15]。因此中醫(yī)藥在失眠治療中具有重要意義。

本研究中溫膽湯由半夏、竹茹、麩炒枳實(shí)、陳皮、炙甘草及茯苓6 種中藥組成，每種中藥均具有多種藥理作用[16-21]。臨床研究發(fā)現(xiàn)溫膽湯加味治療可改善睡眠質(zhì)量[22-24]。臨床數(shù)據(jù)顯示十味溫膽湯口服治療失眠患者，治愈20例，好轉(zhuǎn)166例[25]。溫膽湯已在臨床失眠研究中取得了大量的驗(yàn)證，但其具體的作用靶點(diǎn)尚未被揭示。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以生物學(xué)和藥學(xué)為理論基礎(chǔ)，對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行新藥設(shè)計(jì)和靶點(diǎn)分析的新學(xué)科[26-27]。復(fù)雜疾病的發(fā)生和發(fā)展涉及到機(jī)體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中多個(gè)基因和信號(hào)通路，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以其“多基因，多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)與復(fù)雜疾病的治療理念相契合，通過(guò)闡述“藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，進(jìn)行藥物作用機(jī)制研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略具有整體性和系統(tǒng)性的特點(diǎn)，其與中藥的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用原理相同，在中藥的研究中得到了廣泛應(yīng)用和突破[28-31]。本文將參考網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南[32]，建立溫膽湯-失眠-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，尋找溫膽湯在失眠癥中的核心靶點(diǎn)，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為溫膽湯及中藥的失眠靶向治療提供思路和方向。

1 材料

1.1 試劑

TRIzol（Ambion，15596026）來(lái)自上海賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，SYBR FAST qPCR Master Mix（KAPA Biosystems，KM4101）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，RR037Q）來(lái)自武漢友名生物技術(shù)有限公司，氯仿（10006818）、異丙醇（80109218）、無(wú)水乙醇（10009218）、二甲苯（10023418）來(lái)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，伊紅（E8090）、中性樹脂（G8590）及蘇木素（G1140）來(lái)自北京Solarbio，艾司唑侖片來(lái)自襄陽(yáng)市華中藥業(yè)股份有限公司。裂解液和BCA 試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器

PCR 儀（柏恒，GE48527），熒光定量PCR 儀（Bio-Rad，CFX-Connect 96），高速冷凍離心機(jī)（Icen-24R）和超微量分光光度計(jì)（Nano-300）來(lái)自杭州奧盛，微型渦旋混合儀（MTV-1），實(shí)驗(yàn)室超純水器（吉百瑞，ROS-S15），旋轉(zhuǎn)型睡眠剝奪儀（自制），石蠟切片機(jī)（RM2235），顯微鏡（DM1000）來(lái)自徠卡顯微系統(tǒng)有限公司。

1.3 動(dòng)物

30 只雄性KM 小鼠，SPF 級(jí)，倫理審查許可證號(hào)：SYXK（鄂）2018-0104，4-5 周齡，體質(zhì)量20-25 g，購(gòu)于三峽大學(xué)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合湖北省動(dòng)物管理委員會(huì)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理證》相關(guān)規(guī)定。

2 方法

2.1 TCMSP中藥成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)分析

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP[33]，http://tcmspw-e.com）進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，收集溫膽湯成分中活性成分及作用靶點(diǎn)。對(duì)比現(xiàn)有的研究方法[34-35]，選擇人體口服生物利用度≥30%，藥物相似性≥0.18，腸上皮Caco-2細(xì)胞滲透性>0 nm?s-1，藥物半衰期≥4 h，氫鍵供體數(shù)目≤5 個(gè)，氫鍵受體數(shù)目≤10 為篩選條件。在UniProt 知識(shí)庫(kù)（UniProt Knowledgebase，UniProt，https://www.uniprot.org/）中收集篩選后靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因。

2.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)

使用基因/蛋白質(zhì)相互作用平臺(tái)（STRING[36]，https://cn.string-db.org/）分析靶點(diǎn)之間蛋白互作關(guān)系。統(tǒng)計(jì)所包含的節(jié)點(diǎn)、邊數(shù)量、平均節(jié)點(diǎn)度、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein-interaction-network，PPI）富集P值。

2.3 基因本體功能分析

通過(guò)生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery，DAVID，https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）對(duì)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)蛋白進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）分析，描述相應(yīng)的生物學(xué)過(guò)程（Biological process，BP）、細(xì)胞定位（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF），將P≤0.05 設(shè)定為顯著性基因富集的臨界值，使用R軟件進(jìn)行作圖。

2.4 京都基因與基因組百科全書通路分析

通過(guò)KEGG（https://www.genome.jp/kegg/）分析溫膽湯靶點(diǎn)參與的重要通路，以Homo sapiens 為物種和P≤0.05選擇核心通路。

2.5 溫膽湯治療失眠有效靶點(diǎn)篩選

利用人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（Human gene database，GeneCards，https://www.genecards.org/）查找失眠相關(guān)靶點(diǎn)，通過(guò)Venny軟件繪制失眠靶點(diǎn)和溫膽湯靶點(diǎn)交集，得到溫膽湯治療失眠有效靶點(diǎn)。

2.6 核心基因分析

應(yīng)用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)分析圖并分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)，以≥2 倍度的中位數(shù)、≥1 倍的介數(shù)中心度和接近中心性的中位數(shù)進(jìn)行篩選，此3 個(gè)數(shù)值越大表明靶點(diǎn)的重要性越大[37-39]。其中節(jié)點(diǎn)顏色越深代表度越大。

2.7 溫膽湯制備

溫膽湯組成：法半夏6 g、竹茹6 g、麩炒枳實(shí)6 g、陳皮9 g、灸甘草3 g、茯苓4.5 g、每劑含生藥34.5 g。一煎加藥材量8 倍的水，沸騰后煎40 min，過(guò)濾取汁，二煎加藥材量6 倍的水，沸騰后煎30 min，過(guò)濾二煎所得濾液，混合后濃縮成1∶1藥液，溫膽湯低劑量組含生藥0.5 g·mL-1，高劑量組含生藥2 g·mL-1，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩１緦?shí)驗(yàn)所用中藥材均來(lái)自湖北辰美中藥有限公司。中藥材批號(hào)：法半夏（2019910203）、竹茹（202001017）、枳實(shí)（2019912101）、陳皮（202001022）、甘草（202001021）、茯苓（2020912102），中藥材鑒定人：胡銀橋，熊燕。溫膽湯處方鑒定人：廖華容。

2.8 失眠小鼠模型構(gòu)建

通過(guò)改良版水平轉(zhuǎn)盤睡眠剝奪法構(gòu)建失眠小鼠模型。使用亞克力塑料板構(gòu)建睡眠剝奪箱（長(zhǎng)：110 cm，寬：60 cm，高：40 cm），其底部固定有15 個(gè)圓柱形平臺(tái)（直徑：6.5 cm；高：8 cm），保持10 cm 縱向間距，13 cm橫向間距，注入23-25℃水至平臺(tái)下1 cm 處，保持水溫。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 天后，將24 只待造模小鼠放置于睡眠箱平臺(tái)上進(jìn)行站立訓(xùn)練，當(dāng)其即將進(jìn)入睡眠時(shí)，由于肌肉松弛垂頭觸水或落入水中而驚醒，使其被迫保持清醒站立，早晚各拿出休息1 次，每次30 min，訓(xùn)練2周。以體質(zhì)量、毛發(fā)、精神狀態(tài)、飲食、糞便來(lái)進(jìn)行睡眠剝奪的效應(yīng)評(píng)價(jià)，每2天進(jìn)行1次效應(yīng)評(píng)價(jià)。

2.9 動(dòng)物分組

隨機(jī)挑選6 只作為對(duì)照組，剩余24 只構(gòu)建睡眠剝奪模型，并隨機(jī)分為4組：模型組、溫膽湯低濃度組（含生藥0.5 g·mL-1）、高濃度組（含生藥2 g·mL-1）、艾司唑侖片組（0.15 mg·kg-1），每組6 只。于模型開始構(gòu)建的第15天開始灌胃，每天1次，共7天，低、高劑量組及艾司唑侖片組分別灌胃0.5 mL 相應(yīng)濃度的溫膽湯劑或艾司唑侖片溶液，對(duì)照組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水灌胃。最后一次給藥干預(yù)12 h 后，眼眶采血0.5 mL，離心收集血清。100 mg·kg-1戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉處死小鼠，收集小鼠腦組織，于甲醛溶液固定。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合湖北省動(dòng)物管理委員會(huì)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理證》的相關(guān)規(guī)定。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2018-0104。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證No.42010200003462。

2.10 蘇木素和伊紅染色

分別切取固定后小鼠腦組織中大腦皮層、海馬組織CA1 區(qū)和下丘腦0.3 cm 厚度，將要切取的平面朝下放到塑料包埋盒底部，乙醇梯度脫水后浸蠟包埋。將包埋組織置于-20℃冷凍，切片厚度3 μm，水浴展片，載玻片撈片，65℃烤片，將三組切片脫蠟至水，蘇木素染色3 min，伊紅染色3 min，梯度酒精脫水，過(guò)二甲苯6 s，中性樹膠封固，Leica Application Suite 圖像系統(tǒng)采集樣本相關(guān)部位。

2.11 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證核心靶點(diǎn)

收集小鼠腦組織勻漿，溫育5 min 后，離心，加入氯仿?lián)u勻，室溫靜置2 min，離心收集上清，加入等體積的異丙醇，混勻，靜置后棄上清；乙醇漂洗，干燥沉淀并加入DNase-Free Water 溶解。反轉(zhuǎn)錄條件42℃，60 min；70℃，15 min。在相應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.12 Western blot驗(yàn)證核心靶點(diǎn)

將腦組織剪碎，4℃環(huán)境下加入裂解液裂解，12 000 r·min-1離心15 min，吸取上清液。BCA 試劑盒檢測(cè)上清液中蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，PBS 洗滌3 次，加入一抗（AKT1、MAPK3、TP53、Caspase-3、VEGFA、TNF），4℃孵育12 h，PBS 洗滌3 次。加入二抗，室溫孵育1 h 后，PBS洗滌3次。曝光，灰度值分析。

2.13 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的差異采用One-way Anova 分析，以P<0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TCMSP篩選溫膽湯活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢獲得103 個(gè)溫膽湯活性成分，根據(jù)條件篩選得到99 種活性成分。其中5 種活性成分屬于陳皮、68種活性成分屬于甘草、9種活性成分屬于半夏、13種活性成分屬于枳實(shí)、3種活性成分屬于茯苓、1 種活性成分屬于竹茹。在UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢這99 種活性成分，Venny 軟件合并重復(fù)靶點(diǎn)后得到266個(gè)溫膽湯的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，具體詳見表2和圖1。

圖1 溫膽湯的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)Venny圖

表2 溫膽湯中活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

3.2 溫膽湯預(yù)測(cè)靶點(diǎn)GO功能分析

如圖2 顯示，在DAVID 網(wǎng)站中進(jìn)行GO 功能富集分析獲得溫膽湯預(yù)測(cè)靶點(diǎn)2482 條目BP（P<0.05）、102條目CC（P<0.05）、227條目MF（P<0.05），其中基因富集條目最多的前3 個(gè)BP 分別為：藥物反應(yīng)（54 基因）、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)（52基因）、細(xì)胞對(duì)化學(xué)壓力的反應(yīng)（47 基因）；基因富集條目最多的前3 個(gè)CC 分別為：膜筏（35 基因）、微區(qū)膜（35 基因）、突觸膜（27 基因）；基因富集條目最多的前3 個(gè)MF 分別為：DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（31基因）、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（26基因）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子活性（25基因）。

圖2 溫膽湯預(yù)測(cè)靶點(diǎn)GO功能分析散點(diǎn)圖

3.3 溫膽湯預(yù)測(cè)靶點(diǎn)KEGG通路分析

如圖3 所示KEGG 富集分析顯示溫膽湯的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)參與185 個(gè)信號(hào)通路（P<0.05），基因富集條目最多的前3個(gè)通路分別為：脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（51基因）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（44 基因）、化學(xué)致癌-受體激活（44基因）。

圖3 溫膽湯預(yù)測(cè)靶點(diǎn)KEGG通路分析散點(diǎn)圖

3.4 溫膽湯與失眠共同靶點(diǎn)分析

利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索失眠的相關(guān)靶點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)2587 個(gè)失眠相關(guān)靶點(diǎn)。Venny 軟件分析溫膽湯預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與失眠相關(guān)靶點(diǎn)，最終得到119 個(gè)共同靶點(diǎn)（圖4）。

圖4 溫膽湯化合物與失眠靶點(diǎn)交集

3.5 溫膽湯與失眠共同靶點(diǎn)PPI分析

應(yīng)用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)，分析共同靶點(diǎn)。使用Network Analyzer 分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)，以≥2倍的中位數(shù)及≥1倍的介數(shù)中心度和接近中心性的中位數(shù)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)共同靶點(diǎn)中心度從大到小的順序?yàn)椋篈KT1、TNF、IL-6、TP53、VEGFA、CASP3、MMP9、MAPK3（圖5）。使用STRING網(wǎng)站分析共同靶點(diǎn)之間的蛋白互作關(guān)系，生物體選擇小鼠，最低要求的交互置信度（Minimum required interaction score）選擇最高自信度，一共產(chǎn)生115 個(gè)節(jié)點(diǎn)，165 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為2.87，PPI富集P<1.0e-16，所有蛋白結(jié)合分值均大于0.9。邊條目最多的是Trp53，一共有19 條邊，邊條目排名前十的靶點(diǎn)詳情見表3。使用k均值聚類算法將115 個(gè)節(jié)點(diǎn)聚集為2 類，去除沒(méi)有邊連接的蛋白后得到圖6 所示的共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)共同靶點(diǎn)中心的基因和邊條目數(shù)量排序，溫膽湯治療失眠的核心靶點(diǎn)有AKT1、TNF、IL-6、TP53、CASP3等（圖7）。

圖5 Network Analyzer分析共同靶點(diǎn)

圖6 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖7 溫膽湯治療失眠核心靶點(diǎn)分析圖

表3 共同靶點(diǎn)PPI分析邊條目

3.6 溫膽湯與失眠共同靶點(diǎn)GO功能分析

如圖8 顯示，在DAVID 網(wǎng)站中進(jìn)行GO 功能富集分析獲得共有靶點(diǎn)1929 條目BP（P<0.05）、70 條目CC（P<0.05）、168 條目MF（P<0.05），其中基因富集條目最多的前3 個(gè)BP 分別為：藥物反應(yīng)（29 基因）、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)（27 基因）、金屬離子的響應(yīng)（26 基因）；基因富集條目最多的前3 個(gè)CC 分別為：膜筏（19 基因）、微區(qū)膜（19 基因）、突觸膜（17 基因）；基因富集條目最多的前3 個(gè)MF 分別為：DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（15 基因）、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（14基因）、RNA 聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（14基因）。

圖8 溫膽湯核心靶點(diǎn)GO功能分析散點(diǎn)圖

3.7 溫膽湯與失眠共同靶點(diǎn)KEGG功能分析

如圖9 所示KEGG 富集分析顯示共同靶點(diǎn)參與156個(gè)信號(hào)通路（P<0.05），基因富集條目最多的前3個(gè)通路分別為：脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（28 基因）、卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（23基因）、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化（22 基因）。對(duì)比后發(fā)現(xiàn)核心靶點(diǎn)主要存在脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路中，在KEGG 網(wǎng)站中檢索脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路（hsa05417），核心靶點(diǎn)所參與的通路分支分別為PI3K-AKT 信號(hào)通路、凋亡、p53信號(hào)通路（圖10）。

圖9 溫膽湯核心靶點(diǎn)KEGG功能分析散點(diǎn)圖

圖10 溫膽湯核心靶點(diǎn)通路聚集圖

3.8 睡眠剝奪的效應(yīng)評(píng)價(jià)與失眠小鼠模型鑒定

睡眠剝奪后小鼠精神狀態(tài)較差，飲食飲水減少，毛發(fā)光亮度較差。隨著睡眠剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，體質(zhì)量開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖11）在模型組中隨機(jī)挑選6只小鼠與對(duì)照組小鼠進(jìn)行睡眠剝奪的效應(yīng)評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果詳見表4-表7。模型組睡眠剝奪小鼠與對(duì)照組相比，大腦皮層出現(xiàn)明顯的胞核皺縮，細(xì)胞排列雜亂，體積縮??；海馬CA1 區(qū)細(xì)胞膠質(zhì)細(xì)胞增生；下丘腦組織基質(zhì)疏松，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，皺縮的帶形細(xì)胞數(shù)量增加，飽滿角形細(xì)胞減少。結(jié)果表明小鼠睡眠被剝奪并引起腦組織損傷（圖12）。

圖11 睡眠剝奪期間小鼠體質(zhì)量

圖12 睡眠剝奪小鼠大腦皮層、海馬CA1區(qū)和下丘腦組織HE染色（×200）

表4 睡眠剝奪后毛發(fā)效應(yīng)評(píng)價(jià)

表5 睡眠剝奪后精神狀態(tài)效應(yīng)評(píng)價(jià)

表6 睡眠剝奪后飲食效應(yīng)評(píng)價(jià)

表7 睡眠剝奪后糞便效應(yīng)評(píng)價(jià)

3.9 小鼠體內(nèi)核心靶點(diǎn)相關(guān)mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化

檢測(cè)溫膽湯低劑量和高劑量治療前后小鼠腦組織中核心靶點(diǎn)表達(dá)水平（圖13，圖14）。與對(duì)照組相比，模型組小鼠腦組織中AKT1 和MAPK3 mRNA 表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），TP53、Caspase-3、VEGFA、TNF mRNA 表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，低劑量組小鼠腦組織中AKT1 和MAPK3 mRNA 表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），Caspase-3、VEGFA、TNF的mRNA 表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。此外，與低劑量組相比，高劑量組小鼠腦組織中TP53、Caspase-3、VEGFA、TNF 的mRNA 表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），AKT1 和MAPK3mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。

圖13 溫膽湯對(duì)核心基因mRNA表達(dá)水平的影響

圖14 溫膽湯對(duì)核心基因蛋白表達(dá)水平的影響

4 討論

本研究通過(guò)水平轉(zhuǎn)盤睡眠剝奪法構(gòu)建失眠小鼠模型，通過(guò)蘇木素和伊紅染色發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪小鼠腦組織損傷。在失眠的治療方法中，認(rèn)知行為療法、艾司唑侖、唑吡坦和蘇伐雷坦的藥物治療可改善失眠癥患者的臨床癥狀，但是其臨床意義、適用性、有效性和長(zhǎng)期療效性都不太清楚[40]。由于中醫(yī)具有毒副作用小和治療效果顯著的特點(diǎn)，因此選用溫膽湯進(jìn)行失眠癥的治療具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)溫膽湯合半夏秫米湯加減療法可以有效地改善睡眠質(zhì)量[41]。對(duì)慢性胃炎合并失眠癥患者實(shí)施溫膽湯治療效果顯著[42]。溫膽湯治療慢性胃炎并失眠癥，能夠顯著提高患者的治療效果，對(duì)患者的睡眠質(zhì)量產(chǎn)生良好的改善作用，具有較高的臨床實(shí)踐價(jià)值[43]。針刺聯(lián)合加味溫膽湯治療痰熱擾心型失眠臨床療效顯著，可更加有效地改善患者臨床癥狀，提高睡眠質(zhì)量，值得在臨床中推廣應(yīng)用[44]。耳穴聯(lián)合溫膽湯用于痰熱內(nèi)擾型失眠患者，可快速改善患者的癥狀及情緒狀態(tài)[45]。腦梗塞后痰熱內(nèi)擾型失眠癥應(yīng)用溫膽湯聯(lián)合耳穴貼壓治療具有非常顯著的臨床效果[46]。運(yùn)用溫膽湯配合森田療法干預(yù)治療失眠癥，無(wú)不良反應(yīng)，無(wú)藥物依賴，患者易于接受且療效顯著，適合臨床廣泛應(yīng)用[47]。針對(duì)慢性胃炎并發(fā)失眠患者按照耳穴貼壓以及參芪溫膽湯相結(jié)合的方式展開治療，可針對(duì)患者睡眠狀態(tài)進(jìn)行有效改善，利于恢復(fù)[48]。溫膽湯對(duì)失眠癥具有明顯的治療效果，并且溫膽湯可以聯(lián)合西藥和耳穴來(lái)加強(qiáng)治療效果。但是本研究的溫膽湯與傳統(tǒng)的溫膽湯配方不同，并且溫膽湯方劑中藥復(fù)方能夠治療失眠癥的具體作用靶點(diǎn)仍不明確。

在本研究中，利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)發(fā)現(xiàn)溫膽湯中一共有103 個(gè)活性成分，其中甘草中的活性成分最多，通過(guò)篩選后仍然有99種主要的活性成分，而這些活性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白有266 個(gè)。這提示溫膽湯具有多種生物活性，每一味中草藥均具有一定的生物活性，故溫膽湯方劑中藥復(fù)方中的半夏、竹茹、麩炒枳實(shí)、陳皮、炙甘草、茯苓都具有一定的生物活性。因此，只能通過(guò)分析溫膽湯的生物學(xué)過(guò)程及其分子功能來(lái)進(jìn)一步篩選核心靶點(diǎn)。

通過(guò)GO 功能分析發(fā)現(xiàn)溫膽湯活性成分參與的生物學(xué)過(guò)程最多的為藥物反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)類固醇激素的反應(yīng)、對(duì)金屬離子的響應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程、對(duì)活性氧的反應(yīng)；溫膽湯活性成分的分子功能主要有DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性。隨后KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)溫膽湯活性成分主要參與脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、化學(xué)致癌-受體激活信號(hào)通路、乙型肝炎信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染信號(hào)通路、卡波西肉瘤信號(hào)通路、人T 細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型感染信號(hào)通路。但是脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路與藥物反應(yīng)和化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)系并不緊密。因此要找到溫膽湯與失眠癥作用的核心靶點(diǎn)，需要結(jié)合失眠癥的作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析。通過(guò)GeneCards 檢索失眠的相關(guān)靶點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)2587個(gè)相關(guān)的靶點(diǎn)。通過(guò)分析溫膽湯活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與失眠預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)溫膽湯活性成分和失眠共有119 個(gè)共同靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的蛋白之間存在1609 條作用關(guān)系。在Network Analyzer 中對(duì)共有靶點(diǎn)可視化分析，以≥2倍的中位數(shù)及≥1倍的介數(shù)中心度和接近中心性的中位數(shù)進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)共有靶點(diǎn)中的核心基因?yàn)椋篈KT1、TNF、IL-6、TP53、VEGFA、CASP3、MMP9、MAPK3。

研究報(bào)道AKT1 磷酸化會(huì)降低氧化應(yīng)激刺激的MAP3K5 激酶活性，從而防止細(xì)胞凋亡[49]。促凋亡活性通過(guò)與PPP1R13B/ASPP1或TP53BP2/ASPP2的相互作用被激活[50]。LincRNA-p21 參與導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的TP53 依賴性轉(zhuǎn)錄抑制，似乎對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)有影響，通過(guò)抑制CLOCK-ARNTL/BMAL1 介導(dǎo)的PER2 轉(zhuǎn)錄激活來(lái)調(diào)節(jié)生物鐘[51]。大腦生物鐘的異常也是導(dǎo)致失眠的一個(gè)因素。MAPK3參與程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，當(dāng)細(xì)胞收到內(nèi)部（例如DNA損傷）或外部信號(hào)（例如細(xì)胞外死亡配體）時(shí)開始，當(dāng)執(zhí)行階段完成時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)死亡[52-53]。結(jié)合VEGFA 參與MAPK 的級(jí)聯(lián)調(diào)控，推測(cè)溫膽湯調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子和信號(hào)通路的傳導(dǎo)，來(lái)治療失眠癥。隨后通過(guò)GO 功能分析和KEGG 功能分析發(fā)現(xiàn)，溫膽湯與失眠的核心靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過(guò)程為藥物反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，并調(diào)節(jié)神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路。研究證實(shí)人類睡眠質(zhì)量減少后增加了炎癥相關(guān)白細(xì)胞數(shù)量，從而增加動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的途徑[54]，同時(shí)，在共有靶點(diǎn)的KEGG 分析中也發(fā)現(xiàn)了動(dòng)脈粥樣硬化通路。細(xì)胞炎癥的最終結(jié)果是凋亡，通過(guò)檢測(cè)與凋亡相關(guān)的核心基因后發(fā)現(xiàn)，失眠小鼠腦組織中，AKT1、MAPK3、TP53 mRNA 表達(dá)量顯著降低（P<0.001），經(jīng)高劑量溫膽湯治療后表達(dá)量顯著增加（P<0.001）；失眠小鼠腦組織中VEGFA、Caspase-3 mRNA 表達(dá)量顯著增加（P<0.001），經(jīng)高劑量溫膽湯治療后表達(dá)量顯著降低（P<0.01），并且高劑量溫膽湯調(diào)節(jié)mRNA 表達(dá)量能力強(qiáng)于陽(yáng)性藥物艾司唑侖片。本研究采用多種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，準(zhǔn)確尋找溫膽湯與失眠的共有靶點(diǎn)，并在共有靶點(diǎn)中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)分析核心靶點(diǎn)，在獲取靶點(diǎn)信息的基礎(chǔ)上加以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，由于未使用所有的數(shù)據(jù)庫(kù)，因此對(duì)于一些還未報(bào)道的靶點(diǎn)缺乏驗(yàn)證，今后將在獲取溫膽湯治療失眠活性成分的基礎(chǔ)上，以藥物分子來(lái)驗(yàn)證失眠靶點(diǎn)。

綜上所述，溫膽湯治療失眠的核心靶點(diǎn)是AKT1、MAPK3、TP53、VEGFA、Caspase-3、TNF mRNA。溫膽湯通過(guò)核心靶點(diǎn)以及PI3K-AKT 信號(hào)通路、凋亡、p53信號(hào)通路調(diào)控腦組織細(xì)胞凋亡和存活，該研究為溫膽湯或中藥方劑治療失眠提供了一定的方向。