基于網(wǎng)絡藥理學研究安石榴苷治療炎癥性腸病的作用機制＊

毛旭文，古麗若依·帕爾哈提，張雍正，阿米爾·澤布，程路峰＊＊

（1. 新疆醫(yī)科大學藥學院 烏魯木齊 830017；2. 新疆天然藥物活性組分與釋藥技術重點實驗室 烏魯木齊 830017；3. 新疆醫(yī)科大學國際教育學院 烏魯木齊 830017）

近年來，炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升態(tài)勢，且其發(fā)生因素復雜，主要有：遺傳因素、環(huán)境因素、腸道微生物菌群、腸道免疫系統(tǒng)紊亂、腸道粘膜屏障功能障礙等[1-3]。IBD 病程漫長、其癥狀反復發(fā)作，長期可發(fā)展為結腸癌。據(jù)統(tǒng)計，亞洲IBD 患者發(fā)生結腸癌30 年的累積風險為13.91%[4-5]。目前在臨床上IBD 防治的藥物主要有：柳氮磺吡啶、對氨基水楊酸、糖皮質激素等。但是患者長期使用上述藥物會產生耐受性，并且引起多種不良反應，停藥后癥狀容易復發(fā)，給患者造成一定的煩擾，有待尋找一種療效顯著且不良反應少的天然藥物[6-7]。

安石榴苷（Punicalagin，Pun）來源于石榴皮，是其發(fā)揮藥理作用的重要物質基礎?！侗静菥V目》記載石榴皮主治：“赤白痢下，久痢久瀉，積腫惡毒，胃部生瘡”?，F(xiàn)代研究報告安石榴苷具有消炎、防癌、抗菌、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用[8-13]。有研究報道安石榴苷通過調節(jié)腸道菌群結構，緩解由致病性大腸桿菌O101建立的急性細菌性腸炎模型[14]。但是安石榴苷對化學損傷引起的炎癥性腸病，其治療作用及分子機制還沒有得到系統(tǒng)性闡明。本研究擬利用網(wǎng)絡藥理學方法和分子對接技術，對安石榴苷治療IBD 的潛在作用機理進行預測，并對預測結果進行全面、詳細的分析，對安石榴苷開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 分析平臺和數(shù)據(jù)庫

數(shù)據(jù)庫及數(shù)據(jù)分析軟件見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫與分析平臺

1.2 儀器與試藥

組織包埋機，型號：Histostar，Thermo Fisher Scientific 公司生產；酶標儀，型號：CoDa，Bio-Rad 公司生產；組織切片機，型號：CM1900，Lecia 公司生產。葡聚糖硫酸鈉鹽（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C12750877）；腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海將來實業(yè)股份有限公司，批號：063016HLP104840701）；白細胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海將來實業(yè)股份有限公司，批號：063016HLP202680701）；小鼠糞便隱血試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：0701A22）；CCK-8試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：A109295084）；髓過氧化物酶（MPO）檢測試劑盒（上海將來實業(yè)股份有限公司，批號：063016HLP10367070 1）；趨化因子配體1（CXCL1）檢測試劑盒（上海將來實業(yè)股份有限公司，批號：063016HLP201500701）；地塞米松（北京索萊寶科技有限公司，批號：LOT20235125）；安石榴苷由新疆醫(yī)科大學藥理教研室提取。

1.3 實驗動物

選取SPF級C57BL/6J小鼠60只（購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2016-0006），雌雄各半，6-8 周齡，體質量18-22 g。SPF 級實驗動物使用許可證號SYXK（新）2016-0002，每天光照12 h、黑暗12 h，溫度21±2℃，濕度40%-45%。本實驗經過新疆醫(yī)科大學實驗動物中心倫理委員會批準，倫理批號：IACUC-20211016-39。

1.4 網(wǎng)絡藥理學

1.4.1 藥物-疾病靶點預測

借助PubChem 數(shù)據(jù)庫和SwissTarget Prediction 平臺，以Norm Fit>0 篩選獲得藥物靶點，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫對獲得藥物靶點名稱進行統(tǒng)一，得到安石榴苷的作用靶點。利用GeneCards、OMIM 以及CTD 數(shù)據(jù)庫，以“Inflammatory bowel disease”為關鍵詞進行檢索，去掉重復后得到IBD 的相關靶點。通過Venny2.1 繪制韋恩圖，獲得安石榴苷作用靶點與IBD 相關靶點交集靶點，導入Cytoscape3.8.2軟件，構建“藥物-疾病-作用靶點”網(wǎng)絡圖。

1.4.2 PPI網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選

使用STRING 數(shù)據(jù)庫，以獲得的藥物和疾病的交集靶點導入進行檢索，蛋白種屬選擇Homo Sapiens、閾值選擇0.4，建立蛋白互作關聯(lián)網(wǎng)絡圖。利用Cytoscape3.8.2 軟件中的NetworkAnalyzer 功能拓撲學分析蛋白互作關聯(lián)網(wǎng)絡圖，最終構建“藥物-疾病-作用靶點”網(wǎng)絡。

1.4.3 基因功能和通路富集分析

借助David 6.8 數(shù)據(jù)庫，對安石榴苷治療IBD 的靶點進行GO 分析和KEGG 通路富集分析，以P<0.05 為篩選條件，按差異顯著性大小進行排序，選擇KEGG通路富集前16條結果繪制氣泡圖。

1.4.4 藥物-核心靶點的分子對接驗證

將安石榴苷的3D結構從Pubchem數(shù)據(jù)庫中檢索，保存為可處理格式，也就是為配體，并最小化其能量。利用PyMOL軟件對靶蛋白進行預處理后，從RCSBPDB數(shù)據(jù)庫下載預測得到的安石榴苷靶蛋白3D結構，獲得受體。通過AutoDock vina 1.1.2 軟件運用盲法對接分析安石榴苷與靶蛋白之間的親和力和對接位點。

1.5 動物實驗

1.5.1 動物造模分組及給藥

將60 只鼠齡6-7 周，體質量18-22 g C57/BL6J 小鼠隨機分為對照組、IBD 模型組、安石榴苷組（低、中、高）、陽性藥組，每組10只。對照組小鼠每日正常飲食飲水，不進行其他處理。IBD 模型組、安石榴苷組（低、中、高）、陽性藥組小鼠每日自由飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉鹽（Dextran sulfate sodium，DSS）溶液代替飲水，自由進食。對照組與模型組小鼠每天以0.1 mL·10 g-1體質量灌胃滅菌水，安石榴苷組灌胃安石榴苷水溶液10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1每日1 次，連續(xù)灌胃7 天。陽性藥組以地塞米松0.4 mg·kg-1腹腔注射，每日1次，連續(xù)注射7天。

1.5.2 疾病活動指數(shù)（Disease activity index，DAI）評分

每日對小鼠DAI 進行評估，DAI=（體質量下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血分數(shù)）/3，具體評分標準見表2。

表2 DAI評分標準

1.5.3 蘇木素-伊紅（HE）染色

取4%多聚甲醛固定的小鼠結腸，石蠟包埋、切5 μm 連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。蘇木精染色7 min，1%氨水浸泡30 s，0.5%伊紅乙醇浸泡30 s。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察各組小鼠結腸組織形態(tài)變化并進行病理學評分，評分標準見表3。

表3 組織學評分標準

1.5.4 ELISA法檢測結腸組織中細胞因子

將結腸組織于冰上勻漿，勻漿液于4℃，3500 r·min-1離心15 min，收集上清液，按ELISA 試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β、MPO、CXCL1、IL-6、IL-18、IFN-γ、IL-10水平。

1.5.5 腸道通透性檢測

小鼠于給藥第7 天后，禁食不禁水12 h，灌胃給予1 mg·mL-1異硫酸熒光素-硫酸葡聚糖（FITC-dextran），4 h 后小鼠采用乙醚麻醉，眼眶靜脈叢取血。血液于3500 r·min-1離心15 min。吸取100 μL 在波長480 nm和520 nm處檢測樣品的熒光強度。

1.6 細胞實驗

1.6.1 CCK8法測定caco-2細胞增殖活性

將caco-2 細胞經計數(shù)后稀釋為1×105個·mL-1的細胞懸液，每孔100 μL 接種到96 孔板，以含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱中孵育24 h，模型組與安石榴苷組加入2% DSS造成IBD模型，安石榴苷組加入不同濃度的安石榴苷溶液，使安石榴苷培養(yǎng)液的終濃度分別為0 μmol·L-1、0.01 μmol·L-1、0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1，每個濃度設6 個復孔。繼續(xù)孵育48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，輕輕搖勻，37℃孵育1 h，用酶標儀在450 nm處測定吸光度。

1.6.2 ELISA 法檢測脂多糖（LPS）誘導的caco-2 細胞釋放細胞因子

將caco-2 細胞經計數(shù)后稀釋為1×105個·mL-1的細胞懸液，每孔100 μL 接種到96 孔板，以含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液在培養(yǎng)箱中孵育24 小時，將細胞分為5 組：對照組、LPS 組、安石榴苷+LPS 組（低、中、高），對照組不做處理，LPS組加入1 μg·mL-1LPS，安石榴苷+LPS 組（低、中、高）加入1 μg·mL-1LPS 和25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1安石榴苷，每個濃度設3個復孔。繼續(xù)孵育48 h后，收集細胞上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-10水平。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad 軟件分析，計數(shù)資料以均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 網(wǎng)絡藥理學預測結果

2.1.1 藥物-疾病交集靶點獲取結果

運用Swiss Target Prediction 平臺得到安石榴苷作用靶點27 個，利用GeneCards、OMIM 和CTD 數(shù)據(jù)庫篩選得到1757 個與IBD 相關的靶點，將上述兩者取交集后得到14個疾病和藥物共同靶點，見圖1。

圖1 安石榴苷和IBD交集靶點

2.1.2 PPI網(wǎng)絡分析及關鍵靶點獲取結果

將14 個交集靶點導入String 在線網(wǎng)站進行分析后，將有相互作用的11 個靶點數(shù)據(jù)導入Cytoscape 軟件得到靶點PPI 圖，靶點大小及顏色越深淺隨與該靶點相互作用的靶點數(shù)多少變化，靶點間連線寬度與顏色深淺隨兩靶點相互作用密程度變化，見圖2。其中相關性較高的節(jié)點分別是腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、血管內皮生長因子（Vascular endothlial growth factor，VEGFA）、前列腺素內過氧化物合成酶2（Prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、白細胞介素2（Interleukin2，IL2）、花生四烯酸-5-脂氧合酶（Arachidonate-5-lipoxygenase，ALOX5）、人纖溶酶原激活物抑制劑1（SERPINE1）、IIA 組磷脂酶 A2 重組蛋白（Phospholipase A2 group IIA，PLA2G2A）、血小板生長因子（PGF）、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型2（Protein tyrosine phosphatase nonreceptor type 2，PTPN2）、CD38 蛋白、黃嘌呤脫氫酶（Xanthine dehydrogenase，XDH）等，見圖3。這些節(jié)點在PPI 網(wǎng)絡中起著關鍵作用，可能是安石榴苷治療炎癥性腸病的關鍵靶點。

圖2 PPI網(wǎng)絡互作圖

圖3 拓撲分析PPI靶點度值圖

2.1.3 GO功能分析及KEGG通路富集分析

GO 分析結果顯示核心靶點主要參與炎癥反應的調節(jié)、對外部刺激反應的正向調節(jié)、血管傷口愈合的負調節(jié)、內肽酶活性的調節(jié)、調節(jié)細胞對壓力的反應等生物過程。獲得190 條分子功能，包括：蛋白酶結合、細胞因子受體結合、水解酶活性、蛋白質同二聚化活性、脂質結合等方面。獲得134 條細胞組成，主要有：分泌顆粒管腔、細胞質核周區(qū)等方面，見表4，圖4。核心靶點經過KEGG 通路分析得到16 條信號途徑，主要集中在Ras 信號通路、花生四烯酸代謝信號通路、AGE-RAGE 信號、胰腺分泌物以及C 型凝集素受體等信號途徑，見圖5。

圖4 生物過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）及細胞組分（Cell component，CC）GO富集分析圖

圖5 KEGG富集分析圖

表4 GO功能分析

2.1.4 分子對接驗證

分子對接結果顯示，安石榴苷與TNF 的結合分值最高（-10.4 kcal·mol-1），表明安石榴苷與TNF 之間具有較強的結合活性，對接結果見表5、圖6。

圖6 安石榴苷與預測靶點的分子對接圖

表5 安石榴苷與預測靶點的結合能

2.2 動物實驗結果

2.2.1 安石榴苷對IBD小鼠體質量的影響

小鼠于飲用2.5% DSS 溶液后第3 天出現(xiàn)懶動、排稀便、體質量下降、糞便隱血陽性，進食和飲水量減少。造模第4 天，模型組體質量與對照組比較明顯下降（P<0.001）。造模第7 天，與對照組比較，IBD 模型組小鼠體質量明顯降低（P<0.001）；與IBD 模型組比較，高劑量安石榴苷組給藥后小鼠體質量顯著升高（P<0.001），中劑量安石榴苷組給藥后小鼠體質量顯著升高（P<0.05），低劑量安石榴苷組給藥后小鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義；低、中、高劑量安石榴苷組比較小鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義；結果表明中、高劑量安石榴苷可以明顯減小IBD 小鼠體質量下降幅度；與IBD 模型組比較，陽性藥地塞米松干預后的小鼠體質量顯著升高（P<0.01），表明地塞米松可以明顯減小IBD 小鼠體質量下降幅度。與地塞米松組比較，中、高劑量安石榴苷組小鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義，見圖7。

圖7 安石榴苷對炎癥性腸病小鼠體質量變化的影響（±s，n=10）

2.2.2 安石榴苷對IBD小鼠DAI評分的影響

隨造模時間延長，IBD 模型組小鼠癥狀逐漸加重，DAI 評分逐漸升高，第5 天開始出現(xiàn)不同程度的肉眼血便。造模第7 天，與對照組比較，IBD 模型組小鼠DAI 評分明顯升高（P<0.001）；與IBD 模型組比較，低、中、高劑量組安石榴苷干預后的小鼠DAI 評分顯著降低（P<0.001），高劑量組DAI 評分顯著低于低劑量組（P<0.001），表明安石榴苷可以明顯降低IBD 小鼠DAI評分，高劑量組治療效果更顯著；與IBD 模型組比較，陽性藥組地塞米松干預后的小鼠DAI 評分顯著降低（P<0.001），高劑量組小鼠DAI評分顯著低于地塞米松組（P<0.001），表明地塞米松可以明顯降低IBD 小鼠DAI評分，高劑量安石榴苷治療效果更優(yōu)，見圖8。

圖8 安石榴苷對炎癥性腸病小鼠DAI評分的影響（±s，n=10）

2.2.3 安石榴苷對IBD小鼠結腸組織學損傷的影響

對照組結腸結腸黏膜完整、結構清晰、未發(fā)現(xiàn)炎性細胞明顯浸潤及潰瘍；隱窩結構完整，杯狀細胞豐富。IBD 模型組小鼠結腸黏膜不完整，大部分腺體被破壞，腺體正常結構喪失，排列紊亂，部分杯狀細胞消失，隱窩結構被破壞。安石榴苷干預組結腸組織炎性細胞浸潤明顯減少，腺體破壞較輕，炎性細胞數(shù)量也顯著減少，炎癥程度明顯減輕，見圖9。

圖9 安石榴苷對炎癥性腸病小鼠腸壁病理變化的影響（HE，×10）

2.2.4 安石榴苷對小鼠結腸組織學損傷評分的影響

IBD 模型組的組織學評分明顯高于對照組的組織學評分（P<0.001）；中、高劑量安石榴苷組的組織學評分明顯低于模型組的組織學評分（P<0.01、P<0.001）；陽性藥組的組織學評分也明顯低于模型組的組織學評分（P<0.001）。安石榴苷組與陽性藥地塞米松組的組織學評分的差異無統(tǒng)計學意義，見圖10。

圖10 安石榴苷對小鼠結腸組織學損傷評分的影響（±s，n=10）

2.2.5 安石榴苷對小鼠炎癥因子水平的影響

模型組TNF-α、IL-1β、MPO、CXCL1、IL-6、IL-18、IFN-γ 水平明顯高于對照組（P<0.001），高劑量安石榴苷干預后TNF-α、IL-1β、MPO、CXCL1、IL-6、IL-18、IFN-γ 水平明顯下降（P<0.001）。陽性藥地塞米松干預后，TNF-α、IL-1β、MPO、CXCL1、IL-6、IL-18、IFN-γ 水平明顯下降（P<0.001）。高劑量安石榴苷組TNF-α、IL-1β、MPO、CXCL1、IL-6、IL-18、IFN-γ 水平與陽性藥地塞米松組比較差異無統(tǒng)計學意義。模型組IL-10 水平明顯低于對照組（P<0.001），高劑量安石榴苷干預后IL-10 水平明顯升高（P<0.001）。陽性藥地塞米松干預后，IL-10 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。高劑量安石榴苷組IL-10 水平與陽性藥地塞米松組比較差異無統(tǒng)計學意義，見圖11。

圖11 安石榴苷對炎癥性腸病小鼠炎癥因子水平的影響（±s，n=10）

2.2.6 安石榴苷對腸通透性的影響

模型組腸通透性明顯高于對照組（P<0.001），低、中、高劑量安石榴苷干預腸通透性明顯下降（P<0.01、P<0.001、P<0.001）。陽性藥地塞米松干預后，腸通透性明顯下降（P<0.001）。高劑量安石榴苷組腸通透性與陽性藥地塞米松組比較差異無統(tǒng)計學意義，見圖12。

圖12 安石榴苷對炎癥性腸病小鼠腸通透性的影響（±s，n=10）

2.3 細胞實驗

2.3.1 安石榴苷對caco-2細胞增殖活性的影響

利用2% DSS 制造IBD 細胞模型，CCK8 法測定不同濃度安石榴苷對caco-2 細胞增殖影響，安石榴苷在0-10 μmol·L-1濃度范圍內對caco-2 細胞增殖無影響；安石榴苷在20、50、100、200、300 μmol·L-1濃度范圍內，caco-2細胞呈現(xiàn)出增殖增加趨勢（P<0.05、P<0.05、P<0.001、P<0.01、P<0.001），見圖13。

圖13 安石榴苷對caco-2細胞增殖的影響（±s，n=6）

2.3.2 安石榴苷對LPS誘導caco-2細胞釋放細胞因子的影響

模型組TNF-α 水平明顯高于對照組（P<0.001），中、高劑量安石榴苷干預后TNF-α 水平明顯下降（P<0.001）。陽性藥地塞米松干預后，TNF-α 水平明顯下降（P<0.001）。高劑量安石榴苷組TNF-α 水平與陽性藥地塞米松組比較差異無統(tǒng)計學意義。模型組IL-10水平明顯低于對照組（P<0.001），中、高劑量安石榴苷干預后IL-10 水平明顯升高（P<0.05、P<0.01）。陽性藥地塞米松干預后，IL-10 水平明顯升高（P<0.01）。高劑量安石榴苷組IL-10水平與陽性藥地塞米松組比較差異無統(tǒng)計學意義，見圖14。

圖14 安石榴苷對caco-2細胞分泌炎癥因子水平的影響（±s，n=6）

3 討論

該研究通過網(wǎng)絡藥理學對安石榴苷治療IBD的作用靶點進行了預測，PPI 網(wǎng)絡分析顯示，與安石榴苷治療IBD 有關的前10 位靶點分別是TNF、ALOX5、VEGFA、SERPINE1、PLA2G2A 等。TNF 是一種可誘發(fā)腫瘤細胞死亡或凋亡的細胞因子，包括：TNF-α 和TNF-β。TNF 是免疫反應中最先釋放的細胞因子，具有強大的促炎作用，誘發(fā)了IBD 等多種炎癥性疾病。TNF 通過不同的機制介導腸道炎癥，可直接誘導腸上皮細胞凋亡，IBD 患者腸上皮細胞中TNF 分泌水平增高，并伴隨腸上皮細胞凋亡[15-17]。TNF 還可以通過激活NF-ΚB 信號通路，導致腸道免疫反應過度激活，促炎因子與趨化因子分泌增多，在損傷組織中過度集聚，從而造成局部組織炎癥損傷[18]。NF-ΚB 信號通路激活導致肌球蛋白輕鏈激酶過度表達，破壞腸黏膜屏障的緊密連接[19-21]。腸黏膜屏障通透性增強導致細菌和內毒素侵襲幾率增加，過度激活免疫系統(tǒng)，從而引發(fā)炎癥和組織損傷。

TNF-α 作為IBD 的易感基因，是IBD 治療的關鍵靶點。目前被批準用于IBD 治療的TNF-α 拮抗劑有：英夫利昔單抗、阿達木單抗等。英夫利昔單抗開創(chuàng)了生物制劑治療IBD 的新時代，對中、重度IBD 臨床療效顯著[22-23]。英夫利昔單抗可以中和TNF-α，調節(jié)促炎癥細胞因子分泌，與TNF-α 結合后抑制其與受體結合，抑制CD4+T 細胞和Th17 細胞分化產生的促炎細胞因子，如：IFN-γ、IL-13、IL-17A、IL-12、TNF 等水平，從而促進炎癥消退，有效緩解IBD 患者臨床癥狀[24]。

本研究對安石榴苷治療IBD 的14 個靶點進行GO功能富集分析，結果涉及炎癥反應的調節(jié)、外部刺激反應的正向調節(jié)、血管傷口愈合的負調節(jié)、蛋白激酶活性等生物學過程。KEGG 富集分析得到了與安石榴苷治療IBD 相關的信號通路總共有16 條，其中涉及有花生四烯酸代謝通路、Ras 信號通路等?；ㄉ南┧峤涍^環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）產生前列腺素（Prostaglandins，PGs），COX-2 的過表達會促進PGs生成，引起組織炎癥及細胞功能破壞[25-29]。安石榴苷可能作用于花生四烯酸代謝通路中COX-2、PLA2G2A、ALOX5、PTGS2 等多種酶表達，抑制炎癥反應，發(fā)揮治療IBD 作用。Ras/Raf-1/ERK 作為介導細胞生存代謝及炎癥的一條重要信號通路，在微小血管生成、腫瘤、糖尿病、類風濕性關節(jié)炎等疾病發(fā)生發(fā)展過程起到關鍵的調控作用[30-35]。另一方面，Ras/Raf-1/ERK 是參與組織損傷愈合過程的主要信號通路之一，能夠通過調控VEGF、VEGFR 的表達水平，調節(jié)血管新生的全過程，從而促使組織損傷創(chuàng)面愈合[36-40]。安石榴苷可能作用于Ras/Raf-1/ERK 信號通路，調控VEGFA表達水平，促進結腸潰瘍創(chuàng)面愈合。

正常情況下，結腸組織中促炎因子與抑炎因子處于平衡狀態(tài)，當組織損傷時，促炎因子分泌增多，抑炎因子分泌相對不足，導致了損傷組織中促炎因子與抑炎因子表達失衡，而過多分泌的促炎因子又會激活機體免疫系統(tǒng)，導致持續(xù)的炎癥免疫反應，造成組織炎癥損傷[41-42]。因此恢復促炎因子與抗炎因子間的平衡，可以抑制腸道免疫過度激活，緩解結腸組織損傷，促進損傷組織的修復，是治療IBD 的主要策略。本實驗研究證實了石榴皮中活性成分安石榴苷可以緩解小鼠結腸炎的癥狀，并且在測試劑量下未見明顯毒性反應。安石榴苷在實驗中顯示出明顯的抗IBD 活性，給藥7 天后小鼠的體質量下降幅度減小、糞便成型、DAI評分降低、小鼠結腸組織中促炎因子水平下降、抗炎因子水平升高、腸黏膜通透性降低。安石榴苷與TNF-α 靶點蛋白的結合分值為-10.4 kcal·mol-1，表現(xiàn)出較強的結合活性。ELISA 實驗結果顯示，安石榴苷能夠有效抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、MPO、CXCL1、IL-6、IL-18、IFN-γ分泌，上調抗炎因子IL-10水平，恢復促炎因子與抗炎因子間的平衡，抑制由TNF-α 介導的腸道炎癥反應。大量的促炎因子（如TNF-α、IL-1β）能夠下調緊密連接蛋白的表達，導致腸黏膜屏障功能紊亂，增加腸通透性。安石榴苷能夠有效降低腸道通透性，對腸黏膜屏障具有保護作用。細胞實驗結果發(fā)現(xiàn)安石榴苷在20-300 μmol·L-1濃度范圍內可促進caco-2 細胞的增殖，對DSS 誘導的caco-2 細胞損傷具有保護作用。同時抑制TNF-α分泌，上調IL-10水平，緩解LPS誘導的caco-2細胞炎癥反應，發(fā)揮抗炎作用。

本研究運用網(wǎng)絡藥理學對安石榴苷治療炎癥性腸炎的作用靶點進行了分析與預測[43-50]，并進一步采用分子對接及動物實驗對安石榴苷藥效進行驗證，結合動物實驗與細胞實驗結果明確安石榴苷抑制TNFα 等促炎因子的分泌，上調抗炎因子IL-10 水平，恢復促炎因子與抗炎因子間的平衡，減輕腸道炎癥反應而發(fā)揮抗IBD 作用，為以后安石榴苷抗IBD 的分子機制深入研究提供了理論依據(jù)。