針刺對(duì)乳腺癌癌因性疲乏模型小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用＊

呂 轉(zhuǎn)，劉瑞東，蘇凱奇，阮曉迪，齊士魁，余明月，顧一鳴，高 靜，劉 啟，房 璐，馮曉東＊＊

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450000；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 鄭州 450000）

癌因性疲乏（Cancer-related fatigue，CRF）是一種由癌癥或癌癥治療引起的，持續(xù)存在的主觀感覺(jué)，并能擾亂機(jī)體正常功能，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。在所有癌癥患者中，CRF 在乳腺癌患者中最為常見(jiàn)[2-5]，60%的乳腺癌患者在診斷治療后12個(gè)月內(nèi)會(huì)發(fā)生中度到重度的疲乏癥狀，21%-52%的癌癥患者在診斷治療后的5-15年內(nèi)仍存在一定的疲乏癥狀，接受化療治療后的患者CRF 發(fā)生率為70%-100%[6-7]。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020 年全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示乳腺癌發(fā)病率高居全球第一，同時(shí)隨著各種檢測(cè)和治療技術(shù)的進(jìn)步，乳腺癌患者的生存期也越來(lái)越長(zhǎng)[8-9]。因此，乳腺癌患者的CRF 亟待得到重視與解決。目前，針對(duì)CRF 的治療多屬對(duì)癥處理，總體療效并不理想。多項(xiàng)研究表明，針刺治療能有效改善CRF 的疲乏癥狀、抑郁情緒和睡眠障礙，提高患者免疫力，并在提高CRF 患者的生存質(zhì)量方面具有良好的安全性[10-11]。

CRF 的發(fā)生機(jī)制尚不完全清晰，近年來(lái)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群在腫瘤發(fā)生進(jìn)展及腫瘤治療引起的不良反應(yīng)中均起著重要作用[12-14]，并且腸道菌群變化參與了CRF 的發(fā)生過(guò)程，可能與其影響體內(nèi)免疫功能進(jìn)而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)有相關(guān)性[15-17]。關(guān)于針刺對(duì)CRF的治療作用機(jī)制，既往研究較少涉及腸道菌群的影響變化。本實(shí)驗(yàn)采用16S rDNA技術(shù)，探討針刺對(duì)乳腺癌化療后疲乏模型小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，以期從腸道菌群角度探討針刺干預(yù)乳腺癌化療后CRF 的效應(yīng)機(jī)制，為中醫(yī)傳統(tǒng)針刺法在腫瘤康復(fù)中的更廣泛應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SPF 級(jí)BALB/c 小鼠50 只，6-8 周齡，體質(zhì)量15-18 g，由鄭州市華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：410981211100010031，經(jīng)過(guò)河南中醫(yī)藥第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物倫理批準(zhǔn)編號(hào)為：YFYDW2021012。控制室溫保持在22-25℃，相對(duì)濕度在40%-60%，12 h/12 h晝夜節(jié)律交替，自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 細(xì)胞

4T1-Luciferase 小鼠乳腺癌細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)國(guó)立癌癥研究所，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院腫瘤研究室提供。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)液中，放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2-3 天傳代1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 藥物、試劑與儀器

注射用環(huán)磷酰胺（CTX）0.2 g（安道生 ENDOXAN公司，批號(hào)：H20160467）；0.2 mm×13 mm 一次性華佗牌無(wú)菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；TruSeq DNA PCR-Free 樣品制備試劑盒（美國(guó)Illumina 公司）；Phusion 高保真PCR Master Mix with GC Buffer（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；磁珠法糞便基因組DNA 提取試劑盒（DP712）（北京天根生化科技有限公司）；CTAB試劑盒（北京酷來(lái)搏科技有限公司）；16S V4 區(qū)引物341F-806R（上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）；Qubit@ 2.0熒光儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）。

1.4 分組和造模方法

首先將20 只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組10 只，荷瘤加化療組（模型組）10 只。將4T1 細(xì)胞調(diào)整濃度為2×106/mL，在模型組每只小鼠的第四乳墊區(qū)皮下接種0.1 mL細(xì)胞，接種7-10天，當(dāng)腫瘤體積約0.5 cm3時(shí)，給予模型組腹腔注射CTX100 mg·kg-1·d-1，連續(xù)3 天。以模型組小鼠體質(zhì)量降低及一般情況較差、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平和垂直運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。然后其余30 只小鼠造模成功后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為針刺組10 只、假針刺組10只、模型組10只。

1.5 干預(yù)方法

造模成功后次日，針刺組小鼠參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，選取位于小鼠膝關(guān)節(jié)下方，腓骨頭下0.3 cm 處的肌溝中的“足三里”，后肢內(nèi)踝尖上0.5 cm 處的“三陰交”，臍后方1 cm 處的“關(guān)元”，臍后方0.5 cm 處的“氣?！焙晚敼钦械摹鞍贂?huì)”。在穴位處消毒后，足三里直刺3 mm，三陰交直刺1.5 mm，關(guān)元斜刺1.5 mm，氣海斜刺1.5 mm，百會(huì)平刺1 mm，留針30 min，6 min 行針1 次，每日治療1 次，每周治療6 天，連續(xù)治療2 周；假針刺組每日陪同抓取，固定，不治療。

1.6 取材

糞便樣本：治療結(jié)束后，每組10只小鼠處死后，分別解剖腹部，無(wú)菌狀態(tài)下取出整個(gè)腸道，用無(wú)菌PBS沖洗腸道外壁后，切取結(jié)腸段，輕柔擠出內(nèi)容物置于無(wú)菌的凍存管中，并迅速放入液氮速凍后置于-80℃保存。

1.7 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.7.1 體質(zhì)量及一般情況

觀察各組小鼠的體質(zhì)量大小、精神狀態(tài)、活動(dòng)度、飲食情況、毛發(fā)情況以及大便性狀等一般情況。

1.7.2 強(qiáng)迫游泳

在光線較暗的環(huán)境中將小鼠放入直徑10 cm，高度25 cm 的圓柱形透明水桶中，保持桶中的水深10-15 cm，水溫在23-25℃，用攝像系統(tǒng)記錄6 min 小鼠游泳時(shí)間，統(tǒng)計(jì)后4 min 小鼠的不動(dòng)時(shí)間，以此評(píng)估小鼠的體力和疲勞情況。

1.7.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

在光線較暗的環(huán)境中將小鼠放置在敞箱底面的中心方格內(nèi)，箱上方安置攝像系統(tǒng)，記錄分析小鼠在箱內(nèi)3 min 的水平運(yùn)動(dòng)得分（小鼠穿越底面塊數(shù)，穿越1塊記1分）和垂直運(yùn)動(dòng)得分（小鼠后腿直立次數(shù)，每次記1 分），以此評(píng)估小鼠在陌生環(huán)境中的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力。

1.7.4 糞便DNA提取及PCR擴(kuò)增、建庫(kù)和測(cè)序

采用CTAB/SDS 法提取糞便樣本中全基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA濃度和純度，并根據(jù)DNA 濃度，用無(wú)菌水稀釋樣本濃度至1 ng·μL-1。擴(kuò)增子使用特異性引物16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)引物擴(kuò)增，上下游引物分別是341F：5’-CCTAYGGGRBGCASC AG-3’, 806R: 5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’。所有PCR反應(yīng)均使用15 μL Phusion high fidelity PCR Master Mix 進(jìn)行，引物正向和反向分子量均為0.2 μmol·L-1，模板DNA 約為10 ng。擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)是初始變性溫度98℃ 1 min，變性溫度98℃ 10 s，退火溫度50℃ 30 s，延伸溫度72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)。最后延伸溫度72℃ 1 min，10℃保存?；旌螾CR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，并用Qiagen Gel Extraction Kit（Qiagen，Germany）純化。然后使用TruSeq DNA PCR-Free 樣品制備試劑盒生成測(cè)序庫(kù)，利用Qubit 和安捷倫生物分析儀2100系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用Illumina NovaSeq進(jìn)行16S rDNA V4測(cè)序。

1.7.5 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

測(cè)序完成后，將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接并過(guò)濾后，得到有效數(shù)據(jù)。采用Uparse 軟件，默認(rèn)以97%的一致性，對(duì)所有樣品的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)，并將序列聚類(lèi)為OTUs，基于Mothur 算法的Silva Database 進(jìn)行物種注釋分析，研究不同樣本中優(yōu)勢(shì)種屬的差異、群落組成。利用QIIME 軟件計(jì)算Beta 多樣性，主要選用主坐標(biāo)分析（PCoA）,用于說(shuō)明所測(cè)樣本的相似性或差異性。通過(guò)MetaStat 和LEfSe 分析比較分析組間的物種組成和群落結(jié)構(gòu)差異，篩選各水平中具有顯著差異的物種。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.4 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)定的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，當(dāng)P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較，若符合正態(tài)檢驗(yàn)與方差齊性檢驗(yàn)，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若符合正態(tài)檢驗(yàn)但不符合方差齊性檢驗(yàn)，采用兩獨(dú)立樣本校正t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)檢驗(yàn)，采用兩樣本比較的Wilcoxon Man-Whitney U 秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量及一般情況觀察

造模后，與空白組比較，模型組體質(zhì)量增加不明顯，小鼠毛發(fā)稀疏、攝食飲水減少、活動(dòng)度減低、行動(dòng)遲緩、精神萎靡、不活潑、大便稀粘。干預(yù)后，與模型組比較，針刺組體質(zhì)量有所升高，小鼠攝食飲水、精神狀態(tài)、活動(dòng)度、毛發(fā)情況等均有明顯改善，而假針刺組與其比較無(wú)明顯差異。

2.2 各組小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)比較

造模后，與空白組比較，模型組、假針刺組和針刺組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P<0.001），提示乳腺癌CRF 小鼠模型構(gòu)建成功。干預(yù)后，與模型組、假針刺組比較，針刺組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間均明顯縮短（P<0.001）；模型組和假針刺組強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)比較（±s，n=10）

2.3 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)比較

造模后，與空白組比較，模型組在曠場(chǎng)內(nèi)的水平運(yùn)動(dòng)得分明顯降低（P<0.001），垂直運(yùn)動(dòng)得分也有所下降（P<0.01）（見(jiàn)表1），提示乳腺癌CRF 小鼠模型構(gòu)建成功；干預(yù)后，與模型組、假針刺組比較，針刺組在曠場(chǎng)內(nèi)的水平運(yùn)動(dòng)得分均有所升高（P<0.05），垂直運(yùn)動(dòng)得分也均明顯升高（P<0.01）；模型組與假針刺組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。見(jiàn)表2。

表1 造模前后小鼠曠場(chǎng)水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分比較（±s，n=10）

表1 造模前后小鼠曠場(chǎng)水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分比較（±s，n=10）

注：與空白組比較，***P<0.001。

組別空白組模型組P值水平運(yùn)動(dòng)得分造模前109.15±6.29 108.17±7.01 0.82造模后45.94±9.72 107.46±5.68***<0.001垂直運(yùn)動(dòng)得分造模前22.87±7.76 22.19±8.36 0.90造模后11.18±7.35 24.60±7.34***0.004

表2 針刺干預(yù)前后小鼠曠場(chǎng)水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分比較（±s，n=10）

表2 針刺干預(yù)前后小鼠曠場(chǎng)水平和垂直運(yùn)動(dòng)得分比較（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假針刺組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別模型組假針刺組針刺組P值水平運(yùn)動(dòng)得分干預(yù)前42.10±9.15 43.93±9.74 45.32±9.93 0.87干預(yù)后6.72±1.82 7.79±3.29 12.24±2.97**##0.004干預(yù)后30.30±4.28 30.34±5.89 41.36±8.03*#0.02垂直運(yùn)動(dòng)得分干預(yù)前12.07±2.74 11.88±3.44 12.43±3.48 0.96

2.4 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及物種注釋分析

優(yōu)化后的有效序列，進(jìn)行OUT聚類(lèi)，稀釋曲線是從樣本中隨機(jī)抽取一定測(cè)序量的數(shù)據(jù)，可直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，由圖2A可知，各組樣本平均得到48526條有效序列，各組樣本共獲得OUT數(shù)量為1428個(gè)，其中針刺組有415個(gè)，模型組有531個(gè)，假針刺組有482個(gè)，圖中顯示曲線趨向平坦，說(shuō)明了測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。Rank Abundance 曲線可反映樣物種的豐富度和均勻度，由圖2B 顯示得出曲線越來(lái)越平緩，則表示物種分布均勻。

圖2 物種多樣性曲線圖

2.5 針刺對(duì)模型小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成的影響

根據(jù)物種注釋結(jié)果，統(tǒng)計(jì)針刺組、假針刺組、模型組3 組在門(mén)水平豐度排名前10 的物種，并繪制按樣本和按組分類(lèi)的豐度柱形圖（見(jiàn)圖3）；同時(shí)統(tǒng)計(jì)3組屬水平的熱圖，以及繪制按樣本和按組分類(lèi)的豐度柱形圖（見(jiàn)圖4）。運(yùn)用MetaStat 方法找出組間差異顯著（P<0.05）的物種（見(jiàn)圖5）。針刺組與模型組比較，在門(mén)水平上，變形菌門(mén)豐度降低，放線菌門(mén)豐度升高；在屬水平上，鏈球菌屬、葡萄球菌屬豐度降低，擬桿菌屬、瘤胃球菌屬和小球菌屬豐度升高。針刺組與假針刺組比較，在門(mén)水平上，變形菌門(mén)、彎曲桿菌門(mén)豐度降低，厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)豐度升高；在屬水平上，擬桿菌屬、瘤胃球菌屬和小球菌屬豐度升高；葡萄球菌屬豐度降低。而由圖3A 顯示在門(mén)水平上針刺組脫硫弧菌門(mén)水平只在針刺組某一個(gè)樣本中豐度較高，而剩余樣本中豐度較低，圖4 顯示在屬水平上針刺組乳酸桿菌屬在3 組中豐度水平較高，針刺組大部分樣本乳酸桿菌屬豐度均較其他兩組高，有個(gè)別樣本豐度較低，這些情況均可能是存在個(gè)體差異的緣故。

圖3 門(mén)水平上的物種相對(duì)豐度柱狀圖

圖4 屬水平上的物種豐度聚類(lèi)熱圖和豐度柱狀圖

圖5 MetaStat方法對(duì)組間的物種差異分析

2.6 LEfSe差異分析

進(jìn)一步用LEfSe 分析軟件來(lái)挖掘各組間顯著差異的物種和微生物群落，結(jié)果顯示（見(jiàn)圖6）：3 組共得到23個(gè)豐度較高的差異物種，針刺組的差異物種為脫硫弧菌屬、放線菌門(mén)、瘤胃球?qū)?，差異微生物群落為脫硫弧菌科、放線菌門(mén)；假針刺組的差異物種為脫硫弧菌屬、厭氧棍狀菌屬、副薩特菌屬，差異微生物群落為脫硫弧菌科、Marinifilaceae；模型組的差異物種為Muribacter、腸桿菌科、顫桿菌科，差異微生物群落為腸桿菌科、顫桿菌科。

圖6 組間差異顯著物種篩選結(jié)果

2.7 Beta多樣性分析

各組小鼠腸道菌群差異可通過(guò)PCoA 分析歸類(lèi)，由圖7 結(jié)果顯示PC1 貢獻(xiàn)度為23.91%，PC2 貢獻(xiàn)度為10.8%。3 組小鼠的數(shù)據(jù)密度、空間距離均不相同，各組分布范圍均較大，雖然3組聚類(lèi)有重疊部分，但由圖顯示各組樣品均能聚類(lèi)，說(shuō)明3 組的樣品菌群結(jié)構(gòu)主成分具有顯著差異。結(jié)合Anosim 組間差異分析結(jié)果顯示（見(jiàn)表3），針刺組與模型組比較R 值為0.04185，假針刺組與針刺組比較R值為0.05612，模型組與假針刺組比較R 值為0.06633。如果R 值大于0，說(shuō)明組間有差異，而3 組兩兩比較，其P值均大于0.05，由此提示3組組間腸道微生物群落有差異，但差異不顯著。

表3 各組小鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)Anosim分析

圖7 PCoA分析圖

3 討論

CRF 屬于中醫(yī)“虛勞”范疇，主要病機(jī)為臟腑氣血陰陽(yáng)的虧虛?；熑纭八幎尽?，耗傷機(jī)體脾胃氣陰，脾胃虛弱則氣血生化無(wú)源，故有疲勞、乏力、納差、腹瀉、嘔吐等癥狀，因此CRF 基本病機(jī)為“虛”，以脾腎受損為主[18-19]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在改善CRF 方面發(fā)揮重要作用，包括單味的中草藥、方劑、中成藥制品、中草藥提取物制成的水劑等[20-21]，但針刺在治療CRF 有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，針刺通過(guò)毫針刺激穴位，并施以補(bǔ)瀉手法，激發(fā)經(jīng)氣，能起到疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)節(jié)臟腑、運(yùn)行氣血、扶正祛邪的作用。研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用針刺在改善腫瘤并發(fā)癥上具有一定的治療效果，如疼痛、失眠、抑郁、惡心、嘔吐、骨髓抑制、疲乏等[22]。同時(shí)，針刺治療CRF 也以調(diào)理脾腎二臟為主，臨床取穴以脾胃經(jīng)和腎經(jīng)為主，同時(shí)選取補(bǔ)益正氣相關(guān)穴位。足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)合穴，具有補(bǔ)益氣血，提高機(jī)體免疫力功效；三陰交屬足太陰脾經(jīng)，有健脾益血，調(diào)補(bǔ)肝腎功能；百會(huì)為諸陽(yáng)之會(huì)，是人體陽(yáng)氣最強(qiáng)盛的地方；另外，任督二脈可溝通陰陽(yáng)，激發(fā)正氣，如關(guān)元可培補(bǔ)元?dú)?，氣海連命門(mén)，可補(bǔ)益中氣。一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)針刺足三里、氣海、三陰交、關(guān)元能改善肺癌患者疲乏程度及生活質(zhì)量[23]；另有研究者證實(shí)針刺百會(huì)、氣海、足三里、三陰交治療后，乳腺癌康復(fù)期患者的疲乏程度明顯低于假穴淺刺組[24]；同時(shí)一項(xiàng)Meta 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺治療CRF穴位使用頻次較多的為足三里、關(guān)元、氣海、三陰交、百會(huì)[25]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用針刺足三里、三陰交、關(guān)元、氣海、百會(huì)五個(gè)穴位。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)針刺疲勞組穴可明顯改善癌因性疲乏患者化療后的疲勞癥狀，改善患者氣血兩虛型相關(guān)的中醫(yī)證候，提高患者生活質(zhì)量[26]。Molassiotis 等[27]開(kāi)展的一項(xiàng)多中心、大樣本臨床研究，302 例乳腺癌患者分為針刺聯(lián)合護(hù)理宣教組與常規(guī)護(hù)理組，結(jié)果證實(shí)治療組患者的疲乏、情緒以及生活質(zhì)量評(píng)分均優(yōu)于對(duì)照組，提示針刺可能緩解CRF 并提高患者的生活質(zhì)量。

本研究通過(guò)構(gòu)建荷瘤乳腺癌小鼠模型，進(jìn)而給予環(huán)磷酰胺化療后，建立乳腺癌化療后CRF 小鼠模型。結(jié)合小鼠的一般情況、體質(zhì)量情況和行為學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)乳腺癌化療后CRF 小鼠毛發(fā)稀疏、攝食飲水減少、活動(dòng)度減低、行動(dòng)遲緩、精神萎靡、不活潑、大便稀粘、體質(zhì)量明顯下降以及強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加，提示模型小鼠有疲乏癥狀，造模成功。針刺干預(yù)后，相較于假針刺組和模型組，小鼠攝食飲水、精神狀態(tài)、活動(dòng)度、毛發(fā)等一般情況明顯改善，體質(zhì)量雖有升高，但與其他兩組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)通過(guò)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)后，針刺組相較于假針刺組和模型組，小鼠疲乏程度有所減輕。結(jié)果證實(shí)針刺治療可以改善乳腺癌化療后CRF小鼠的疲乏癥狀以及一般情況。

腸道菌群是人體內(nèi)種類(lèi)繁多、參與多種生理代謝活動(dòng)的微生態(tài)系統(tǒng)，其可在腸道內(nèi)形成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的生態(tài)系統(tǒng)，維持腸道屏障穩(wěn)態(tài)，調(diào)控代謝、炎癥和免疫[28-30]。腸道菌群既可預(yù)防腫瘤發(fā)生，又可促進(jìn)腫瘤發(fā)生，其中腸道內(nèi)的益生菌發(fā)揮著抗腫瘤作用，致病菌則促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。腸道菌群失調(diào)是指益生菌減少，致病菌數(shù)量增多，菌群比例失調(diào)，長(zhǎng)期菌群失調(diào)即可引起腫瘤等疾病的發(fā)生[31-34]。研究發(fā)現(xiàn)腸道菌可通過(guò)去甲基化和去糖基化反應(yīng)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[35]。短鏈脂肪酸受體GPR109A 在乳腺癌中呈低表達(dá)水平，敲除GPR109A基因可導(dǎo)致小鼠自發(fā)形成乳腺癌以及早期的肺轉(zhuǎn)移[36]。

化療可能會(huì)打破腸道菌群穩(wěn)態(tài)，引起雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌明顯減少，葡萄球菌、大腸桿菌等機(jī)會(huì)致病菌增加。菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致如疲勞、厭食、腹瀉、便秘、疼痛、骨髓抑制等，顯著降低了患者的生活質(zhì)量。Brain Behavior and Immunity上的一項(xiàng)最新研究發(fā)現(xiàn)，將化療后的雌性小鼠糞菌移植給無(wú)菌雌性小鼠，可導(dǎo)致后者體質(zhì)量下降、焦慮及神經(jīng)炎癥，進(jìn)而證實(shí)腸道菌群的失調(diào)可能促進(jìn)了化療相關(guān)副作用的發(fā)生發(fā)展[37]。環(huán)磷酰胺能夠縮短腸道絨毛，促進(jìn)局部炎癥細(xì)胞積累，破壞腸道屏障，導(dǎo)致腹瀉、機(jī)體免疫力下降等[38]。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有抗腫瘤、抗細(xì)菌、調(diào)節(jié)免疫等功效，如乳酸桿菌可激活B淋巴細(xì)胞，刺激各種免疫細(xì)胞因子如TNF-α、INF-γ等的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗腫瘤作用的體液免疫反應(yīng)[39]。一項(xiàng)研究證實(shí)口服凍干乳酸桿菌和雙歧桿菌的益生菌組合，可預(yù)防順鉑的腸道毒性[40]；另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌可預(yù)防順鉑引起的心臟毒性[41]。本研究發(fā)現(xiàn)排除可能的個(gè)體差異外，針刺組大部分樣本的乳酸桿菌屬豐度水平高于其他兩組，說(shuō)明針刺治療可會(huì)增強(qiáng)腸道內(nèi)益生菌的水平，可提高乳腺癌化療后CRF 小鼠的免疫力，可能會(huì)減輕化療的不良反應(yīng)，增強(qiáng)體內(nèi)的抗腫瘤作用。變形菌門(mén)為革蘭陰性菌，作為致病菌，過(guò)度增殖會(huì)導(dǎo)致腸道缺氧，腸上皮功能障礙，抑制有益菌增殖，破壞菌群結(jié)構(gòu)，干擾正?？寡讬C(jī)制和免疫抑制機(jī)制，阻礙腫瘤治療進(jìn)程和破壞腫瘤免疫監(jiān)視[42]。本研究發(fā)現(xiàn)針刺組的變形菌門(mén)豐度和葡萄球菌屬豐度水平均明顯低于模型組和假針刺組，結(jié)果提示針刺治療可抑制腸道內(nèi)致病菌的水平，改善腸道微環(huán)境，調(diào)節(jié)菌群失調(diào)。另外，LEfS 差異分析發(fā)現(xiàn)模型組差異物種為腸桿菌科，已知腸道內(nèi)的腸桿菌科是變形菌門(mén)的菌科，進(jìn)一步證實(shí)其可能導(dǎo)致模型組菌群失調(diào)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)針刺組的差異物種包括放線菌門(mén)，而已知腸道可產(chǎn)生丁酸鹽的雙歧桿菌屬是放線菌門(mén)的菌屬，其可通過(guò)提高腸道屏障功能防御病原體，作為一種益生菌起到增加機(jī)體免疫力、減少化療不良反應(yīng)，抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌屬的主要代謝產(chǎn)物之一的神經(jīng)酰胺能調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡，抑制腫瘤進(jìn)展[43]。本研究發(fā)現(xiàn)在屬水平上，針刺組的擬桿菌屬水平明顯高于模型組和假針刺組，結(jié)果證實(shí)針刺可能通過(guò)提高腸道內(nèi)擬桿菌屬的水平，起到抑制腫瘤進(jìn)展的作用。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)在門(mén)水平上針刺組脫硫弧菌門(mén)水平只在針刺組某一個(gè)樣本中豐度較高，而剩余樣本中豐度較低，因此其差異分析結(jié)果可能會(huì)存在個(gè)體差異引起的緣故。

綜上所述，針刺可以顯著改善乳腺癌化療后CRF小鼠的疲乏癥狀及一般情況，并可能通過(guò)增加腸道有益菌、降低致病菌、改善腸道菌群而發(fā)揮治療CRF 的作用。然而可能由于各組樣本的個(gè)體差異，在差異分析上可能存在一些不足之處，下一步我們將具體分析可能存在的問(wèn)題，并同時(shí)分析腸道菌群調(diào)控的通路機(jī)制，以其為發(fā)現(xiàn)針刺治療CRF 的機(jī)制研究及臨床應(yīng)用提供更明確的依據(jù)，為中醫(yī)傳統(tǒng)針刺法在腫瘤康復(fù)中的更廣泛應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。