基于腦腸軸探究半夏瀉心湯對DSS-UC小鼠腸道菌群及5-HT的影響＊

張梁坤，谷文超，吳婷婷，李 靈，吳秀花，張新生，韓 濤，黃海量，陳 健＊＊

（1. 濟(jì)南市中心醫(yī)院 濟(jì)南 250013；2. 臨朐張新生中醫(yī)診所（新生堂） 濰坊 262600；3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 濟(jì)南 250300）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是現(xiàn)階段公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重點(diǎn)與難點(diǎn)[1-2]，其發(fā)病機(jī)制可能與腸道微生態(tài)紊亂[3-7]、免疫平衡失調(diào)[8-10]、神經(jīng)遞質(zhì)異常[11-13]等因素密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)潰瘍性結(jié)腸炎患者因其長期反復(fù)的腹瀉、腹痛甚至黏液血便，多伴有不同程度的抑郁及焦慮癥狀[14-16]。腸道微生物及5-HT作為重要的“腦腸軸”上行通路信息傳遞媒介，在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[17-19]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯治療UC 臨床療效可靠[20-21]，其可以顯著降低UC 患者的中醫(yī)癥狀評分、提高UC 治愈率并降低不良反應(yīng)的發(fā)生率。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯可通過5-HT 信號通路同時(shí)治療UC 及焦慮癥[22]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)半夏瀉心湯可升高UC 動(dòng)物模型的IL-10 水平，降低TNF-α、IFN-γ、IL-6水平及IFN-γ/IL-4、IL-6/IL-10比值；升高Treg細(xì)胞相對數(shù)量，降低Th17細(xì)胞相對數(shù)量。同時(shí)可以下調(diào)結(jié)腸黏膜組織JAK2、STAT3 蛋白表達(dá)；降低有害菌Clostridium_sensu_stricto_1、Coriobacteriaceae_UCG-002的相對豐度，升高產(chǎn)短鏈脂肪酸類菌Lachnospiraceae_NK4A136_group、Prevotellaceae_UCG-001、unclassified_f_Lachnospiraceae等菌屬的相對豐度等通過改善腸道微生物結(jié)構(gòu)[23]、調(diào)整Th1/Th2、Th17/Treg 細(xì)胞平衡緩解炎癥反應(yīng)[24-25]等方面發(fā)揮治療UC 的作用。同時(shí)檢索他人研究發(fā)現(xiàn)，UC 患者機(jī)體5-HT 信號通路存在顯著改變[26]，且腸道微生物可影響5-HT 水平與分布[27-30]?；谏鲜稣擖c(diǎn)，本人提出合理假說：半夏瀉心湯可通過改善UC 腸道微生物結(jié)構(gòu)，并經(jīng)腦腸軸進(jìn)一步改善中樞及外周5-HT水平，進(jìn)而發(fā)揮治療UC的作用。

基于上述假說，本研究采用半夏瀉心湯干預(yù)葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS）自由飲用誘導(dǎo)建立的UC 模型小鼠（以下簡稱為DSS-UC），檢測腸道微生物結(jié)構(gòu)變化及血清、結(jié)腸組織及腦組織中5-HT水平變化，基于腦腸軸探究半夏瀉心湯對DSS-UC 小鼠腸道菌群及5-HT 的影響，以期闡釋半夏瀉心湯可通過改善腸道微生物結(jié)構(gòu)，并通過直接及間接因素影響外周及中樞5-HT 水平，改善腸道炎癥反應(yīng)及焦慮狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。美沙拉嗪屬于水楊酸制劑，該類藥物可以抑制大腸粘膜的非特異性炎癥性反應(yīng)，對緩解腹痛、腹瀉癥狀具有一定的治療效果；且美沙拉嗪是目前西醫(yī)治療潰瘍性結(jié)腸炎臨床應(yīng)用最多的一線用藥之一。其臨床療效可靠、確定，因此本研究中采用美沙拉嗪作為陽性藥，以用于評價(jià)半夏瀉心湯療效。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

選用40 只6 周齡（18-22 g）SPF 級健康雄性C57BL/6J 小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0006]，質(zhì)量合格證號為110011201108073665。

所有動(dòng)物在山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境設(shè)施內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號為SYXK（魯）20170022。實(shí)驗(yàn)期間采用60Co滅菌大小鼠維持飼料。屏障設(shè)施環(huán)境的溫度為22±2℃；濕度為50%±5%；光照交替12 h/12 h。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審查通過，并嚴(yán)格遵循山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 儀器與試劑

儀器：正置顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，型號DM1000），高速臺式冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司），攤片烤片機(jī)（湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司，型號TKD-TK），自動(dòng)組織脫水機(jī)（湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司，型號TKD-TSF），石蠟切片機(jī)（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，型號RM2235），生物組織包埋機(jī)-冷凍機(jī)（泰維科技，型號TB-718L），電泳儀（中國北京市六一儀器廠），恒溫烘箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號DHG-9023A），生物組織包埋機(jī)（泰維科技，型號TB-718D），酶標(biāo)儀（Labsystems Multiskan，型號MS352型），F(xiàn)astPfu Polymerase FastPfu（中國TransGen 公司），MISEQ 測序儀（美國Illumina 公司，型號：Illumina Miseq），超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

試劑及藥物：右旋葡聚糖硫酸鈉（美國MP 公司相對分子質(zhì)量36 000-50 000，批號S2839），冰醋酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號10000218），伊紅（Solarbio，批號E8090），中性樹脂（Solarbio，批號G8590），蘇木素（Sevicebio，批號G1004），4%多聚甲醛（Biosharp，批號69111800）。

1.3 中藥飲片及水煎液制備

中藥材：生半夏（批號：10032001）47.37 g、干姜（批號：200401）56.85 g、黃連（批號：200501）22.46 g、黃芩（批號：200301）18.95 g、人參（批號：200701）56.85 g、炙甘草（批號：200801）56.85 g 和大棗（批號：190501）37.90 g。生半夏購自北京葆年堂（菏澤）藥業(yè)有限公司，其余藥物均購自山東百味堂中藥飲片有限公司，所有藥物經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源研究室靳光乾研究員鑒定均為真品。其中生半夏根據(jù)文獻(xiàn)方法[31]將其加4 倍量80℃熱水反復(fù)湯洗10 次，洗至水清澈，切開斷面透心，口嘗應(yīng)有微麻感或無麻感的湯洗半夏。隨后將上述飲片加8 倍量滅菌水，室溫狀態(tài)下浸泡30 min，武火開鍋后改用文火，微沸煎煮30 min，傾出藥液，趁熱過濾，去滓再煎至240 mL 藥液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究采用C57BL/6J雄性小鼠，接受動(dòng)物后置于觀察室觀察一周，期間采用體重區(qū)間分組法將40只小鼠隨機(jī)分為空白組（Control）、模型組（Model）、陽性藥物組（Pos）和半夏瀉心湯組（BXDZ）；實(shí)驗(yàn)開始后除空白組外所有小鼠自由飲用濃度為2.5%的DSS 水溶液7 天以建立DSS-UC 小鼠模型；自實(shí)驗(yàn)第8 天起，各組小鼠每天于7∶30-8∶30、15∶30-16∶30 灌胃2 次，連續(xù)灌胃14天。具體如下：BXD組采用濃度為1.3817 g/mL半夏瀉心湯水煎液干預(yù)；Positive 組采用濃度為7.58 mg·mL-1拉嗪水溶液干預(yù)；Control 組及Model 組則采用滅菌水干預(yù)。所有小鼠的給藥量均為0.15 mL·10 g-1。實(shí)驗(yàn)第14 天晚，所有小鼠禁食禁水12 h，隨后收集小鼠各類標(biāo)本以供檢測。具體流程如圖1。

圖1 半夏瀉心湯干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的實(shí)驗(yàn)流程

1.5 實(shí)驗(yàn)記錄及標(biāo)本采集、檢測

①實(shí)驗(yàn)期間每日觀察、記錄實(shí)驗(yàn)小鼠的飲食攝水量、糞便、被毛、活動(dòng)和精神狀態(tài)、體重及死亡率等一般情況，并詳細(xì)記錄小鼠腹瀉及便血程度。②計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)（Disease activity index，DAI）值：據(jù)文獻(xiàn)方法[32-33]，DAI=體質(zhì)量指數(shù)+大便黏稠度指數(shù)+出血情況指數(shù)。各指標(biāo)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)如下：體質(zhì)量指數(shù)（體質(zhì)量為下降為0，下降1%-5%為1 分，下降5%-10%為2 分，下降10%-15%為3 分，下降大于15%為4 分）；大便黏稠度指數(shù)（正常為0，松散的大便為2 分，腹瀉為4 分）和大便出血指數(shù)（正常0 分，隱血陽性為2 分，顯性出血為4分）。③實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，打開腹腔，摘取脾臟，濾紙吸干殘血后稱重（g），計(jì)算脾臟指數(shù)，脾臟指數(shù)=（脾臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量）×100；④分離腸管，水平拉直腸管測量結(jié)腸長度（cm）；⑤截取結(jié)腸近段及遠(yuǎn)段，PBS緩沖液沖洗干凈，4%甲醛溶液固定保存，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，切片，HE 染色后，在光學(xué)顯微鏡下病理組織觀察，并對其進(jìn)行組織學(xué)評分。病理組織學(xué)評分=隱窩破壞程度得分+病變深度得分+病變范圍得分+炎癥浸潤程度得分；評分標(biāo)準(zhǔn)如下[34]：a：炎癥浸潤程度：無炎癥浸潤，0 分；輕度炎癥，1 分；中度炎癥，2 分；重度炎癥，3 分。b：病變深度：無病變，0 分；病變達(dá)粘膜下層，1 分；病變達(dá)肌層，2 分；病變達(dá)漿膜層，3 分。c：陷窩破壞程度：隱窩無破壞，0 分；基底1/3 隱窩被破壞，1 分；基底2/3 隱窩被破壞，2 分；僅有完整表面上皮，3 分；全部隱窩和上皮被破壞，4 分。d：病變范圍：1%-25%，0 分；26%-50%，1 分；51%-75%，2 分；76%-100%，3 分；⑥截取結(jié)腸中間段用PBS 緩沖液沖洗干凈，-80℃保存，ELISA 檢測結(jié)腸組織中炎癥因子IL-2、IL-4 及IFN-γ 的水平；⑦于實(shí)驗(yàn)第21 天輕柔小鼠腹部，獲取大便。所有樣本經(jīng)DNA 提取、PCR 擴(kuò)增純化、Illumina 測序及序列數(shù)據(jù)質(zhì)控獲取OTU 對應(yīng)的分類單元（包括門、綱、目、科、屬、種）及其相應(yīng)的豐度信息。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用Graphpad Prism 9 軟件，并使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間數(shù)據(jù)差異比較采用Student'st-test方法檢測，多組間數(shù)據(jù)差異比較采用One-way ANOVA進(jìn)行分析，相關(guān)性分析采用Maaslin 分析；并使用Graphpad Prism 9及R 軟件（版本：3.5.3）作圖。腸道菌群數(shù)據(jù)采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司生物云平臺進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05 或P<0.01 表示數(shù)據(jù)分析結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BXD對DSS-UC模型小鼠的藥效學(xué)影響

如圖2A 所示，經(jīng)DSS 自由飲用7 天建立模型后，在第7天時(shí)，造模小鼠的DAI指數(shù)均顯著升高，與空白組小鼠具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；模型組小鼠在實(shí)驗(yàn)第7、14、21天時(shí)的DAI指數(shù)均顯著高于空白組（P<0.01）；經(jīng)藥物干預(yù)14天后，較模型組相比，給藥組小鼠的DAI 指數(shù)均顯著下降（P<0.05），且陽性藥物組下降幅度更大（P<0.01）。模型組小鼠的結(jié)腸顯著縮短（P<0.01），脾臟指數(shù)增加（P<0.01）；經(jīng)半夏瀉心湯及美沙拉嗪干預(yù)后兩者均顯著改善（P<0.05），且半夏瀉心湯組與美沙拉嗪組無顯著差異，如圖2B、2C所示。

圖2 半夏瀉心湯干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的藥效學(xué)分析

炎癥因子水平是反應(yīng)UC 輕重程度的關(guān)鍵指標(biāo)。如圖2D-2F 所示，與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中的抑炎因子IL-2、IL-4 水平顯著降低（P<0.05）、致炎因子IFN-γ 水平顯著升高（P<0.01）；而與模型組相比，半夏瀉心湯組小鼠結(jié)腸組織中的抑炎因子IL-2、IL-4及致炎因子IFN-γ水平均有顯著恢復(fù)（P<0.05）。

病理是UC 診斷及分期的金指標(biāo)，為觀察DSS-UC小鼠組織病理的改變，分別對各組別小鼠結(jié)腸組織的不同部位（近端及遠(yuǎn)端）進(jìn)行HE 染色。結(jié)果如圖3 所示：空白組小鼠結(jié)腸組織近端及遠(yuǎn)端粘膜完好，上皮細(xì)胞正常，腸腺排列整齊，無明顯炎癥浸潤。而DSSUC 模型小鼠結(jié)腸近端及遠(yuǎn)端均有明顯的炎癥浸潤及病理改變：黏膜表面存在嚴(yán)重的充血、水腫甚至糜爛，隱窩出現(xiàn)分支、扭曲、萎縮等改變，同時(shí)存在腺體細(xì)胞排列紊亂，固有層內(nèi)出現(xiàn)大量彌漫性、急、慢性炎性細(xì)胞浸潤。經(jīng)半夏瀉心湯及美沙拉嗪干預(yù)后，模型小鼠結(jié)腸黏膜表面炎癥反應(yīng)明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少、上皮細(xì)胞完整性改善。病理組織學(xué)評分結(jié)果顯示，DSS-UC 模型小鼠結(jié)腸近端及遠(yuǎn)端病理組織學(xué)評分則顯著高于空白組（P<0.01），尤其是遠(yuǎn)端組織，其平均病理評分高達(dá)9.8；經(jīng)半夏瀉心湯及美沙拉嗪干預(yù)后，結(jié)腸近端及遠(yuǎn)端病理組織學(xué)評分亦均有顯著恢復(fù)（P<0.01）。

圖3 各組結(jié)腸組織病理變化（HE染色，×200）

綜上所述，半夏瀉心湯可顯著改善DSS 誘導(dǎo)建立的UC 模型小鼠的臨床表現(xiàn)，且其療效與美沙拉嗪相似。

2.2 BXD對DSS-UC小鼠5-HT水平的影響

2.2.1 血清中5-HT水平

較空白組小鼠相比，模型組小鼠血清5-HT 含量明顯升高（P<0.01）。藥物干預(yù)后，半夏瀉心湯組小鼠血清5-HT 水平顯著改善（P<0.01）；而美沙拉嗪組僅有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，如圖4A。此結(jié)果表明，半夏瀉心湯可顯著改善DSS 誘導(dǎo)所致的模型小鼠血清5-HT含量升高。

圖4 半夏瀉心湯干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的5-HT水平

2.2.2 結(jié)腸組織中5-HT水平

較空白組小鼠相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中5-HT 含量明顯升高（P<0.01）；藥物干預(yù)后，半夏瀉心湯組及美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織中5-HT 水平均顯著改善（P<0.05），且美沙拉嗪組下降趨勢更為顯著（P<0.01），如圖4B。此結(jié)果表明，半夏瀉心湯可顯著改善DSS誘導(dǎo)所致的模型小鼠結(jié)腸組織中5-HT含量升高。

2.2.3 腦組織中5-HT水平

較空白組小鼠相比，模型組小鼠腦組織中5-HT含量明顯降低（P<0.05）；藥物干預(yù)后，美沙拉嗪組小鼠腦組織中5-HT 水平均顯著改善（P<0.01），但半夏瀉心湯組小鼠腦組織中5-HT 水平僅有升高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，如圖4C。此結(jié)果表明，半夏瀉心湯對DSS 誘導(dǎo)所致的模型小鼠腦組織中5-HT 水平有升高的趨勢。

綜上所述，DSS 誘導(dǎo)建立的UC 模型小鼠外周5-HT 水平升高、中樞5-HT 水平降低；而半夏瀉心湯可以降低DSS-UC模型小鼠外周5-HT水平，升高中樞5-HT水平，進(jìn)而發(fā)揮治療UC的作用。

2.3 BXD對DSS-UC小鼠腸道菌群的影響

2.3.1 OTU物種注釋及測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

利用16S rRNA 高通量測序技術(shù)分析20 個(gè)糞便樣本中微生物基因的V3-V4 區(qū)，共獲得優(yōu)化序列1006194，422273812 bases，平均序列長度為419 bp；將97%相似水平的OTU 代表序列與數(shù)據(jù)庫silva138/16s_bacteria對比以對各OTU進(jìn)行物種分類注釋，以獲取樣本在各分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)組成，共獲取580 個(gè)OTU，分屬于229 個(gè)種、138 個(gè)屬、65 個(gè)科、38 個(gè)目、14 個(gè)綱、10 個(gè)門。采用Pan/Core 物種分析以判斷樣本量是否充足以及評估樣本中總物種豐富度和核心物種數(shù)。結(jié)果如圖5A、B 所示，隨著樣本量的增加，曲線逐漸趨于平滑，提示各組別樣本數(shù)量充足。空白組曲線均位于最上端，造模后曲線顯著下降。藥物干預(yù)后，曲線有不同程度的上升；此結(jié)果表明，該檢測測序樣本數(shù)量足夠，且半夏瀉心湯有恢復(fù)腸道物種數(shù)的功能。

稀釋曲線可用于分析測序數(shù)據(jù)量是否充足、合理；若縱坐標(biāo)為sobs（表征實(shí)際觀測到的物種數(shù)目）指數(shù)時(shí)，曲線趨向平坦則表明目前的測序數(shù)據(jù)量充足、合理，即便加大測序量也不會(huì)大量產(chǎn)生新OTU；若縱坐標(biāo)為Shannon 指數(shù)，即Shannon-Wiener 曲線，曲線趨向平坦則表明測序數(shù)據(jù)量足夠大，此次測序可充分反映被測樣本中微生物的多樣性信息。本次測序結(jié)果顯示，各樣本隨著測序深度的增加，稀釋曲線均達(dá)到平臺期，趨于平緩，如圖5C、D 所示。此結(jié)果表明，本次測序測序深度已基本覆蓋全部微生物物種，測序數(shù)據(jù)量充足、合理。

綜上所述，本次測序樣本數(shù)量充足，且測序深度已基本覆蓋全部微生物物種，測序數(shù)據(jù)量充足、合理、可信。

2.3.2 BXD對DSS-UC小鼠腸道菌群的整體影響

對獲取的580 個(gè)OTU 序列進(jìn)行Venn 圖可視化展示，如圖6A、6B 所示，空白組共含511 個(gè)OTU，分屬于120 個(gè)屬；模型組共含396 個(gè)OTU，分屬于115 個(gè)屬；陽性藥物組共含466 個(gè)OTU，分屬于120 個(gè)屬；半夏瀉心湯組共含404個(gè)OTU，分屬于119個(gè)屬；四組共有297個(gè)OTU，分屬于96個(gè)屬；空白組特有67個(gè)OTU，模型組特有5 個(gè)OTU，陽性藥物組特有6 個(gè)OTU，半夏瀉心湯組特有8個(gè)OTU。如圖6C所示，在OTU 水平上對個(gè)樣本進(jìn)行分型分析，各樣本共分為三個(gè)類型，其中空白組樣本為OTU408 所代表的類型，其單獨(dú)聚為一簇，且與其他樣本不在同一象限內(nèi)；模型組樣本為OTU415所代表的類型，亦單獨(dú)聚為一簇，且與其他樣本不在同一象限內(nèi)；陽性藥物組樣本與半夏瀉心湯組樣本為同一類型，均為OTU520 所代表的類型，來各組中各樣本聚集成簇。三種類型分別分布于不同的象限內(nèi)。結(jié)果表明：DSS誘導(dǎo)造?？梢愿淖冋Ｐ∈蟮木侯愋?，半夏瀉心湯及美沙拉嗪亦可改變DSS-UC模型小鼠的菌群類型。

圖6 半夏瀉心湯對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的影響

β 多樣性分析結(jié)果如圖6D-6F 所示，在PCA、PCoA 及NMDS 中，空白組與模型組分離明顯，兩者分布于不同的象限中；經(jīng)藥物干預(yù)后，尤其在PCoA 及NMDS 中，半夏瀉心湯組樣本與其他各組樣本顯著分離，且位于空白組與模型組之間。結(jié)果表明：DSS誘導(dǎo)造?？梢愿淖冋Ｐ∈蟮木侯愋?，半夏瀉心湯及美沙拉嗪亦可改變DSS-UC模型小鼠的菌群類型。

對各組中優(yōu)勢菌群進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6G-6J 所示，空白組樣本的優(yōu)勢菌屬是p_Bacteroidota、c_Bacteroidia、o_Bacteroidales、f_Muribaculaceae、g_norank_f_Muribaculaceae、f_Prevotellaceae、g_Lachnospiraceae_NK4A136_group、f_Bifidobacteriaceae、o_Bifidobacteriales、g_Bifidobacterium；模型組中排名前十位的優(yōu)勢菌屬是p_Firmicutes、o_Clostridiales、f_Clostridiaceae、g_Clostridium_sensu_stricto_1、g_Turicibacter、f_Peptostreptococcaceae、o_Peptostreptococcales-Tissierellales、g_Romboutsia、g_unclassified_f_Peptostreptococcaceae、f_Atopobiaceae；而半夏瀉心湯組中的優(yōu)勢菌屬是f_Lachnospiraceae、o_Lachnospirales、o_Erysipelotrichales、f_Erysipelotrichaceae、g_norank_f_Lachnospiraceae、g_Eubacterium_nodatum_group、g_unclassified_f_Lachnospiraceae、o_Coriobacteriales、c_Coriobacteriia、g_Candidatus_Soleaferrea。對各組別菌屬進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果如圖6K 所示，各組別中的優(yōu)勢菌屬存在較近的進(jìn)化關(guān)系，而組間各菌屬的進(jìn)化聯(lián)系相對較小。該結(jié)果表明：經(jīng)DSS 誘導(dǎo)建模后，模型小鼠腸道中的優(yōu)勢菌屬發(fā)生顯著變化，半夏瀉心湯亦可顯著改善模型小鼠的優(yōu)勢菌屬。

綜上結(jié)果顯示，半夏瀉心湯可顯著改善DSS-UC模型小鼠腸道中菌群的整體結(jié)構(gòu)。

2.3.3 屬水平上腸道菌群差異性分析

我們對小鼠造模前后的腸道菌屬進(jìn)行了差異性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)DSS 誘導(dǎo)建立模型后，與空白組相比較，菌屬Clostridium_sensu_stricto_1、Turicibacter、Romboutsia、Coriobacteriaceae_UCG-002、unclassified_p_Firmicutes、Parabacteroides、unclassified_c__Bacilli的相對豐度顯著升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；菌屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、Prevotellaceae_UCG-001、Alistipes、Alloprevotella、Muribaculum、Lachnoclostridium、norank_f_Oscillospiraceae、Eubacterium_xylanophilum_group的相對豐度顯著降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），如圖7A 所示。與模型組相比，半夏瀉心湯組小鼠腸道中菌屬Clostridium_sensu_stricto_1、Faecalibaculum、Bifidobacterium、Mucispirillum、unclassified_p_Firmicutes、Alloprevotella的相對豐度顯著降低（P<0.05），其中菌屬Alloprevotella的相對豐度下降最為明顯（P<0.01）；而菌屬norank_f_Lachnospiraceae、unclassified_f_Lachnospiraceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnospiraceae_UCG-006、Roseburia、Lachnoclostridium、unclassified_f_Ruminococcaceae、Eubacterium_xylanophilum_group、norank_f_Oscillospiraceae的相對豐度顯著升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），如圖7B所示。

圖7 半夏瀉心湯對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠菌屬的影響

綜上結(jié)果表明：半夏瀉心湯可顯著改善因DSS 誘導(dǎo)建模導(dǎo)致的Clostridium_sensu_stricto_1、unclassified_p__Firmicutes相對豐度升高以及Lachnospiraceae_NK4 A136_group、Lachnoclostridium、norank_f__Oscillospiraceae、Eubacterium_xylanophilum_group相對豐度的降低。

2.4 5-HT與腸道菌群的相關(guān)性分析

本研究中，我們把5-HT 水平作為環(huán)境因子，將其與微生物豐度進(jìn)行相關(guān)性分析，且5-HT 相關(guān)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，因此我們采用MaAslin 分析以計(jì)算不同組織中5-HT 水平與腸道菌屬相對豐度進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果如圖8所示，研究發(fā)現(xiàn)血清中5-HT水平與Christensenellaceae_R-7_group（r=-0.0001，P=0.002093）、Lachnospiraceae_UCG-001（r=-6.00E-05，P=0.016914）、Monoglobus（r=-0.00011，P=0.019767）、Marvinbryantia（r=-0.00014，P=0.035171）、Eubacterium_nodatum_group（r=-6.00E-05，P=0.038151）的相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，而與unclassified_p_Firmicutes（r=0.00011，P=0.003214）、Mucispirillum（r=0.00028，P=0.028999）、norank_f_Eggerthellaceae（r=6.00E-05，P=0.043982）的相對豐度呈顯著正相關(guān)。結(jié)腸組織中5-HT 水平與Anaerotruncus（r=-0.00013，P=0.027365）的相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)；而與Christensenellaceae_R-7_group（r=7.00E-05，P=0.045846）的相對豐度呈顯著正相關(guān)。腦組織中5-HT 水平與norank_f_Christensenellaceae（r=-0.00024，P=0.004492）、Family_XIII_AD3011_group（r=-0.00011，P=0.015391）、Aerococcus（r=-0.00012，P=0.024751）、norank_f_norank_o_Gastranaerophilales（r=-0.00016，P=0.028558）、Defluviitaleaceae_UCG-011（r=-0.00012，P=0.04306）、NK4A214_group（r=-0.00018，P=0.044017）的相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)；而與Romboutsia（r=0.0012，P=0.011619）、unclassified_f_Peptostreptococcaceae（r=9.00E-05，P=0.017425） 、norank_f_Desulfovibrionaceae（r=0.00025，P=0.029768）、Parasutterella（r=0.00051，P=0.03546）的相對豐度呈顯著正相關(guān)。

圖8 5-HT水平與腸道菌群相對豐度的相關(guān)性分析

3 討論

腸道菌群是人體腸管中微生物菌落的統(tǒng)稱，其與細(xì)菌代謝物、各類細(xì)胞因子等介質(zhì)組成腸道微生態(tài)系統(tǒng)，并與宿主處于互利共生的動(dòng)態(tài)平衡，以穩(wěn)定并保持宿主健康；健康的腸道微生態(tài)穩(wěn)態(tài)有助于人體正常的生理代謝活動(dòng)、免疫調(diào)節(jié)及病原體抵抗[35-38]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道與大腦具有密切的聯(lián)系；“腦腸軸”假說為該聯(lián)系奠定了理論基礎(chǔ)，而腸道菌群及腦腸肽5-HT則是“腦腸軸”假說中的重要媒介[39-40]。腸道菌群可通過直接通路及間接通路介導(dǎo)“腦腸軸”上行通路信息的傳遞；直接通路是指腸道菌群通過分泌小分子物質(zhì)，經(jīng)血液循環(huán)、血腦屏障，將菌群信息上傳至大腦；間接通路則是指腸道菌群通過影響神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)間接參與大腦活動(dòng)[41]。有研究發(fā)現(xiàn)：5-HT 在腸道菌群介導(dǎo)的“腦腸軸”上行通路信息傳遞過程中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯可顯著改善因DSS 誘導(dǎo)建模導(dǎo)致Clostridium_sensu_stricto_1、unclassified_p_Firmicutes的相對豐度升高以及Lachnospiraceae_NK4A 136_group、Lachnoclostridium、norank_f_Oscillospiraceae、Eubacterium_xylanophilum_group相對豐度的降低。Clostridium_sensu_stricto_1是常見的致病菌，可以在腸道隱窩中大量繁殖，并釋放毒素，破壞結(jié)腸組織中的細(xì)胞，引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，以導(dǎo)致黏膜脫落、細(xì)胞破解外排，故可見便溏、腹瀉甚或黏液便。Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnoclostridium等菌屬均屬于產(chǎn)短鏈脂肪酸（SCFA）類菌[42]，其可以通過酵解食物中多糖而產(chǎn)生大量SCFA，以保護(hù)腸黏膜。綜上所述半夏瀉心湯可以通過升高產(chǎn)短鏈脂肪酸類菌等益生菌、降低有害菌，改善腸道微生態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮治療UC的作用。

同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯可改善DSS-UC模型小鼠外周5-HT 水平升高及中樞5-HT 的降低。大量研究顯示UC 患者因其長期反復(fù)的腹瀉、腹痛甚至黏液血便，多伴有不同程度的抑郁及焦慮癥狀[14-16]；而腦組織中5-HT 含量與情緒高度相關(guān)，UC 患者腦組織中5-HT 含量減少，使得5-HT 不能很好的激活cAMP-PKA-CREB-BDNF 通路，進(jìn)一步導(dǎo)致BDNF 的表達(dá)下調(diào)[43]，減弱了其對神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)能力，BDNF神經(jīng)修復(fù)的減弱，及神經(jīng)毒性產(chǎn)物對神經(jīng)細(xì)胞損害的增加加速了海馬神經(jīng)細(xì)胞損害，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁的發(fā)生[44-46]；同時(shí)焦慮、抑郁狀態(tài)可能會(huì)導(dǎo)致UC 患者結(jié)腸組織中5-HT 含量的增高，加重腸道的炎癥反應(yīng)。本課題組在前期對半夏瀉心湯防治中焦樞機(jī)不利所致的胃腸疾病進(jìn)行血清、尿液非靶向代謝組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯可調(diào)控色氨酸代謝通路，并升高下丘腦中5-HT 的分泌[22,47]；且有研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯中甘草的活性成分甘草甜素抑制血清素和單胺氧化酶、降低單胺化合物的分解、使小鼠腦組織中5-HT 含量增加，進(jìn)而改善抑郁[48]。綜上所述半夏瀉心湯可以通過升高中樞5-HT 水平并降低外周5-HT 水平，以改善腸道炎癥反應(yīng)、緩解焦慮、抑郁狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮治療UC的作用。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：腸道微生物的相對豐度與5-HT 水平密切相關(guān)，相對豐度在前50 名的腸道微生物中有10 個(gè)菌屬與腦組織中5-HT 水平密切相關(guān)，有8 個(gè)菌屬與血清組織中5-HT 水平密切相關(guān)，有2 個(gè)菌屬與結(jié)腸組織中5-HT 水平密切相關(guān)。5-HT 是腸道微生態(tài)的重要組成部分，腸道菌群可通過多種代謝途徑產(chǎn)生5-HT，影響UC 患者腸道炎癥反應(yīng)；同時(shí)也可以通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)影響UC 患者腦部5-HT含量，進(jìn)而干預(yù)患者的情緒。

綜上所述，半夏瀉心湯可以通過改善UC 小鼠腸道微生物組成結(jié)構(gòu)，以降低外周5-HT 水平、升高中樞5-HT 水平，進(jìn)而改善腸道炎癥反應(yīng)、緩解焦慮情緒，從而治療潰瘍性結(jié)腸炎。