基于腸道菌群探討“通督啟神”針法對(duì)APP/PS1小鼠血腦屏障結(jié)構(gòu)及LPS的影響＊

張 悅，郝 心，丁 寧，孫潤權(quán)，趙 俊，趙亞莉，李易冉，李志剛＊＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 北京 100029；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)國際學(xué)院 北京 100029）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）也被稱為“老年癡呆”，是一種以記憶障礙和失語、失認(rèn)、失用為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病[1]。AD 在全球死亡原因中排第五位，該病患病率和增長速度遠(yuǎn)超于其他疾病[2]。預(yù)計(jì)至21 世紀(jì)中葉，中國AD 患者將達(dá)2000 萬，對(duì)個(gè)人生活以及社會(huì)支出造成巨大的負(fù)擔(dān)[3-4]。隨著人口老齡化進(jìn)程的不斷加快，AD 已成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題。

AD 的病理變化主要有淀粉樣斑塊沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)[1,5]。既往AD的研究機(jī)制主要有β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）級(jí)聯(lián)假說，TAU 蛋白假說，線粒體自噬假說等。有越來越多的研究發(fā)現(xiàn)上述病理改變并不是導(dǎo)致認(rèn)知功能下降的唯一原因[6-7]。血腦屏障（Blood-brain barrier，BBB）功能障礙貫穿AD 起病及發(fā)展的全過程[8]。血腦屏障的完整性由內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)、基底膜、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞等控制[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)BBB 內(nèi)皮功能和緊密連接結(jié)構(gòu)改變引發(fā)炎癥，累及海馬神經(jīng)元，并通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)加速AD 神經(jīng)退行性改變[11-12]。影響B(tài)BB 功能障礙的原因有很多，如全身性的炎癥、蛋白質(zhì)金屬酶（MMPs）、抗生素及自由基等[13-15]，其中BBB 的破壞與腸道菌群紊亂密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)無菌小鼠顯示出BBB 通透性增加，而通透性的上升加劇了細(xì)菌異位到大腦產(chǎn)生神經(jīng)炎癥[16]。

從AD 的長期發(fā)展進(jìn)程來看，腸道菌群紊亂是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腸道菌群能夠釋放大腦記憶活動(dòng)所需的神經(jīng)遞質(zhì)，維持大腦神經(jīng)功能和中樞免疫系統(tǒng)密切相關(guān)[17]。研究發(fā)現(xiàn)缺乏腸道菌群的小鼠海馬體積顯著減小，恐懼焦慮反應(yīng)顯著增加，免疫功能低下[18]。這也證明了腸道菌群對(duì)機(jī)體發(fā)育以及神經(jīng)功能的重要性。AD 發(fā)展初期已存在腸道菌群多樣性減低和物種構(gòu)成改變的情況，尤其以革蘭氏陰性菌增加為病理特征。既往研究證實(shí)，對(duì)比健康人，AD 患者菌群構(gòu)成表現(xiàn)出厚壁菌門豐度上升，擬桿菌門和雙歧桿菌豐度下降[19]。這種菌群紊亂的情況同樣也發(fā)生在AD 模型動(dòng)物上，具體表現(xiàn)為變形菌門、大腸桿菌豐度顯著上升，擬桿菌門豐度顯著下降[20-21]。這類特征性的腸道菌群紊亂是AD 認(rèn)知功能的下降的重要原因[22-24]。

腸道革蘭氏陰性菌的致病分子是其細(xì)胞膜外膜組成成分-脂多糖（LPS）。AD患者和模型動(dòng)物腦內(nèi)LPS含量顯著增多，這一病理改變和神經(jīng)炎癥顯著相關(guān)。LPS是一種強(qiáng)效的促炎脂質(zhì)分子，能夠誘發(fā)腸道炎癥、破壞腸上皮結(jié)構(gòu)[25]、損傷腸黏膜屏障，致使大量LPS 和炎癥物質(zhì)進(jìn)入外周誘發(fā)系統(tǒng)性炎癥[26]。LPS本身作為大分子無法透過BBB，但一方面由于AD存在BBB功能障礙和腸道菌群紊亂，大大增加LPS侵入中樞的可能性；另一方面LPS及外周炎癥反應(yīng)能夠破壞腦血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，增加血腦屏障通透性[27-28]，隨著血腦屏障通透性改變，LPS侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[29]，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，誘發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生炎癥誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡[30]。因此，血腦屏障的破壞是AD發(fā)病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，腸道菌群紊亂導(dǎo)致LPS增多可能是血腦屏障破壞的內(nèi)在機(jī)制。

既往研究證實(shí)針刺能夠改善AD 模型動(dòng)物認(rèn)知功能障礙[31-33]，還具有抗炎[34-35]、調(diào)節(jié)葡萄糖代謝[36]、調(diào)節(jié)腦血流量[37]等作用。但目前針刺調(diào)節(jié)AD 模型動(dòng)物血腦屏障的內(nèi)在機(jī)制尚不明確，因此本項(xiàng)研究選用6 月齡APP/PS1 小鼠作為動(dòng)物模型，針刺“百會(huì)”、“印堂”、“足三里”，觀察針刺對(duì)腸道菌群多樣性及物種組成、血腦屏障緊密連接結(jié)構(gòu)和LPS 的影響，旨在闡明針刺調(diào)節(jié)血腦屏障功能的腸道菌群機(jī)制，為針刺治療AD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)6 月齡雄性APP/PS1 小鼠24 只和同背景C57BL/6 小鼠8 只，體質(zhì)量（30±2）g；以上動(dòng)物均購自卡文斯百格（蘇州）模式動(dòng)物研究有限公司，合格證：SCXK（蘇）2018-0002。購入后于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物室飼養(yǎng)，于（23±1）℃，濕度45%，12 h光照，單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。由北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 分組與干預(yù)

將APP/PS1小鼠隨機(jī)分成模型組、針刺組、益生菌組，每組8只；同背景C57BL/6小鼠為對(duì)照組，8只。

針刺組采用自制鼠套固定，使用一次性無菌針灸針（0.25 mm×13 mm），依據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》在百會(huì)（GV20）、印堂（GV29）和足三里（ST36）上針刺20 min，百會(huì)、印堂橫向穿刺深度2-3 mm，足三里直刺進(jìn)針，深度為3 mm，術(shù)中每隔5 min 進(jìn)行捻轉(zhuǎn)，每次15 s。

益生菌組采用益生菌按8.7×108CFU·g-1·d-1進(jìn)行灌胃。對(duì)照組和模型組不做任何干預(yù)，僅在其他組干預(yù)時(shí)，用鼠套束縛20 min，以上干預(yù)每天1 次，每周6次。連續(xù)45天。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 試劑

益生菌（含兩岐雙歧桿菌Bb06、動(dòng)物雙歧桿菌BB-12、乳雙歧桿菌Bi07、長雙歧桿菌R175、動(dòng)物雙歧桿菌B94、鼠李糖乳桿菌GG、干酪乳桿菌LC11、瑞士乳桿菌R52、副干酪乳桿菌Lpc37、植物乳桿菌R1012、羅伊氏乳桿菌HA188、鼠李糖乳桿菌R11、嗜酸乳桿菌NCFM、嗜熱鏈球菌St21，與菌共舞，ZHONG KE YI KANG，中國）、鼠源LPS 抗體（HycultBiotech，HM6011）、驢抗小鼠二抗（Abcam，ab150108）、DAPI 染液（Abcam、ab104139）。

1.3.2 儀器

一次性無菌針灸針（0.25 mm×13 mm、北京中研泰和醫(yī)藥有限公司）、Morris水迷宮圖像自動(dòng)采集和分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）、冰凍切片機(jī)（Leica、德國）、激光共聚焦顯微鏡（Leica、德國）石蠟切片機(jī)（Thermo Scientific，美國）。

1.4 Morris水迷宮檢測(cè)

各組小鼠干預(yù)45 天后進(jìn)行為期6 天的Morris 水迷宮行為學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)裝置包括一個(gè)圓形水池（直徑90 cm、高50 cm、深30 cm），水池注水后加入奶粉，水溫保持在（24±1）℃，圓柱形平臺(tái)直徑為9 cm、高28 cm。水桶上緣等距離設(shè)東、南、西、北4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，4 個(gè)方向的池壁上分別懸掛不同形狀、不同顏色的幾何圖形作為實(shí)驗(yàn)小鼠學(xué)習(xí)記憶的識(shí)別物。

1.4.1 隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)

平臺(tái)位于第三象限的中央，在水面下1-2 cm，每只老鼠有60 s 的時(shí)間搜索隱藏的平臺(tái)，如在60 s 內(nèi)找到平臺(tái)，則讓其停留在平臺(tái)上15 s，若未找到平臺(tái)，引導(dǎo)其上平臺(tái)停留15 s，每天訓(xùn)練2次，連續(xù)訓(xùn)練3天，記錄逃避潛伏期。

1.4.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h，撤除平臺(tái)，小鼠由原先平臺(tái)象限對(duì)側(cè)入水。每只動(dòng)物進(jìn)行1次空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄60 s內(nèi)小鼠游泳軌跡，分析目標(biāo)象限停留時(shí)間比及游泳路程百分比。

1.5 16s RNA檢測(cè)

Morris 水迷宮檢測(cè)結(jié)束后，收集各組小鼠腸道糞便樣本，根據(jù)E.Z.N.A. soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）進(jìn)行微生物群落總DNA 抽提，提取DNA 質(zhì)量并測(cè)定其濃度和純度；使用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對(duì)16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，隨后回收PCR 產(chǎn)物，并對(duì)其進(jìn)行純化定量，利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，基于生物信息云isanger平臺(tái)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.6 取材

干預(yù)結(jié)束后，各組小鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開胸腔，灌注針頭插入左心室，剪開右心耳，0.9%生理鹽水灌注約40 mL 至右心房流出清澈液體，肝臟變白，隨后灌注4%多聚甲醛40 mL 后斷頭取腦。

1.7 免疫熒光觀察腦內(nèi)LPS表達(dá)情況

灌注后的腦組織于4%多聚甲醛4℃固定3 h，20%、30%蔗糖溶液梯度脫水，OCT 包埋，沿冠狀面行冰凍切片，厚度為6 μm。切片添加驢血清室溫封閉1 h，PBS 洗滌后加入一抗（LPS），4℃孵育過夜，PBS 洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h，加入DAPI 染液，抗熒光淬滅封片劑封片，鏡下待檢。

1.8 透射電鏡觀察皮層微血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)

取皮層腦組織剪取多個(gè)1 mm3大小組織塊，1%硝酸鑭（LaNO3）漂洗液漂洗，3%戊二醛固定液4℃前固定過夜，1%鋨酸-1% LaNO3后固定，系列乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，銅網(wǎng)行超薄切片，經(jīng)鉛染色，雙氧鈾酸復(fù)染，在透射電鏡（HITACHI-7500）下觀察腦微血管內(nèi)皮緊密連接結(jié)構(gòu)。

1.9 HE染色

將腦組織置于4%多聚甲醛中固定，隨后進(jìn)行石蠟包埋，在石蠟切片機(jī)下沿冠狀面行4 μm 切片，切片烘烤后脫蠟，蘇木素染色，鹽酸乙醇分色，蒸餾水反藍(lán)，乙醇梯度脫水，加入二甲苯，中性樹脂封片。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS軟件26.0版（SPSS，The United States）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，Morris 水迷宮逃避潛伏期、各組游速均值采用重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析，其余數(shù)據(jù)若符合正態(tài)分布并滿足方差齊性時(shí)，采用單因素ANOVA 分析，LSD 檢測(cè)法；對(duì)非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)或方差不齊的數(shù)據(jù)，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 逃避潛伏期

對(duì)照組、針刺組、益生菌組逃避潛伏期隨時(shí)間的推移呈下降趨勢(shì)，正常組逃避潛伏期下降趨勢(shì)最快，針刺組逃避潛伏期下降趨勢(shì)在2-3 天快于益生菌組，模型組無明顯變化；模型組逃避潛伏期自3-5 天顯著高于對(duì)照組（P<0.05），說明APP/PS1 小鼠存在空間學(xué)習(xí)和記憶能力障礙；較之模型組，針刺組和益生菌組自4-5 天逃避潛伏期顯著下降（P<0.05），說明小鼠空間學(xué)習(xí)能力有顯著提升。如表1所示。

表1 各組小鼠Morris水迷宮隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較（n=8）

2.1.2 目標(biāo)象限游泳距離百分比

空間探索實(shí)驗(yàn)中模型組目標(biāo)象限游泳距離百分比和時(shí)間比均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），說明APP/PS1小鼠記憶能力較差，較之模型組，針刺組和益生菌組目標(biāo)象限游泳距離百分比顯著升高（P<0.05），說明經(jīng)針刺和益生菌的治療后，小鼠的記憶能力有較大提升。如表2所示。

表2 各組小鼠Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)間比、路程比比較（n=8）

2.2 Shannon指數(shù)及門水平物種差異分析

α-多樣性用來評(píng)估APP/PS1 小鼠腸道菌群多樣性，在這里選用Shannon 指數(shù)作為參考，結(jié)果顯示，模型組Shannon 指數(shù)顯著低于對(duì)照組（P<0.05），說明模型組的物種多樣性有顯著下降；針刺組Shannon 指數(shù)顯著高于模型組（P<0.05），物種多樣性有顯著上升；物種組成上，各組小鼠的物種組成主要以擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門為主，通過比較各組變形菌門、擬桿菌門及厚壁菌門豐度，我們發(fā)現(xiàn)較之對(duì)照組，模型組變形菌門和厚壁菌門豐度顯著升高（P<0.05），擬桿菌門豐度顯著下降（P<0.05）；較之模型組，針刺組變形菌門和厚壁菌門豐度顯著下降（P<0.05），擬桿菌門豐度顯著上升（P<0.05）；此外，益生菌組變形菌門豐度顯著低于模型組（P<0.05）。如表3所示。

表3 各組小鼠Shannon指數(shù)及門水平物種豐度比較（n=6）

2.3 海馬內(nèi)LPS含量

熒光顯微鏡下所示海馬內(nèi)LPS 為紅色熒光，呈橢圓形，包圍著神經(jīng)元，對(duì)照組海馬內(nèi)未見LPS，模型組LPS 數(shù)量較多較密集，針刺組和益生菌組LPS 數(shù)量較少且較分散。如圖1所示。

圖1 各組小鼠腦內(nèi)LPS表達(dá)情況（63×）

2.4 大腦皮層微血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)

透射電鏡評(píng)估BBB 緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性。對(duì)照組血管內(nèi)皮膜完整，連續(xù)，層次較清楚，緊密連接結(jié)構(gòu)致密，基底膜完整未斷裂；模型組可見內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)開放，基底膜斷裂嚴(yán)重，邊緣模糊不清，周圍有細(xì)胞滲出，胞飲小泡增多；針刺組和益生菌組基底膜輪廓清晰完整，密度均勻，緊密連接結(jié)構(gòu)有所改善。如圖2所示。

圖2 各組小鼠血管內(nèi)皮緊密連接結(jié)構(gòu)情況（11500×）

2.5 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元表達(dá)情況

HE 染色顯示對(duì)照組CA1 區(qū)神經(jīng)元完整，排列緊密，無明顯減少，細(xì)胞核清晰；模型組CA1 區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，一部分神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞間距擴(kuò)大，細(xì)胞核變性，固縮；針刺組和益生菌組CA1 區(qū)神經(jīng)元排列及結(jié)構(gòu)較之模型組有所改善。如圖3所示。

圖3 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元表達(dá)情況（40×）

3 討論

腸道菌群紊亂（菌種多樣性的減低和菌種構(gòu)成改變）是AD 重要的病理變化之一。研究發(fā)現(xiàn)6 月齡APP/PS1小鼠革蘭氏陰性菌的豐度要顯著高于野生正常小鼠（變形菌門、螺旋桿菌）空間認(rèn)知能力已有顯著下降[23]。所以本項(xiàng)研究選用APP/PS1 小鼠作為研究模型。16s RNA 高通量測(cè)序技術(shù)廣泛運(yùn)用于腸道微生物組學(xué)研究中。菌群檢測(cè)結(jié)果顯示出，較之對(duì)照組，模型組菌群多樣性顯著降低，變形菌門和厚壁菌門豐度顯著上升，擬桿菌門豐度顯著降低。Morris 水迷宮檢測(cè)結(jié)果顯示模型組空間認(rèn)知和記憶能力顯著下降。符合AD 認(rèn)知功能下降和菌群變化的特征。既往許多證據(jù)表明益生菌能改善AD 認(rèn)知功能障礙和調(diào)節(jié)腸道菌群[38-39]，因此我們?cè)O(shè)置益生菌組作為針刺組的陽性對(duì)照。結(jié)果顯示出針刺組和益生菌組的認(rèn)知功能較之模型組有顯著改善，在對(duì)菌群的多樣性和物種構(gòu)成上也都顯示出良性調(diào)節(jié)效應(yīng)。

AD 模型動(dòng)物腸道革蘭氏陰性菌顯著增加，大大增加了LPS 的暴露概率[40]，LPS 破壞血腦屏障，導(dǎo)致大腦穩(wěn)態(tài)失衡激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生神經(jīng)炎癥反應(yīng)[41]、誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡、加速神經(jīng)退行性改變。結(jié)合研究結(jié)果來看，模型組腦內(nèi)LPS含量顯著升高，透射電鏡顯示出血腦屏障緊密連接結(jié)構(gòu)改變和基底膜的斷裂，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)排列紊亂，細(xì)胞核變性，表明AD 組存在血腦屏障破壞。針刺組和益生菌組皆能顯著降低腦內(nèi)LPS的水平，以及改善緊密連接結(jié)構(gòu)和基底膜功能，推測(cè)針刺和益生菌對(duì)血腦屏障結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)可能是通過減低LPS水平來實(shí)現(xiàn)的。

中醫(yī)認(rèn)為AD 發(fā)病的基本病機(jī)是髓海不足、神機(jī)失用，病性屬本虛標(biāo)實(shí)，本為脾腎兩虛，標(biāo)為血瘀、痰濁、風(fēng)火上擾神明[42]。針對(duì)以上病候特點(diǎn)，選用“百會(huì)”、“印堂”、“足三里”三穴。從經(jīng)絡(luò)理論來看，督脈為“陽脈之海”，其脈空虛無法上榮于腦，髓海不足，則頭昏、眩暈、健忘。百會(huì)穴居“陽位”，能夠調(diào)動(dòng)一身之陽氣，印堂穴鎮(zhèn)驚醒神，兩穴相配，能夠起到醒腦開竅、祛風(fēng)化痰、活血化瘀的治療作用。足陽明胃經(jīng)“循發(fā)跡，至額顱”，主治胃腸系統(tǒng)疾病和神志病。脾胃為后天之本，足三里穴通過健運(yùn)中焦、補(bǔ)益氣血、滋養(yǎng)腦竅以治本[43]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)足三里還具有調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力，平衡腸道菌群的作用[44]。三穴合治，反應(yīng)了腸腦并調(diào)的治療思路[45]。本項(xiàng)研究Morris 水迷宮檢測(cè)結(jié)果顯示針刺組對(duì)空間學(xué)習(xí)和記憶能力顯著提升，顯著提升腸道菌群多樣性和改變物種構(gòu)成，減少LPS負(fù)荷，調(diào)節(jié)BBB 緊密連接結(jié)構(gòu)，表明針刺調(diào)節(jié)呈現(xiàn)出整體性和多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

后續(xù)仍需擴(kuò)大樣本量，豐富菌群檢測(cè)手段來進(jìn)一步闡明針刺調(diào)節(jié)AD 血腦屏障功能的腸道菌群機(jī)制。