肝郁腎虛型不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)臨床表現(xiàn)與腸道菌群相關(guān)性研究＊

馮曉玲，涂許許

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 哈爾濱 150040）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（Recurrent spontaneous abortion，RSA）是一種常見的不良妊娠結(jié)局，影響約5%的女性。常見的病因有解剖學(xué)、染色體及內(nèi)分泌異常、感染、環(huán)境污染、自身免疫機(jī)制等，但仍有約40%-50%的RSA 病因不明，稱不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[1]。RSA 屬中醫(yī)“滑胎”范疇，而肝郁腎虛型又為其常見證型，除腎虛證表現(xiàn)外，常伴煩躁易怒、心情抑郁等癥狀。針對RSA 患者負(fù)性情緒的研究也發(fā)現(xiàn)，RSA 患者相較健康女性更易出現(xiàn)壓力、抑郁等不良情緒[2]。近年來，隨著人們對精神心理疾病發(fā)病機(jī)制研究的進(jìn)展，腸道微生物與大腦通過“腦-腸-微生物”軸雙向溝通的理論開始建立，腸道菌群的失調(diào)可能與URSA 的負(fù)性心理狀態(tài)存在一定聯(lián)系[3]，本研究通過分析未孕肝郁腎虛型URSA 患者腸道菌群特點(diǎn)及與臨床癥狀的聯(lián)系，為后續(xù)URSA 機(jī)制及治療研究提供新視角。

1 對象與方法

1.1 對象

研究對象均來自于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科門診及住院部，收集時間為2020年9月-2021年1月。研究對象包含兩組：肝郁腎虛型未孕URSA患者28 人、健康未孕女性43 人，所有受試者均簽署知情同意書，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

URSA診斷標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)共識[4]制定：①12孕周內(nèi)自然流產(chǎn)次數(shù)≥2；②夫婦雙方無遺傳性疾病，染色體正常；③生殖道解剖結(jié)構(gòu)無異常；④內(nèi)分泌正常；⑤排除自身免疫異常；⑥無支原體、衣原體及病毒等感染；⑦男方精液檢查正常。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

肝郁腎虛型滑胎的中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)按照《中醫(yī)婦科學(xué)》[5]、《中醫(yī)病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[6]制定。

（1）主癥：屢孕屢墮、如期而墮。

（2）次癥：①肝郁：胸脅、乳房、小腹脹滿或疼痛，胸悶不舒，煩躁易怒，心情抑郁；②腎虛：頭暈耳鳴，腰酸膝軟，夜尿頻，失眠健忘。

（3）舌脈：舌淡黯，苔薄黃或少苔，脈沉細(xì)弱或沉弦。

符合主癥及次癥中肝郁及腎虛癥狀各1 項及以上，結(jié)合舌脈即可診斷。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①育齡期婦女，年齡20-40 歲；②1 個月內(nèi)未服用過抗生素、微生態(tài)制劑；③簽署知情同意書；④所有組別均為漢族人群，地域無跨度差異；⑤URSA 肝郁腎虛組應(yīng)同時符合西醫(yī)及中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑥健康對照組：有至少1次正常生育史，既往無不良孕產(chǎn)史。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①患RSA有明確病因者；②合并其他疾病（如糖尿病、腫瘤、消化系統(tǒng)疾病、心、肝、腎、血液系統(tǒng)疾病及神經(jīng)精神類疾病）；③入組前已服用藥物治療者；④伴有急慢性泌尿生殖系統(tǒng)感染者；⑤妊娠及哺乳期女性。

1.5 脫落標(biāo)準(zhǔn)

①患者自行退出；②研究者令其退出（依從性差、嚴(yán)重不良事件等）。

1.6 剔除標(biāo)準(zhǔn)

①收集數(shù)據(jù)不完整者；②糞便標(biāo)本質(zhì)檢不合格者。

2 研究方法

2.1 收集資料

①收集兩組受試者一般情況（姓名、年齡、身高、體重、民族、居住地）及孕產(chǎn)史、有無既往疾病、近3 個月飲食及服藥情況。②中醫(yī)證候積分采用中醫(yī)證候分級量化表進(jìn)行記錄和評價，證候包括：胸脅、乳房、小腹脹滿或疼痛，胸悶不舒，煩躁易怒，心情抑郁，頭暈耳鳴，腰酸膝軟，夜尿頻，失眠健忘。按照無、輕、中、重分別計為0，1，2，3 分。③應(yīng)用抑郁-焦慮-壓力量表（Depression Anxiety Stress Scales，DASS）簡體中文版量表評估URSA患者焦慮、抑郁、壓力情緒，共有42個選項，患者對每一項進(jìn)行自評，打分等級從0分至3分，程度依次加重[7]。

2.2 樣本采集

收集兩組患者糞便樣本，取樣時間為6∶00-10∶00，將糞便排入采集盒或清潔的容器中，用無菌棉簽刮去表層糞便，用無菌采樣管中的取樣匙取清潔中段便約5 g，立即放入采樣管中并注明標(biāo)本信息，于-80℃冰箱中儲存。

2.3 DNA提取與檢測

總DNA 的提取用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit 試劑盒進(jìn)行，DNA 提取質(zhì)量使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA定量用紫外分光光度計完成。

2.4 PCR擴(kuò)增

使用引物341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’），擴(kuò)增V3-V4 區(qū)間序列，PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確證。在DNA提取全過程中，陰性對照采用超純水以排除PCR結(jié)果假陽性的可能。

2.5 PCR純化、定量及測序

PCR 產(chǎn)物由AMPure XT beads 純化，Qubit 定量。擴(kuò)增子池用于測序，擴(kuò)增子文庫的大小和數(shù)量評估分別采用Agilent2100生物分析儀和Illumina 的文庫定量試劑盒完成。排序在NovaSeq PE250平臺進(jìn)行。

2.6 數(shù)據(jù)處理

樣品在Illumina NovaSeq 平臺上按照制造商的建議進(jìn)行測序。根據(jù)fqtrim（v0.94）進(jìn)行質(zhì)量過濾，使用Vsearch 軟件（v2.3.4）對嵌合序列進(jìn)行過濾。利用DADA2進(jìn)行解調(diào)，得到特征表和特征序列。多樣性通過歸一化到相同的隨機(jī)序列計算。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件，應(yīng)用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，分析兩組年齡差異。Alpha 及Beta 多樣性用QIIME2 計算。采用Blast 進(jìn)行序列比對，SILVA 數(shù)據(jù)庫對特征序列進(jìn)行注釋。應(yīng)用Spearman分析豐度前30的菌群與年齡、流產(chǎn)次數(shù)及臨床指標(biāo)間關(guān)系。采用R 包（v3.5.2）實(shí)現(xiàn)圖形的繪制。

3 結(jié)果

3.1 年齡分布

肝郁腎虛組平均年齡32.71±3.15歲，正常組平均年齡31.51±2.73歲，兩組年齡間無統(tǒng)計學(xué)差異（見表1）。

表1 肝郁腎虛組與正常對照組年齡對比

3.2 Alpha及Beta多樣性分析

Alpha 多樣性體現(xiàn)了一個生態(tài)環(huán)境中生物的類群數(shù)量（豐富度）及相對豐富程度（均勻性），通過分析肝郁腎虛組與對照組Alpha 多樣性結(jié)果，兩組在各指數(shù)均未觀察到顯著差異（P≥0.05，見圖1）

圖1 Alpha多樣性分析的小提琴圖

Beta 多樣性指數(shù)用于比較不同群落中生物群落的多樣性水平，通過分析多樣性距離關(guān)系和生物群落之間分化程度，可以較好反映兩個組樣本間物種差異，PCoA中，未加權(quán)UniFrac距離強(qiáng)調(diào)了由于群落組成差異而導(dǎo)致的樣本間的差異，而加權(quán)UniFrac 距離則更強(qiáng)調(diào)了不同群落物種豐度梯度的變化，結(jié)果表明兩組菌群存在顯著性差異（P<0.05，見圖2）。

圖2 Beta多樣性分析的PCoA圖

3.3 物種分析

柱狀圖顯示了門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）在兩組中占比最大，肝郁腎虛組中擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）占比依次位于2、3、4 位，與健康對照組中放線菌門多于擬桿菌門的表現(xiàn)不同（圖3A）。屬水平上，肝郁腎虛組含量前5的菌依次為：普氏糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、巨單胞菌屬（Megamonas）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、普雷沃菌屬（Prevotella_9），而對照組為：Bifidobacterium、Faecalibacterium、Bacteroides、Megamonas、Agathobacter（圖3B）。

圖3 物種分析示意圖

對相對豐度最高的30 個樣本數(shù)據(jù)聚類后排序生成熱圖，顏色條上的值是由相應(yīng)顏色指示的兩組樣本在門、屬水平上的相對豐度（圖3C、3D）。

?；鶊D直觀體現(xiàn)了兩組在門、屬水平上對應(yīng)的物種相對豐度及比例（見圖3E）。

3.4 差異分析（LDA effect size，LEfSe）

通過Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)找到豐度差異類群，Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)判斷得到的所有亞種是否趨于同一分類級別；LDA（線性判別分析）評估每個組分豐度對差異效果的影響大小，并繪制圖形。圖4A 中圓圈的大小與分類單元的豐度成正比。紅色表示正常對照組，綠色為肝郁腎虛組，黃色為差異不顯著，圖4B中條形圖展示了兩組有顯著差異菌屬的LDA值。

圖4 LEfSe分析示意圖

3.5 菌群與臨床指標(biāo)間的聯(lián)系

應(yīng)用Spearman分析LEfSe分析中兩組差異菌群與年齡、流產(chǎn)次數(shù)、中醫(yī)證候評分、DASS-焦慮（Anxiety）、DASS-抑郁（Depression）、DASS-壓力（Stress）、DASS-總分間的關(guān)系，紅色及藍(lán)色如圖例顯示代表正、負(fù)相關(guān)，顏色越深，相關(guān)性水平越高，有統(tǒng)計學(xué)意義的項目以星號標(biāo)注，結(jié)果如圖5、6、表2、3。

圖5 年齡、流產(chǎn)次數(shù)、中醫(yī)證候評分、DASS評分與GYSX組優(yōu)勢菌群間相關(guān)性分析熱圖

圖6 年齡、流產(chǎn)次數(shù)、中醫(yī)證候評分、DASS評分與正常組優(yōu)勢菌群間相關(guān)性分析熱圖

表2 與各指標(biāo)有顯著關(guān)聯(lián)的GYSX組優(yōu)勢菌種

表3 與各指標(biāo)有顯著關(guān)聯(lián)的正常組優(yōu)勢菌種

4 討論

URSA 與中醫(yī)理論中“滑胎”、“數(shù)墮胎”含義相同，論至婦科妊娠病，病機(jī)一定以沖任損傷為要，從婦科基本理論看，肝氣郁結(jié)，疏泄功能失常，可致胞宮藏瀉無度，或肝郁化火，熱傷沖任，或妊娠血聚于下養(yǎng)胎，肝血不足，沖任經(jīng)脈血虛，不能充養(yǎng)胞宮，抑或素性抑郁、情志過急，導(dǎo)致氣分病變，影響沖任、胞宮功能，導(dǎo)致屢次墮胎。墮胎的發(fā)生損傷腎氣，而滑胎患者屢孕屢墮，腎氣益虛，而易因胎元不足而墮胎，形成惡性循環(huán)，病情遷延，久病傷絡(luò)。加之部分患者素稟腎氣虛弱，天癸不能充盈，胞宮本就虧虛，更易發(fā)生腎虛所致的滑胎。從肝腎的關(guān)系看，肝腎同源，肝血與腎精可互相化生滋養(yǎng)，但肝郁腎虛中，肝血化源不足，腎精亦不得滋養(yǎng)，而滑胎的反復(fù)發(fā)病，不僅加重情志異常，亦耗傷腎氣，加重病情。且肝腎藏泄互用，腎精虧虛，源本不足，肝亦失于疏泄，使腎精更難化生天癸而濟(jì)于沖任以養(yǎng)胞系胞。

對兩組各105例社會人口狀況相似的健康女性及RSA 患者的研究發(fā)現(xiàn)，RSA 女性的焦慮、抑郁程度明顯更高[8]，另一項訪談則顯示了RSA 患者及其伴侶的壓力和疲勞隨流產(chǎn)次數(shù)的增加而加重[9]。壓力、抑郁和焦慮是高度共病的狀態(tài)，具有重疊的生物學(xué)機(jī)制和表現(xiàn)，都被歸類為應(yīng)變穩(wěn)態(tài)（Allostasis）失衡，通過腸道微生物群-大腦軸與腸道微生物相互作用[10]。

微生物群的失調(diào)不僅影響宿主腸道內(nèi)環(huán)境的免疫，還可導(dǎo)致粘膜或全身免疫紊亂，而導(dǎo)致慢性炎癥[11]，而以輔助性T細(xì)胞（Helper T cell，Th）17及Th1占優(yōu)勢的免疫炎性狀態(tài)是URSA免疫異常的重要機(jī)制[12-13]。高脂飲食誘導(dǎo)小鼠含脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的腸道微生物群比例增加，LPS 是炎癥的誘發(fā)因子，LPS 與其受體白細(xì)胞分化抗原（Cluster of differentiation，CD）14形成復(fù)合物，并被免疫細(xì)胞表面Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）4 識別，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生非特異性慢性低度炎癥[14]。腸道菌群還可增加腸黏膜通透性，升高LPS水平，導(dǎo)致炎癥因子大量生成[15]。

在本研究中，Alpha 多樣性未觀察到顯著差異，但Beta 多樣性存在差異，因相較于Beta 多樣性，Alpha 多樣性更多的是反映群體內(nèi)部的分布情況，而不是群體物種間的差異，故此結(jié)果可說明未孕肝郁腎虛型URSA患者腸道菌群與健康未孕女性不同。

具體而言，肝郁腎虛患者門水平上擬桿菌門（Bacteroidetes）及變形菌門（Proteobacteria）顯著高于正常組，而放線菌門（Actinobacteria）水平則較正常組低。擬桿菌產(chǎn)生大量的LPS，抑制擬桿菌等產(chǎn)生LPS的細(xì)菌的生長可以保護(hù)腸道屏障功能，降低宿主炎癥水平[16]。變形桿菌具有致病代表性，如腸桿菌屬，可在特定環(huán)境中引起感染和疾病[17]。放線菌門則主要包含有益菌——雙歧桿菌，其正面效應(yīng)包括維持腸道屏障內(nèi)穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)糖類代謝、促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等[18]。

LefSe 分析提示，URSA 中擬桿菌門-普雷沃菌屬（Prevotella_2）為標(biāo)志性物種，有研究發(fā)現(xiàn)普氏菌豐度的增加與炎癥疾病有關(guān)，一些菌株表現(xiàn)出致病特性[19]，且普雷沃菌誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸中Th17細(xì)胞的產(chǎn)生[20]。而放線菌門-雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）為正常組中優(yōu)勢菌，雙歧桿菌的減少與腸道通透性的增強(qiáng)有關(guān)，從而導(dǎo)致LPS轉(zhuǎn)運(yùn)到血清中，觸發(fā)免疫系統(tǒng)激活并維持慢性炎癥[21]。本研究分析了兩組差異菌群與年齡、流產(chǎn)次數(shù)、DASS評分、中醫(yī)證候評分間的聯(lián)系。在正常組與中醫(yī)證候評分呈負(fù)相關(guān)的菌群中，雙歧桿菌數(shù)量的下降可使腸道通透性增強(qiáng)，LPS觸發(fā)免疫反應(yīng)導(dǎo)致慢性炎癥[21]，其余菌屬目前未發(fā)現(xiàn)與URSA發(fā)病機(jī)制相關(guān)的聯(lián)系。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)未孕肝郁腎虛型URSA 患者與正常健康女性腸道菌群構(gòu)成存在差異，且患者中醫(yī)證候評分與腸道菌群存在聯(lián)系。后期將擴(kuò)大樣本量，并針對其他證型及中醫(yī)藥改善腸道菌群與治療URSA間進(jìn)行進(jìn)一步研究。