茵陳蒿湯對代謝相關脂肪性肝病小鼠“腸TPH1-肝HTR2A軸”的影響＊

黃艷陽，隋國媛，趙 娜，楊關林，賈連群

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學中醫(yī)臟象理論及應用教育部重點實驗室 沈陽 110847；2. 遼寧中醫(yī)藥大學研究生學院 沈陽 110847；3. 遼寧中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院 沈陽 110847）

代謝相關脂肪性肝?。∕etabolic associated fatty liver disease，MAFLD），曾用名非酒精性脂肪性肝?。∟onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）在全球成年人中患病率為22.10%-28.65%，在中國成年人中患病率為17.95%-22.31%，且呈逐年升高趨勢[1-3]。MAFLD不僅會導致肝病殘疾和死亡，也會造成心血管疾病、糖尿病等疾病的發(fā)病率升高[4-5]。濕熱蘊結(jié)證是MAFLD 常見中醫(yī)證候[6-7]，清熱祛濕中藥茵陳蒿湯防治MAFLD 療效確切[8-9]。茵陳蒿湯最早載于《傷寒論》，茵陳具有清熱利濕、疏利肝膽功能；梔子具有清泄三焦?jié)駸峁δ埽淮簏S具有通利大便，導熱下行功能，三藥合用，濕去熱除。已有研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯可通過調(diào)控脂質(zhì)代謝、氧化應激、炎癥反應等途徑抑制MAFLD 發(fā)生發(fā)展[8]。文獻報道濕熱證與5-羥色胺（5-hydroxytrypatamine，5-HT）代謝紊亂密切相關[10]，清熱祛濕法可調(diào)控5-HT代謝紊亂[11]。體內(nèi)約95%的5-HT由腸嗜鉻細胞合成、分泌，色氨酸羥化酶1（Ryptophan hydroxylase-1，TPH1）為腸嗜鉻細胞合成5-HT 的限速酶，調(diào)控5-HT 濃度[12]。最新研究發(fā)現(xiàn)腸源性5-HT 調(diào)控5-羥色胺受體2A（5-hydroxytryptamine receptor 2A，HTR2A）介導的肝臟甘油三酯合成促進NAFLD 發(fā)生發(fā)展[12-14]。由此推斷，茵陳蒿湯可能通過此信號通路發(fā)揮防治MAFLD 作用。本研究以MAFLD 小鼠為研究對象，探討茵陳蒿湯對腸TPH1-肝HTR2A 軸的影響，為臨床中西醫(yī)結(jié)合防治MAFLD 提供新的研究策略及科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24只SPF級雄性C57BL/6J小鼠，5-6周齡，18-22 g，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號：SCXK（京）2019-0008]。通過遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥品

茵陳蒿湯的組成：茵陳18 g，梔子9 g，大黃6 g；購買于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，煎煮后生藥量為0.495 g·mL-1。

1.3 主要儀器

正置光學顯微鏡（日本尼康，Nikon Eclipse E100）；全自動生化分析儀（日本日立，型號7180）；多功能酶標儀（Thermo 公司，型號1510）；實時熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司，型號7500）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號Tanon-5200）。

1.4 主要試劑

TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST 測定試劑盒（上?？迫A生物工程股份有限公司提供，產(chǎn)品批號分別為202110412、202202012、20210612、20210312、20210422、20210512）；蘇木素-伊紅染液（Servicebio 提供，產(chǎn)品貨號為G1003）；RT-qPCR 試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，產(chǎn)品貨號為CW2601M）；PKC-ε 抗體（武漢三鷹，20877-1-AP）；HTR2A、SREBP-1c 抗體（absin 公司提供，產(chǎn)品貨號分別為abs120613、abs152294）；TPH1、SERT、GPAT1 抗體（Bioss 公司提供，產(chǎn)品貨號bs-1215R、bs-1893R、bs-5063R）。

1.5 模型制備、分組及給藥方式

24 只小鼠隨機分為對照組、模型組和茵陳蒿湯組，每組8只。對照組給予基礎飼料，模型組及茵陳蒿湯組給予高脂飼料[小黍有泰（北京）生物科技有限公司提供，產(chǎn)品貨號：2021070030]。前期研究表明茵陳蒿湯中劑量（按實驗動物與人體體表面積比等效量計算動物等效劑量）改善MAFLD 優(yōu)于低劑量和高劑量，高劑量茵陳蒿湯可增加肝毒性[15-16]，因此本研究選用茵陳蒿湯中劑量。12周后灌胃給藥，茵陳蒿湯組給予茵陳蒿湯（每天0.3 mL）灌胃，正常組與模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，灌胃4周。

1.6 指標檢測

1.6.1 血脂和肝功能檢測

采用隨機數(shù)表法每組選取6只小鼠。全自動生化分析儀對血清TC、TG、AST、ALT、LDL-C、HDL-C 含量進行檢測。

1.6.2 肝臟組織HE染色

4%多聚甲醛固定肝臟組織24 h 以上，石蠟切片脫蠟至水、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片、顯微鏡鏡檢后采集圖像進行分析。

1.6.3 肝臟組織油紅O染色

取小鼠肝臟組織制備新鮮冰凍切片后固定，切片入油紅染液浸8-10min（加蓋避光）染色，依次浸入兩缸60%異丙醇各3 s、5 s 分化，兩次純水浸洗，取出切片停留3 s 后浸入蘇木素復染3-5 min，三次浸洗，各5 s、10 s、30 s。60%乙醇為溶劑分化2-8s，2 缸蒸餾水水洗各10 s，返藍液返藍1 s，純水浸洗2次，各5 s、10 s，甘油明膠封片劑封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.6.4 ELISA法檢測含量

采用隨機數(shù)表法每組選取6只小鼠。根據(jù)試劑盒說明書檢測小鼠血清5-HT、肝臟TC、TG、二?；视停╠iacylglycerol，DAG）、磷脂酶C（phospholipase C，PLC）含量。

1.6.5 Western blot檢測蛋白表達情況

采用隨機數(shù)表法每組選取3 只小鼠，檢測小腸TPH1、5- 羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白（Serotonin reuptake transporter，SERT）及肝臟HTR2A、蛋白激酶C-ε（Protein kinase C-Epsilon，PKC-ε）、磷酸化磷脂肌醇3激酶（Phosphorylated phosphoinositide 3-kinase，PPI3K）、磷酸化蛋白激酶B（Phosphorylated protein kinase B，P-AKT）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（Phosphorylated mammalian target of rapamycin，PmTOR）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（Sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）、甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶1（Glycerol-3-phosphate acyltransferase 1，GPAT1）、脂肪酸合酶（Fattsynthase，F(xiàn)ASN）。稱取小鼠肝臟組織0.1 g 后，加入1 mL 含PMSF 的RIPA 裂解液，于冰上充分研磨后，冰上靜置30 min，離心取上清。使用BCA 試劑盒檢測各組蛋白濃度后，制備樣品，計算出每個樣本的上樣體積后進行電泳操作。電泳后，封閉，一抗4℃孵育過夜，洗膜，二抗，洗膜，曝光，分析灰度值。

1.6.6 RT-qPCR檢測mRNA水平

采用隨機數(shù)表法每組選取6 只小鼠，檢測小腸TPH1、SERT 及肝臟HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA水平。稱取小鼠肝臟組織0.1 g后，TRIzol法提取總RNA，測定RNA 濃度，稀釋為200 ng·μL-1后，在冰上配置反應體系后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照說明書采用SYBR Green 進行實時熒光PCR。結(jié)果用△△Ct 法進行相對定量分析，用2-△△Ct表示。引物序列見表1。

1.6.7 統(tǒng)計學方法

應用Prism 8.4.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料結(jié)果以均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用ANOVA分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝臟HE和油紅O染色病理特征

由圖1所示，對照組肝細胞排列整齊，無明顯脂肪變性；模型組肝細胞體積腫脹，有明顯脂肪變性；與模型組比，茵陳蒿湯組肝細胞脂肪變性顯著減少。由圖2所示，相較于對照組，模型組肝臟脂質(zhì)沉積顯著升高，茵陳蒿湯顯著改善肝臟脂質(zhì)沉積。

圖1 各組小鼠肝臟HE染色結(jié)果（200×）

圖2 各組小鼠肝臟油紅O染色結(jié)果（200×）

2.2 各組小鼠肝臟TC、TG、DAG、PLC含量

由表2 所示，相較于對照組，模型組肝臟TG 和TC水平顯著升高（P<0.05）；相較于模型組，茵陳蒿湯組肝臟TG和TC水平顯著降低（P<0.05）。

表2 各組小鼠肝臟TC、TG、DAG、PLC含量（±s，n=6）

表2 各組小鼠肝臟TC、TG、DAG、PLC含量（±s，n=6）

注：與對照組比，*P<0.05；與模型組比，#P<0.05。

PLC 42.95±0.45 52.86±1.46*47.20±1.08#組別對照組模型組茵陳蒿湯組TG（mmol·L-1）0.08±0.03 0.26±0.12*0.14±0.04#TC（mmol·gprot-1）0.02±0.003 0.03±0.012*0.02±0.004#DAG（ng·mL-1）17.72±0.41 21.56±1.99*18.20±1.14#

2.3 各組小鼠肝功能、血脂水平

由表3 所示，相較于對照組，模型組血清AST、ALT、HDL-C、LDL-C、TG、TC 水平顯著升高（P<0.05）；相較于模型組，茵陳蒿湯組血清AST、ALT、LDL-C、TG水平顯著降低（P<0.05）。

表3 各組小鼠肝功能、血脂特征（±s，n=6）

表3 各組小鼠肝功能、血脂特征（±s，n=6）

注：與對照組比，*P<0.05；與模型組比，#P<0.05。

TC（mmol·L-1）)2.67±0.53 4.13±0.42*4.09±0.43*組別對照組模型組茵陳蒿湯組AST（U·L-1）94.07±27.08 165.30±40.31*89.20±13.73#ALT（U·L-1）35.05±5.94 45.90±12.60*29.57±3.69#HDL-C（mmol·L-1）1.42±0.35 2.15±0.20*2.20±0.22*LDL-C（mmol·L-1）0.20±0.05 0.27±0.04*0.22±0.03#TG（mmol·L-1）0.95±0.24 1.16±0.10*0.84±0.15#

2.4 各組小鼠血清5-HT含量比較

由表4 所示，相較于對照組，模型組血清5-HT 水平顯著升高（P<0.05）；與相較于模型組，茵陳蒿湯組血清5-HT水平顯著降低（P<0.05）。

表4 各組小鼠血清5-HT特征（±s，n=6）

表4 各組小鼠血清5-HT特征（±s，n=6）

注：與對照組比，*P<0.05；與模型組比，#P<0.05。

5-HT（ng·mL-1）234.49±12.53 261.62±22.95*224.43±9.94#組別對照組模型組茵陳蒿湯組

2.5 各組小鼠小腸TPH1、SERT mRNA水平

由表5 所示，相較于對照組，模型組小鼠小腸TPH1 mRNA 表達水平顯著升高，SERT mRNA 表達水平顯著降低（P<0.05）；茵陳蒿湯干預后，相較于模型組，小腸TPH1 mRNA表達水平顯著降低，SERT mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）。

表5 各組小鼠小腸TPH1、SERT mRNA水平（±s，n=6）

表5 各組小鼠小腸TPH1、SERT mRNA水平（±s，n=6）

注：與對照組比，*P<0.05；與模型組比，#P<0.05。

SERT 1.000±0.000 0.550±0.210*0.928±0.058#組別對照組模型組茵陳蒿湯組TPH1 1.000±0.00 1.573±0.045*1.292±0.070#

2.6 各組小鼠肝臟HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA水平

由表6 所示，相較于對照組，模型組小鼠肝臟HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA 表達水平顯著升高（P<0.05）；茵陳蒿湯干預后，HTR2A、SREBP-1C、GPAT1、FASN mRNA表達水平顯著降低（P<0.05）。

表6 各組小鼠肝臟HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA水平（±s，n=6）

表6 各組小鼠肝臟HTR2A、SREBP-1c、GPAT1、FASN mRNA水平（±s，n=6）

注：與對照組比，*P<0.05；與模型組比，#P<0.05。

FASN 1.000±0.000 3.000±0.373*2.063±0.325#組別對照組模型組茵陳蒿湯組HTR2A 1.000±0.000 2.770±0.245*2.052±0.207#SREBP-1c 1.00±0.000 3.576±0.830*2.150±0.202#GPAT1 1.000±0.00 2.400±0.589*1.480±0.150#

2.7 各組小鼠小腸TPH1、SERT蛋白表達

由圖3 和表7 所示，相較于對照組，模型組小鼠肝臟TPH1 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），SERT 蛋白表達水平顯著下降（P<0.05）；茵陳蒿湯干預后，肝臟TPH1 蛋白表達水平顯著下降（P<0.05），SERT 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。

圖3 各組小鼠小腸TPH1、SERT表達水平

表7 各組小鼠TPH1、SERT蛋白含量（±s，n=6）

表7 各組小鼠TPH1、SERT蛋白含量（±s，n=6）

注：與對照組比，*P<0.05；與模型組比，#P<0.05。

組別對照組模型組茵陳蒿湯組TPH1 0.94±0.013 1.18±0.008*1.01±0.008#SERT 1.13±0.100 0.93±0.130*1.03±0.130#

2.8 各組小鼠肝臟HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN蛋白表達

由圖4 和表8 所示，相較于對照組，模型組小鼠肝臟 HTR2A、PKC- ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）；茵陳蒿湯干預后，肝臟HTR2A、PKC-ε、PPI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN 蛋白表達水平顯著下降（P<0.05）。

圖4 各組小鼠肝臟HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN表達水平

表8 各組小鼠肝臟HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN蛋白含量（±s，n=6）

表8 各組小鼠肝臟HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN蛋白含量（±s，n=6）

注：與對照組比，*P<0.05；與模型組比，#P<0.05。

組別對照組模型組茵陳蒿湯組HTR2A 0.59±0.018 0.75±0.006*0.64±0.010#PKC-ε 0.91±0.016 1.28±0.018*1.18±0.013#P-PI3K 1.06±0.020 1.45±0.012*1.24±0.020#P-AKT 0.91±0.013 1.21±0.019*1.11±0.017#P-mTOR 0.90±0.015 1.10±0.012*1.00±0.017*SREBP-1c 0.64±0.006 0.98±0.006*0.85±0.012#GPAT1 0.64±0.038 1.00±0.078*0.81±0.017#FASN 0.97±0.002 1.25±0.012*1.07±0.006#

3 討論

《濕熱病篇》云：“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱”。濕熱蘊結(jié)脾胃，阻礙中焦氣機，氣機升降失和，肝失疏泄，氣血精津郁而變生他邪，由此可致肝系病證。MAFLD 發(fā)病多因勞逸失度、飲食失節(jié)、稟賦不足、情志失調(diào)、久病體虛等因素導致脾胃運化失調(diào)，濕熱內(nèi)生，氣機升降失和，津血不行，化生濁毒閉阻肝臟[17]。清熱祛濕中藥茵陳蒿湯方中茵陳為君，歸脾、胃、肝、膽經(jīng)；梔子為臣，歸肝、肺、胃、心、三焦經(jīng)；大黃為佐，歸胃、大腸、肝經(jīng)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯具有調(diào)節(jié)血脂、保肝利膽等作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組小鼠肝細胞體積腫脹，有明顯脂肪變性，血清AST、ALT、LDL-C、TG、TC水平顯著升高，肝臟TG、TC 水平顯著升高，表明造模較為成功。與模型組比較，茵陳蒿湯組肝細胞脂肪變性顯著減少，血清AST、ALT、LDL-C、TG 水平顯著降低，肝臟TG、TC水平顯著降低，提示茵陳蒿湯可有效改善MAFLD。

臨床和動物研究表明5-HT 是MAFLD 的獨立危險因素[19-21]。5-HT 產(chǎn)生受到色氨酸和TPH 的調(diào)節(jié)[22]，SERT 可以將其從間質(zhì)空間攝取到上皮細胞終止其作用，降低SERT 的表達會減少5-HT 的滅活，蓄積的5-HT 可能會促進MAFLD 的發(fā)展。腸道特異性Tph1 基因敲除可抑制腸源性5-HT 合成，調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝，5-HT 可分為中樞5-HT 與外周5-HT，二者的調(diào)控互不影響，體內(nèi)約95%的5-HT 由外周腸嗜鉻細胞合成分泌[20]。已有研究發(fā)現(xiàn)5-HT可促進肝臟TG合成[23-25]，5-HT合成抑制劑可顯著改善高脂飲食誘導的肝臟TG蓄積[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組血清5-HT、小腸TPH1以及肝臟TG水平顯著升高，小腸SERT水平顯著降低；與模型組比，茵陳蒿湯組血清5-HT、小腸TPH1 以及肝臟TG 水平顯著降低，小腸SERT 水平顯著升高，由此可見，茵陳蒿湯可能通過調(diào)控5-HT降低肝臟TG合成抑制MAFLD發(fā)生發(fā)展。

最新研究發(fā)現(xiàn)腸源性5-HT 調(diào)控HTR2A 介導的肝臟TG合成促進NAFLD發(fā)生發(fā)展[13-14]。5-HT受體的7 個亞家族中除5-HT3 受體外，其余均屬于G 蛋白偶聯(lián)受體超家族[26]。HTR2A 作為5-HT 受體之一，是5-HT 調(diào)控肝臟TG 合成促進MAFLD 發(fā)生發(fā)展的關鍵因子[13]。肝臟特異性HTR2A 基因敲除小鼠可顯著抑制高脂飲食誘導的肝臟TG 蓄積，HTR2A 拮抗劑顯著抑制5-HT 誘導的肝細胞TG 蓄積[12-13]。HTR2A 可通過DAG 啟動PKC-ε 從而誘導肝臟TG 的合成，DAG 和PKC 被認為是具有信號傳導功能的因子，DAG 是PKC的變構激活劑[27]。在MAFLD 大鼠模型中PKC-ε 的表達與PI3K的表達呈負相關，與肝脂肪變性的程度呈正相關[28]。DAG 在肝臟中的積累會導致PKC-ε 的激活從而降低PI3K 的含量，PI3K/AKT/mTOR 信號通路在肝臟脂代謝的平衡過程中起重要作用，PI3K 可以激活AKT 使之磷酸化，進而磷酸化其下游的mTOR 復合物1，激活主要的脂肪生成調(diào)節(jié)因子SREBP-1c，調(diào)控FFA、TG 代謝[29-31]。主要在肝臟和脂肪細胞中表達的SREBP-1c，是參與TG 合成基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，SREBP-1c 過度表達會增加肝臟TG 合成[32]。SREBP-1c 是GPAT1 的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，GPAT1 啟動子區(qū)含有SREBP-1c的結(jié)合位點，SREBP-1c過表達可促進GPAT1 表達[32]。GPATs 作為TG 合成的限速酶，催化磷酸甘油與一分子脂酰輔酶A 生成1-脂?；视?3-磷酸，是TG 生物合成的起始步驟[33]。目前發(fā)現(xiàn)在哺乳動物體內(nèi)有4 種亞型，其中GPAT1 定位于線粒體外膜，其在肝臟和脂肪組織中高表達，基因過表達和敲除實驗均表明GPAT1 在NAFLD 發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[34]。FASN 存在于胞質(zhì)中，且FASN 的啟動子區(qū)也存在SREBP-1c 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，在SREBP-1c 與其結(jié)合后，可以直接調(diào)控促進脂肪酸的從頭合成途徑，即由乙酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 從頭合成棕櫚酸脂的催化步驟，促進肝細胞內(nèi)脂質(zhì)大量堆積從而促進MAFLD 的發(fā)生發(fā)展[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組比，模型組小鼠肝臟HTR2A、PKC-ε、P-PI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN 蛋白表達水平顯著升高；茵陳蒿湯干預后HTR2A、PKC-ε、PPI3K、P-AKT、P-mTOR、SREBP-1c、GPAT1、FASN 蛋白表達水平顯著降低。由此可見，茵陳蒿湯可能通過調(diào)控5-HT/HTR2A信號通路降低肝臟TG合成。

綜上所述，茵陳蒿湯可通過腸TPH1-肝HTR2A軸抑制肝臟TG 合成進而改善MAFLD，為臨床中西醫(yī)結(jié)合防治MAFLD提供新的研究策略及科學依據(jù)。