新型鵝星狀病毒ORF2蛋白納米抗體的篩選及鑒定

王丹，吉艷紅，梁世蕊，楊潔，朱啟運(yùn)

新型鵝星狀病毒ORF2蛋白納米抗體的篩選及鑒定

王丹，吉艷紅，梁世蕊，楊潔，朱啟運(yùn)

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046

【目的】由新型鵝星狀病毒（novel goose astrovirus, nGAstV）引起的雛鵝痛風(fēng)病對(duì)我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。通過構(gòu)建nGAstV納米抗體（nanobody, Nb）噬菌體展示文庫，獲得識(shí)別nGAstV ORF2蛋白的特異性Nb，可為建立nGAstV抗體檢測(cè)方法及研究nGAstV ORF2蛋白結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。【方法】使用蔗糖密度梯度離心方法純化在LMH細(xì)胞中增殖的nGAstV，RT-PCR鑒定nGAstV并通過細(xì)胞病變測(cè)定nGAstV滴度。用0.06%甲醛溶液滅活純化的nGAstV作為免疫原，免疫兩周歲羊駝。首次免疫時(shí)用滅活純化的nGAstV與等量弗氏完全佐劑乳化后免疫，第2—5次免疫用滅活純化的nGAstV與等量弗氏不完全佐劑乳化。每間隔兩周免疫一次，每次免疫劑量均為50 μg。第5次免疫14 d后，通過間接ELISA方法測(cè)定羊駝血清中針對(duì)nGAstV的IgG抗體效價(jià)。待IgG抗體效價(jià)達(dá)到構(gòu)建噬菌體抗體展示文庫標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，分離羊駝外周血淋巴細(xì)胞（peripheral blood lymphocyte, PBL），然后提取PBL總RNA將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用巢氏PCR方法擴(kuò)增重鏈抗體重鏈可變區(qū)（variable domain of the heavy chain of heavy chain antibodies, VHH）基因，將其構(gòu)建至pComb噬菌體載體并結(jié)合噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建nGAstV Nb噬菌體展示文庫，計(jì)算該文庫庫容量并分析其多樣性。nGAstV作為靶抗原，通過三輪富集淘選初步獲得與nGAstV反應(yīng)的重組噬菌體Nb陽性克隆，將其克隆至pcDNA3.1-Fc真核表達(dá)載體并進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序成功且序列不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293F細(xì)胞中表達(dá)，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定表達(dá)情況。以nGAstV為靶標(biāo)抗原，利用間接ELISA方法和Western blot試驗(yàn)對(duì)表達(dá)成功的Nb進(jìn)行特異性、反應(yīng)活性驗(yàn)證，并以nGAstV ORF2蛋白為靶標(biāo)抗原，利用間接ELISA方法對(duì)Nb進(jìn)行親和力驗(yàn)證，獲得生物學(xué)活性較好的Nb。【結(jié)果】 RT-PCR結(jié)果顯示，nGAstV增殖成功；Reed-Muench法分析nGAstV滴度達(dá)4.38 Log10TCID50/mL。羊駝經(jīng)5次免疫nGAstV后，通過間接ELISA方法測(cè)得其血清中針對(duì)nGAstV的抗體效價(jià)達(dá)到1:64 000；利用巢氏PCR方法擴(kuò)增出并成功構(gòu)建庫容量為3.8×108CFU/mL的nGAstV Nb噬菌體展示文庫；遺傳進(jìn)化樹分析顯示，該噬菌體Nb庫多樣性良好。三輪富集淘選后，初步獲得39株與nGAstV反應(yīng)的重組噬菌體納米抗體陽性克隆，其中有25株序列不同；SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，共有10株Nb在HEK-293F細(xì)胞中表達(dá)成功。通過ELISA、Western blot驗(yàn)證進(jìn)一步獲得8株與nGAstV ORF2蛋白特異性反應(yīng)的Nb，且1株Nb生物學(xué)活性最好?！窘Y(jié)論】首次篩選到與nGAstV ORF2蛋白特異性反應(yīng)的Nb，為nGAstV的基礎(chǔ)研究和檢測(cè)方法提供材料。

新型鵝星狀病毒；ORF2蛋白；納米抗體；噬菌體展示技術(shù)

0 引言

【研究意義】星狀病毒病是由星狀病毒（astrovirus, AstV）引起的一種能感染哺乳動(dòng)物和禽類的傳染病，主要引起人、豬、牛等腦炎和胃腸炎[1-2]及禽類發(fā)育遲緩、腎炎、病毒性肝炎等癥狀[3]，對(duì)人類健康和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重威脅。近年來，新型鵝星狀病毒（novel goose astrovirus, nGAstV）成為危害我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)的重要病毒性傳染病病原之一[4]，感染后可導(dǎo)致3周齡內(nèi)的雛鵝出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、腹瀉及生長(zhǎng)受限等臨床癥狀，剖檢可見腎臟腫脹、出血、關(guān)節(jié)及內(nèi)臟器官尿酸鹽沉積，病死率高達(dá)50%[5]。nGAstV引起的高致死性內(nèi)臟痛風(fēng)病已對(duì)我國(guó)部分地區(qū)商品雛鵝群造成巨大沖擊，嚴(yán)重制約了養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展。至今，nGAstV引致痛風(fēng)病的防治不僅無商品化疫苗和臨床藥物，而且尚無市售商品化血清學(xué)檢測(cè)試劑盒，缺乏有效的流行病學(xué)調(diào)查手段，常導(dǎo)致臨床處置遲滯，造成經(jīng)濟(jì)損失不斷擴(kuò)大。1993年，HAMERS等首次報(bào)道了駱駝體內(nèi)天然存在的一種新型抗體[6]，該抗體缺失輕鏈、重鏈第一恒定區(qū)，被稱為重鏈抗體（heavy chain antibody, HCAb）。研究發(fā)現(xiàn)，HCAb廣泛存在于駝科動(dòng)物體內(nèi)，如駱駝、羊駝等[7]。此外，在一些軟骨魚類也發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)類似的HCAb，稱為新抗原受體（new antigen receptor, NAR）[8]。通過克隆HCAb的重鏈可變區(qū)（variable domain of the heavy chain, VH）可以獲得單域抗體，相對(duì)分子質(zhì)量約15 kDa左右，因此又稱為納米抗體（nanobody, Nb）[9]。與常規(guī)抗體相比，Nb在駝科動(dòng)物體內(nèi)親和成熟，對(duì)特異性靶抗原具有高親和力，且在缺少輕鏈的情況下功能仍保持完整[10]。Nb因穩(wěn)定、特異及易于改造等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于免疫診斷、靶向治療及科學(xué)研究等眾多領(lǐng)域[11-12]。Nb篩選多采用噬菌體展示技術(shù)，與常規(guī)抗體制備方法相比，該技術(shù)具有高通量、低成本、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。目前，針對(duì)nGAstV Nb的相關(guān)研究尚未報(bào)道。【前人研究進(jìn)展】 nGAstV于2016年在雛鵝病例中首次被發(fā)現(xiàn)，后被國(guó)際病毒分類委員會(huì)（The International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV）確定屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬[15]。nGAstV基因組全長(zhǎng)約7.0 kb，其結(jié)構(gòu)包括兩端的5′非編碼區(qū)（UTR）和3′非編碼區(qū)（UTR）、ORF1a，ORF1b和ORF2三個(gè)開放閱讀框及多聚腺苷酸（Poly A）尾[16-17]。ORF1a編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein, NSP），ORF1b編碼病毒RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase, RdRp），二者存在的重疊區(qū)在RdRp的翻譯中發(fā)揮作用[18]。ORF2閱讀框編碼的病毒衣殼蛋白，參與病毒的吸附和復(fù)制，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[19]。因此，ORF2蛋白是理想的診斷靶標(biāo)，孫敏等制備了nGAstV ORF2蛋白的單克隆抗體，建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法雖然可用于nGAstV抗體的檢測(cè)[20]，但目前還未能開發(fā)出相應(yīng)試劑盒。此外，研究nGAstV抗原表位是明確雛鵝痛風(fēng)病致病機(jī)制、研發(fā)治療藥物和生物制品的基礎(chǔ)，REN等制備的ORF2蛋白MAb鑒定出了部分抗原表位區(qū)域[21-22]。本研究將制備特異性識(shí)別ORF2蛋白的Nb，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ORF2蛋白的隱匿抗原表位和研制nGAstV ORF2蛋白相關(guān)抗體藥物及研發(fā)相應(yīng)診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。【本研究切入點(diǎn)】以nGAstV為研究對(duì)象，利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建nGAstV Nb噬菌體展示文庫，篩選生物學(xué)活性較好的nGAstV Nb。【擬解決的關(guān)鍵問題】篩選出nGAstV Nb并鑒定其生物學(xué)活性，為后續(xù)nGAstV的研究和應(yīng)用提供材料支持。

1 材料與方法

主要試驗(yàn)工作于2022年2—12月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、病毒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

pComb噬菌體載體、pcDNA3.1真核表達(dá)載體、新型鵝星狀病毒（nGAstV）、雞肝癌細(xì)胞（LMH）和人胚胎腎細(xì)胞293F（HEK-293F）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物病毒分子生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存；BL21和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購于大連寶生物工程有限公司；ss320感受態(tài)細(xì)胞、M13輔助噬菌體購自NEB公司；羊駝購于甘肅省武威市。

1.2 主要試劑

高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購于美國(guó)NEB公司；DNA Marker、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和dNTP購于TaKaRa公司；瓊脂糖購于Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購于Promega公司；Protein A純化介質(zhì)購于伯格隆生物公司；RNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購于OMEGA公司；外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒購于索萊寶公司；HRP標(biāo)記的鼠抗M13抗體、HRP標(biāo)記的羊抗人IgG-Fc抗體購于北京義翹神州科技股份有限公司；DMEM、293F培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶（0.05% EDTA）購于GIBCO公司。

1.3 nGAstV增殖及TCID50測(cè)定

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)LMH細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，接種nGAstV培養(yǎng)3—5 d后，8 000 r/min離心10 min收集病毒上清。0.22 μm濾器無菌過濾病毒上清，與PEG8000溶液2﹕1混合，冰上靜置1 h。靜置后，將混合液2 000×，離心2 h，用適量PBS溶解沉淀。過濾除菌20%、30%、50%的蔗糖溶液，將重懸的病毒進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，并取部分病毒進(jìn)行PCR鑒定，引物信息見表1。將LMH細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，nGAstV按10-1—10-8進(jìn)行倍比稀釋后加入LMH細(xì)胞，每個(gè)稀釋度做5個(gè)重復(fù)，每孔100 μL，感染72 h后觀察細(xì)胞病變，計(jì)算TCID50。

表1 鑒定引物

1.4 羊駝免疫及抗體效價(jià)檢測(cè)

參考張春玲等[23]的方法，使用0.06%甲醛溶液滅活純化的nGAstV作為免疫原，免疫兩周歲雄性羊駝。首次免疫羊駝時(shí)，將50 μg滅活純化的nGAstV與等量弗氏完全佐劑乳化。第2—5次免疫時(shí)，將50 μg滅活純化的nGAstV與等量的弗氏不完全佐劑乳化。免疫方式均采取頸部皮下多點(diǎn)注射，免疫間隔為14 d。第五次免疫14 d后采血，分離血清作為檢測(cè)抗體，純化的nGAstV 100 ng/孔包被ELISA板，HRP標(biāo)記的Goat Anti-Alpaca IgG作為酶標(biāo)二抗,采用間接ELISA方法測(cè)定羊駝血清中nGAstV的抗體效價(jià)，通過陽性O(shè)D450nm值/陰性O(shè)D450nm值≥2.1（P/N≥2.1）判讀為陽性。當(dāng)抗體效價(jià)高于1﹕64 000，符合建庫標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 M13噬菌體抗體庫構(gòu)建及多樣性測(cè)定

分離羊駝外周血淋巴細(xì)胞（peripheral blood lymphocyte, PBL），提取PBL總RNA將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用巢氏PCR方法擴(kuò)增片段，引物信息見表2；將與pComb噬菌體載體通過同源重組連接，電轉(zhuǎn)化至SS320感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入SOC培養(yǎng)基，220 r/min，37℃培養(yǎng)1 h，取部分培養(yǎng)物滴涂Amp-Kan平板，挑取12個(gè)單克隆進(jìn)行PCR鑒定，引物信息見表3；將陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，分析抗體庫的多樣性并計(jì)算抗體庫容量；剩余培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入Amp-Kan培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，使用PEG/NaCl濃縮獲得原始抗體文庫。

表2 巢式PCR引物

表3 鑒定引物

1.6 nGAstV特異性重組噬菌體的富集與淘選

用滅活純化的nGAstV 1 μg/孔包被ELISA板，設(shè)置1%聚乙烯醇（1% PVA）為無抗原對(duì)照，每孔加入100 μL原始抗體庫后室溫孵育2 h，棄液；加入0.1 mol·L-1HCl洗脫5 min，等體積Tris-HCl中和；將洗脫液加入對(duì)數(shù)期NEB5aF’細(xì)菌中，200 r/min，37℃培養(yǎng)1 h，M13輔助噬菌體拯救1 h；取適量菌液10倍稀釋并滴定平板；剩余菌液過夜培養(yǎng)，濃縮后獲得第一輪噬菌體Nb展示文庫；重復(fù)上述操作，共進(jìn)行三輪淘選。選用第三輪噬菌體Nb庫稀釋涂板，37℃過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取90個(gè)單克隆，接種于Amp-Kan培養(yǎng)基，200 r/min，37℃過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)菌液4 000×離心10 min，收集上清作為檢測(cè)一抗，滅活純化的nGAstV作為酶標(biāo)抗原，100 ng/孔包被ELISA板，HRP標(biāo)記的鼠抗M13抗體（1﹕6 000稀釋）為酶標(biāo)二抗，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，通過陽性O(shè)D450nm值/陰性O(shè)D450nm值≥2.1（P/N≥2.1）判讀為陽性，可以初步確定與nGAstV反應(yīng)的陽性克隆。

1.7 重組Nb序列分析及表達(dá)

將上述反應(yīng)為陽性的菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物信息見表4，連接至pcDNA3.1-Fc真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Amp平板，隨機(jī)挑取1—2個(gè)單菌落，提取質(zhì)粒測(cè)序并分析序列。將序列不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293F細(xì)胞表達(dá)，利用Protein A純化目的抗體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析結(jié)果。

表4 擴(kuò)增引物

1.8 重組Nb的反應(yīng)活性鑒定

用nGAstV包被酶標(biāo)板，同時(shí)設(shè)置LMH細(xì)胞對(duì)照及空白對(duì)照，37℃孵育2 h，PBST洗滌3次；5%脫脂乳37℃封閉1 h，分別加入純化的Nb（1﹕1 000稀釋），37℃孵育2 h；加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgG-Fc（1﹕8 000稀釋）37℃孵育0.5 h，PBST洗滌3次；加入TMB顯色液，反應(yīng)10 min；加入終止液后進(jìn)行OD50nm值測(cè)定，通過陽性O(shè)D450nm值/陰性O(shè)D50nm值≥2.1（P/N≥2.1），判讀為陽性，確定與nGAstV反應(yīng)的Nb。

1.9 重組Nb的特異性鑒定

將nGAstV及nGAstV ORF2蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，分別設(shè)置滅活新城疫病毒（NDV）、滅活H9N2亞型禽流感病毒（H9N2 AIV）和NDV F蛋白為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂乳室溫封閉1 h，將上述純化的Nb（1﹕200稀釋）作為檢測(cè)一抗，HRP標(biāo)記的羊抗人IgG-Fc（1﹕8 000稀釋）作為酶標(biāo)二抗，進(jìn)行蛋白免疫印跡試驗(yàn)。

1.10 重組Nb的親和力鑒定

用nGAstV ORF2蛋白包被酶標(biāo)板，4℃孵育12 h，PBST洗滌3次；5%脫脂乳37℃封閉1 h，加入梯度稀釋后的Nb，37℃反應(yīng)2 h；加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgG-Fc（1﹕8 000稀釋）37℃孵育0.5 h；PBST洗滌3次后，加入TMB顯色液，反應(yīng)10 min；加入終止液后進(jìn)行OD450nm值測(cè)定，通過EC50Calculator軟件計(jì)算EC50。

2 結(jié)果

2.1 nGAstV 純化及增殖

提取純化后病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進(jìn)行nGAstV PCR鑒定，目的條帶約為1 000 bp，與預(yù)期目的片段大小一致（圖1-A），證明nGAstV純化成功；用nGAstV感染LMH細(xì)胞，72 h后觀察到LMH細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變（圖1-B），證明nGAstV增殖成功；根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID50數(shù)值：4.38 Log10TCID50/mL。

A：nGAstV PCR鑒定（M：DL2000 Marker；1：nGAstV）；B：nGAstV感染LMH細(xì)胞病變結(jié)果

2.2 羊駝免疫血清抗體效價(jià)檢測(cè)

使用間接ELISA檢測(cè)方法，測(cè)得第五次免疫后羊駝血清中針對(duì)nGAstV產(chǎn)生的抗體效價(jià)達(dá)到1﹕64 000（圖2），可以進(jìn)行nGAstV Nb噬菌體展示文庫的構(gòu)建。

2.3 M13噬菌體抗體庫構(gòu)建鑒定

提取PBL總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此作為模板，第一輪PCR擴(kuò)增得到約600 bp目的條帶（圖3-A），膠回收進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增得到約400 bp目的條帶（圖3-B）；將VHH基因克隆至pComb噬菌體載體獲得原始抗體庫，挑取12個(gè)單克隆PCR鑒定，獲得約500 bp目的條帶（圖3-C），即連接效率為100%，原始抗體庫庫容量為3.8×108CFU/mL；進(jìn)化樹分析顯示（圖3-D），8個(gè)VHH序列均不相同，表明構(gòu)建的Nb噬菌體展示文庫多樣性較好，可以進(jìn)行下一步淘選。

2.4 特異性重組噬菌體的富集淘選

以nGAstV為靶標(biāo)抗原進(jìn)行3輪淘選，與無抗原對(duì)照相比（圖4-A），在10-4處特異性重組噬菌體明顯富集；隨機(jī)挑取90個(gè)單克隆，培養(yǎng)后進(jìn)行ELISA檢測(cè)，設(shè)置無抗原對(duì)照，根據(jù)P/N≥2.1判讀為陽性，共獲得39個(gè)陽性克隆（圖4-B）。

圖2 羊駝血清抗體效價(jià)測(cè)定

A：第一輪PCR的結(jié)果（M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：IgG）；B：第二輪PCR的結(jié)果（M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：VHH）；C：PCR鑒定文庫連接效率（M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1—12：原庫質(zhì)粒）；D：進(jìn)化樹分析

A：nGAstV特異性噬菌體淘選；B：nGAstV特異性噬菌體富集 A: Panning of nGAstV specific phage; B: Enrichment of nGAstV specific phage

2.5 重組Nb序列分析及表達(dá)

選取2.4中P/N≥2.1的陽性單克隆進(jìn)行菌液PCR，膠回收PCR產(chǎn)物克隆至pcDNA.3.1-Fc真核表達(dá)載體。每個(gè)平板隨機(jī)挑取2—3個(gè)單克隆，共提取40個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。利用DNAMAN軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明25株Nb的序列不同（圖5-A）；將25株Nb進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析，與預(yù)期條帶大小一致，有10株Nb為可溶性表達(dá)（圖5-B），分別為Nb1、Nb8、Nb12、Nb30、Nb31、Nb33、Nb34、Nb36、Nb38和Nb40。

2.6 重組Nb的反應(yīng)活性檢測(cè)

nGAstV包被ELISA板，同時(shí)設(shè)置LMH細(xì)胞對(duì)照及空白對(duì)照，加入純化的10株Nb進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果如圖6所示：根據(jù)P/N≥2.1，確定Nb1、Nb8、Nb12、Nb30、Nb31、Nb33、Nb36和Nb38共8株Nb與nGAstV特異性反應(yīng)，其中Nb12與Nb30反應(yīng)活性最好。

2.7 重組Nb特異性檢測(cè)

純化nGAstV，以滅活NDV、滅活H9N2 AIV陰性對(duì)照，與純化的8株Nb作為一抗進(jìn)行孵育，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，8株Nb均與nGAstV發(fā)生特異性反應(yīng)（圖7-A）；用8株Nb作為一抗與nGAstV ORF2蛋白孵育，以NDV F蛋白為陰性對(duì)照，通過Western blot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，8株Nb均與nGAstV ORF2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，與陰性對(duì)照不反應(yīng)（圖7-B）。

A：Nb氨基酸序列分析；B：Nb表達(dá)結(jié)果（M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2-11泳道：篩選的10株納米抗體，數(shù)字為納米抗體編號(hào)）

圖6 ELISA驗(yàn)證重組Nb反應(yīng)活性

A：蛋白免疫印跡檢測(cè)（1：NDV；2：H9N2 AIV；3：nGAstV）B：蛋白免疫印跡檢測(cè)（1：NDV F蛋白；2：nGAstV ORF2蛋白）

2.8 重組Nb的親和力檢測(cè)

利用ELISA方法驗(yàn)證反應(yīng)活性較好的8株Nb與nGAstV ORF2蛋白的親和力，計(jì)算EC50值。結(jié)果表明，Nb12和Nb30親和力最好（表5）。

表5 重組Nb親和力鑒定

3 討論

3.1 高效血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)是nGAstV病早期診斷的重要手段

近年來nGAstV在我國(guó)多省份蔓延流行呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且存在不斷變異和跨種傳播的現(xiàn)象[24-26]。目前，不僅缺乏針對(duì)nGAstV有效的流行病學(xué)調(diào)查手段，且nGAstV的致病機(jī)制和免疫反應(yīng)尚不明晰，欠缺有效防控nGAstV感染的生物制品。nGAstV常用檢測(cè)方法包括電鏡觀察、病毒分離、分子生物學(xué)、血清學(xué)檢測(cè)等[27-28]，但電鏡觀察主觀性較強(qiáng)、病毒分離培養(yǎng)困難、分子生物學(xué)檢測(cè)對(duì)操作者專業(yè)素養(yǎng)要求較高，常導(dǎo)致現(xiàn)地應(yīng)用困難；與之相比，血清學(xué)檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。但目前缺乏基于nGAstV抗體的血清學(xué)檢測(cè)方法的檢測(cè)試劑盒。因此，有必要制備一種抗體用于nGAstV的流行病學(xué)調(diào)查和臨床檢測(cè)[29-30]。

3.2 噬菌體展示技術(shù)是篩選Nb的適宜方法

本研究利用噬菌體展示技術(shù)成功構(gòu)建了庫容量為3.8×108CFU/mL的nGAstV Nb噬菌體展示文庫。但是，庫容量大的文庫容易篩選出相同序列的Nb，為了保證獲得的Nb序列不同，筆者在前期篩選過程中有目的地獲取了多個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序分析。噬菌體篩選包括固相篩選、磁珠捕獲物液態(tài)篩選和固液相結(jié)合篩選等方法[31]。由于固相篩選具有簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，所以本研究以nGAstV作為固相抗原進(jìn)行首輪篩選時(shí)，給予了較小的篩選壓力，避免了特異性噬菌體克隆丟失；在第二、三輪篩選過程中，通過逐步施加篩選壓力，最終獲得了Nb陽性克隆。哺乳動(dòng)物細(xì)胞是抗體表達(dá)使用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，能夠有效促進(jìn)正確的翻譯后修飾。我們選用HEK-293F細(xì)胞成功表達(dá)了10株Nb，但存在生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)，為了克服這一問題，后續(xù)將利用酵母表達(dá)系統(tǒng)等方法進(jìn)行Nb的表達(dá)。

3.3 nGAstV ORF2蛋白Nb具有良好的應(yīng)用潛力

AstV ORF2基因是AstV種屬劃分的依據(jù)[16]，通過分析該病毒ORF2基因序列，發(fā)現(xiàn)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離的nGAstV毒株與其他種屬AstV代表毒株之間核苷酸和氨基酸同源性較低（未發(fā)表數(shù)據(jù)），因此羊駝在免疫純化后的nGAstV可產(chǎn)生針對(duì)該毒株的特異性IgG抗體。nGAstV編碼的ORF2蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，包含病毒的主要抗原決定簇，具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。研究結(jié)果顯示，以nGAstV ORF2蛋白為靶標(biāo)抗原，通過Western blot和ELISA試驗(yàn)獲得8株與nGAstV ORF2蛋白反應(yīng)活性較好的Nb，包括Nb12、Nb30和Nb31等。其中，具有高親和力的Nb30可用于診斷試劑的研發(fā)。由于Nb具備易于改造的特點(diǎn)，后續(xù)可對(duì)Nb進(jìn)行改造進(jìn)一步提高其親和力，為開發(fā)基于nGAstV ORF2蛋白Nb的診斷試劑提供生物材料[12]。在nGAstV的研究中，對(duì)ORF2閱讀框編碼結(jié)構(gòu)蛋白的性質(zhì)、數(shù)量和結(jié)構(gòu)尚未確定。而在人星狀病毒的研究中，一般認(rèn)為ORF2主要編碼3種衣殼蛋白，包括VP34、VP29和VP26蛋白；針對(duì)這些蛋白的抗體可以阻斷病毒感染，提示星狀病毒ORF2結(jié)構(gòu)域可能攜帶中和表位[32-33]。為進(jìn)一步了解nGAstV的抗原結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)，本研究制備的針對(duì)nGAstV ORF2蛋白的Nb，不僅可以為檢測(cè)臨床樣本中的nGAstV提供材料，而且因Nb的CDR3環(huán)凸起可能結(jié)合常規(guī)抗體無法結(jié)合的凹抗原位點(diǎn)，從而尋找隱藏的中和抗原表位，可更好地實(shí)現(xiàn)Nb中和活性作用機(jī)制的探究[34]。因此，后續(xù)將對(duì)獲得的Nb進(jìn)行深入地研究，以期為nGAstV引起的雛鵝痛風(fēng)病提供新的解決方案。

4 結(jié)論

本研究利用噬菌體展示技術(shù)成功構(gòu)建了新型鵝星狀病毒納米抗體噬菌體展示文庫，獲得了1株高親和力的Nb30。該納米抗體的獲得不僅為ORF2蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為下一步研制血清學(xué)快速診斷試劑提供了材料。

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Screening and Identification of Nanobodies Against Novel Goose Astrovirus ORF2 Protein

WANG Dan, JI YanHong, LIANG ShiRui, YANG Jie, ZHU QiYun

State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046

【Objective】 The gosling gout disease caused by the novel goose astrovirus (nGAstV) has brought significant economic losses to the goose industry. In this study, a nanobody phage display library for nGAstV was constructed to obtain the specific nanobodies (Nbs) that recognize the ORF2 protein of nGAstV, which could pave a way for the establishment of antibody-based detection methods and the study on the structure and function of nGAstV ORF2 protein. 【Method】 The proliferated nGAstV in LMH cells was purified by sucrose gradient centrifugation. nGAstV was identified by RT-PCR and the virus titer was determined by cytopathic effect. The two-year-old alpacas were immunized with purified nGAstV inactivated by 0.6% formaldehyde solution. For the first immunization, inactivated nGAstV was emulsified with an equal volume of Freund's complete adjuvant. For the second to fifth immunization, inactivated nGAstV was emulsified with an equal volume of Freund's incomplete adjuvant. The immunization was performed every two weeks with a dose of 50 μg. And the titer of IgG against nGAstV in alpaca serum collected at 14 days post the fifth immunization was determined by indirect ELISA. When the IgG titer reached the standard for constructing a library, the alpaca peripheral blood lymphocytes (PBL) were isolated. The total RNA of PBL was extracted and reverse-transcribed into cDNA. The variable region gene of the heavy chain was amplified by nested PCR. It was constructed into pComb phage vector and combined with phage display technology to construct nGAstV Nb phage display library. The capacity of the library was calculated and its diversity was analyzed. nGAstV was used as a target antigen for three rounds of enrichment and panning to obtain recombinant phage Nb positive clones. The positive clones were then cloned into pcDNA3.1-Fc eukaryotic expression vectors followed by sequencing analysis. The plasmids with different sequences were transfected into HEK-293F cells, and the expression level was identified by SDS-PAGE. The nGAstV was used as a target antigen to test the specificity and binding activity of the expressed Nb by ELISA and Western blot. The affinity of Nb was verified using indirect ELISA using nGAstV ORF2 protein as the target antigen and to screen Nbs with better biological activity. 【Result】 The results of RT-PCR showed that nGAstV was ready to be proliferated in LMH cells. The titer of nGAstV virus was 4.38 Log10TCID50/mL by calculated by the Reed-Muench method. The titer of nGAstV antibodies in alpaca serum reached over 1:64 000 after five immunizations. Thegene was amplified by nested PCR and a phage display library of nGAstV Nb with a library capacity of 3.8×108CFU/mL was successfully constructed. Phylogenetic tree analysis showed that the phage Nb library had an excellent diversity. 39 phage positive clones were acquired, which reacted with nGAstV post three rounds of enrichment and panning, including 25 Nbs with different sequences. The results of SDS-PAGE identification showed that a total of 10 Nbs were successfully expressed. Among them, 8 Nbs that reacted explicitly with nGAstV ORF2 protein were further confirmed by ELISA and western blot, among which one Nb showed the best biological activity. 【Conclusion】 In this study, Nbs that reacted specifically with nGAstV ORF2 protein were screened for the first time, which provided materials for basic research and developing nGAstV detection methods.

novel Goose Astrovirus; ORF2 Protein; nanobody; phage display

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.013

2023-04-07；

2023-09-20

“十四五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022YFD1801003）、甘肅省科技重大專項(xiàng)計(jì)劃（21ZD3NA001-13）、中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項(xiàng)目（23ZYQA295）、甘肅省隴原青年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才項(xiàng)目（202204190202）

王丹，E-mail：wangdan2622@163.com。通信作者朱啟運(yùn)，E-mail：zhuqiyun@caas.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）