氧?；d體蛋白還原酶基因FgOAR1對(duì)禾谷鐮孢生長(zhǎng)、發(fā)育和致病的影響

宮安東，雷銀玉，吳楠楠，劉景榕，宋夢(mèng)鴿，張藝美，楊光，楊鵬

氧酰基載體蛋白還原酶基因?qū)坦如犳呱L(zhǎng)、發(fā)育和致病的影響

宮安東，雷銀玉，吳楠楠，劉景榕，宋夢(mèng)鴿，張藝美，楊光，楊鵬

信陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南信陽(yáng) 464000

【背景】禾谷鐮孢（）是引起小麥赤霉病（Fusarium head blight）的主要病原真菌，侵染后導(dǎo)致作物品質(zhì)和產(chǎn)量下降，同時(shí)產(chǎn)生多種真菌毒素，嚴(yán)重危害糧食生產(chǎn)和人類健康。氧?；d體蛋白還原酶（3-oxoacyl ACP reductase，OAR1）催化羧?；d體蛋白還原成氧酰基載體蛋白，在脂肪酸的生物合成過(guò)程中具有重要作用?！灸康摹繕?gòu)建基因缺失突變體，研究其表型、顯微結(jié)構(gòu)、孢子產(chǎn)量、有性生殖和致病力等的變化，探究的生物學(xué)功能，揭示其對(duì)禾谷鐮孢生長(zhǎng)、發(fā)育和致病的影響，為新型抑菌作用靶點(diǎn)的篩選及小麥赤霉病的防控提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā恳院坦如犳咭吧途關(guān)H-1為材料，應(yīng)用Split-Marker基因敲除技術(shù)，構(gòu)建基因缺失突變體（Δ），Gap-repair技術(shù)獲得缺失基因的回補(bǔ)突變體（Δ-C）；將PH-1、Δ和Δ-C菌株分別接種到常規(guī)培養(yǎng)基，觀察菌落表型變化并測(cè)定脂肪酸含量差異；接種到含剛果紅（Congo-Red）、SDS、NaCl和H2O2的壓力篩選培養(yǎng)基中，觀察菌絲在壓力培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)狀況；接種CMC培養(yǎng)基，比較分生孢子產(chǎn)量差異；接種胡蘿卜培養(yǎng)基，觀察有性生殖及孢子性狀；分別進(jìn)行小麥胚芽鞘和穗部接種，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和毒素產(chǎn)量，比較突變體與野生型菌株的致病力差異?！窘Y(jié)果】與野生型PH-1菌株相比，在PDA、YEG和CM培養(yǎng)基中Δ突變體未呈現(xiàn)明顯表型變化，在0.7 mol·L-1NaCl、0.03% H2O2、0.01% SDS和300 μg·mL-1Congo-Red等壓力培養(yǎng)條件下，突變體菌落直徑顯著低于野生型PH-1，表明與禾谷鐮孢細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的合成相關(guān)；Δ突變體在液體培養(yǎng)基中的分生孢子產(chǎn)量（8.1×105個(gè)/mL）顯著低于PH-1（1.26×106個(gè)/mL），接種小麥胚芽鞘和麥穗后，Δ突變體的致病力顯著低于野生型菌株P(guān)H-1?！窘Y(jié)論】禾谷鐮孢中參與脂肪酸的生物合成，對(duì)細(xì)胞膜合成具有重要作用，該基因缺失導(dǎo)致突變體抗逆性降低，分生孢子產(chǎn)量下降，且致病力顯著降低，對(duì)禾谷鐮孢的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病具有重要作用。

禾谷鐮孢；小麥赤霉??；基因敲除；；致病力

0 引言

【研究意義】由禾谷鐮孢（）侵染引起的小麥赤霉?。‵usarium head blight，F(xiàn)HB）是一種危害嚴(yán)重的真菌病害[1-3]，在全球范圍內(nèi)普遍存在[4]。在我國(guó)，赤霉病的暴發(fā)區(qū)主要集中在長(zhǎng)江中下游地區(qū)，近年來(lái)，隨著氣候變暖，赤霉病呈現(xiàn)出向北蔓延的趨勢(shì)[5]。此外，禾谷鐮孢還產(chǎn)生多種鐮孢菌毒素，對(duì)人體危害嚴(yán)重[6]。目前，針對(duì)小麥赤霉病的防治主要依靠化學(xué)殺菌劑，但殺菌劑的大量使用對(duì)環(huán)境造成一定影響，并引起病原菌耐藥性的增強(qiáng)[7]。因此，開(kāi)發(fā)新型、高效抑菌劑是病害防控的重要任務(wù)[8]。開(kāi)展基因功能研究，明確基因在病原菌侵染和致病過(guò)程中的生物學(xué)功能，將有助于鑒定核心作用位點(diǎn)，對(duì)抑菌劑的研發(fā)和赤霉病防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】脂肪酸是細(xì)胞膜的重要組成成分，對(duì)磷脂、脂多糖和脂蛋白的形成至關(guān)重要[9]，同時(shí)，對(duì)病原真菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病具有重要作用。已有研究表明，稻瘟病菌（）中超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成可影響侵入釘?shù)男纬?，?dāng)超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成受抑制后，侵入釘?shù)男纬墒茏?，病原菌致病力降低。HE等篩選到一種可抑制超長(zhǎng)碳鏈脂肪酸合成酶活性的化合物，并抑制侵染釘?shù)男纬珊筒≡那秩?，為真菌病害的防治提供新材料[10]。禾谷鐮孢中脂肪酸的生物合成由脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）催化[11]，該酶由分布在兩條鏈上的6個(gè)酶活性中心及一個(gè)?；d體蛋白（acetyl carrier protein，ACP）組成，以乙酰輔酶A為底物，經(jīng)?；D(zhuǎn)移酶催化生成乙酰ACP，與丙二酸單酰ACP結(jié)合，歷經(jīng)縮合、還原、脫水、還原4步反應(yīng)，生成丁酰乙酰ACP，重復(fù)上述4步反應(yīng)，每重復(fù)一次增加2個(gè)碳單位，經(jīng)多輪循環(huán)后合成長(zhǎng)鏈脂肪酸，用于脂蛋白和細(xì)胞膜等的生成。編碼氧?；d體蛋白還原酶，又稱-酮脂酰-ACP還原酶，參與脂肪酸生物合成的第二次“還原”反應(yīng)，以NADPH為輔因子，將乙酰乙酰ACP還原成-羥丁酰ACP，在脂肪酸的生物合成過(guò)程中具有重要作用。鮑曼不動(dòng)桿菌（）中發(fā)現(xiàn)一種高分子量OAR1酶，在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下，該酶可維持細(xì)菌的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和膜合成，當(dāng)基因缺失后，突變體在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)受抑制，因此對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要作用[12]。在野油菜黃單胞菌（pv.）中發(fā)現(xiàn)2個(gè)氧?；d體蛋白還原酶，分別為Fab G1和Fab G3，F(xiàn)ab G1是脂肪酸生物合成與細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的，該基因缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌死亡；Fab G3缺失后，未影響脂肪酸合成和細(xì)菌生長(zhǎng)，但影響次級(jí)代謝產(chǎn)物菌黃素的產(chǎn)生，菌黃素可保護(hù)病原菌免受光氧化損傷，突變體無(wú)法合成菌黃素，細(xì)胞的光氧化損傷增大，導(dǎo)致病原菌毒力降低[13]。釀酒酵母（）中敲除后，突變體在以甘油為唯一碳源的培養(yǎng)基上無(wú)法正常生長(zhǎng)，且線粒體呼吸減弱，表明缺失導(dǎo)致脂肪酸合成受阻，無(wú)法與甘油分子合成脂類物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受阻[14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在植物病原真菌中，針對(duì)的生物學(xué)功能，以及該基因?qū)φ婢L(zhǎng)、發(fā)育和致病的影響等，尚未有研究揭示?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以禾谷鐮孢野生型菌株P(guān)H-1為研究對(duì)象，構(gòu)建基因缺失突變體，分析突變體在表型、顯微結(jié)構(gòu)、壓力培養(yǎng)、無(wú)性生殖、有性生殖和致病力等方面與野生型菌株的差異，探究在禾谷鐮孢生長(zhǎng)、發(fā)育和致病過(guò)程中的重要作用，為新型抑菌劑的研發(fā)以及赤霉病防控提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年6月至2022年3月在信陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株 含有潮霉素抗性基因的pCB1003質(zhì)粒；含有G418、氨芐青霉素抗性、I酶切位點(diǎn)的pFL2質(zhì)粒；禾谷鐮孢野生型菌株P(guān)H-1（NRRL 31084）、Δ突變體、Δ-C回補(bǔ)突變體；大腸桿菌菌株DH5；色氨酸缺陷酵母菌株XK1-25。均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑、酶及培養(yǎng)基 幾丁質(zhì)酶、崩潰酶、溶菌酶購(gòu)于Sigma公司（Sigma-Aldrich，St Louis，MO）；r-Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、2×Taq Mix等購(gòu)于大連寶生物公司；I限制性內(nèi)切酶（Thermo Fisher Scientific，Cleveland，OH，USA）。

PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，ddH2O定容至1 L）用于真菌培養(yǎng)；CM培養(yǎng)基（葡萄糖3 g，蛋白胨0.6 g，酵母提取物0.3 g，酸水解酪蛋白0.3 g，NaNO31.8 g，KCl 0.15 g，MgSO40.15 g，KH2PO40.45 g，瓊脂4.5 g，ddH2O定容至300 mL）用于禾谷鐮孢的脅迫試驗(yàn)；CMC培養(yǎng)基（羧甲基纖維素鈉6 g，酵母提取物0.4 g，KH2PO40.4 g，NH4NO30.4 g，MgSO40.1 g，ddH2O定容至400 mL）用于禾谷鐮孢分生孢子制備；胡蘿卜培養(yǎng)基（胡蘿卜40 g，瓊脂粉4 g，ddH2O定容至200 mL）用于有性生殖試驗(yàn)。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 在Ensemble Fungi真菌數(shù)據(jù)庫(kù)（http://fungi.ensembl.org/index.html）下載編碼序列，并保留及其上下游2 000 bp堿基序列，根據(jù)目的基因序列及潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（）序列，利用primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)基因敲除引物、回補(bǔ)突變體構(gòu)建引物和檢測(cè)引物，所有引物由天一華煜基因科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1的同源性比對(duì) 在NCBI和Ensembl Fungi數(shù)據(jù)庫(kù)以禾谷鐮孢基因組為研究對(duì)象，檢索OAR1氨基酸編碼序列，將所得序列在NCBI-BLAST中進(jìn)行序列同源性比對(duì)，得到不同病原真菌中OAR1氨基酸序列。挑選不同病原真菌OAR1氨基酸序列在Clustal W軟件中進(jìn)行多重序列比對(duì)處理，在GENEDOC軟件繪制多重序列圖譜。

1.2.2基因敲除突變體和回補(bǔ)突變體的構(gòu)建 運(yùn)用同源重組基因敲除法構(gòu)建Δ突變體，以PH-1基因組DNA為模板，以成對(duì)引物FgOAR1_1F/2R及FgOAR1_3F/4R分別特異性擴(kuò)增目的基因的上、下游同源片段a和b；以pCB1003質(zhì)粒DNA為模板，以HYG/F和HY/R及YG/F和HYG/R為引物特異性擴(kuò)增的H1和H2片段。a和H1片段，b和H2片段進(jìn)行overlap-PCR得到融合片段aH1和bH2，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶大小。aH1和bH2融合片段用于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。

回補(bǔ)載體正向引物OAR1_hbF位于目的基因自身啟動(dòng)子的上游，反向引物OAR1_hbR在目的基因終止密碼子前20個(gè)堿基左右位置上，不包含OAR1基因編碼區(qū)的終止密碼子。分別在互補(bǔ)引物FgOAR1_hb/F和FgOAR1_hb/R的5′端增加36 bp的PFL2同源片段，以PH-1基因組DNA為模板，特異性擴(kuò)增互補(bǔ)片段，將互補(bǔ)片段與I酶切線性化后的pFL2載體，在酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組，構(gòu)建回補(bǔ)載體，使用檢測(cè)引物insert_F/R進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物送天一華煜基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 菌株的壓力篩選 將PH-1、Δ突變體和Δ-C回補(bǔ)突變體菌株接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，用0.5 cm打孔器在菌絲邊緣打孔，并接種在終濃度分別為0.7 mol·L-1NaCl、0.03% H2O2、0.01% SDS和300 μg·mL-1剛果紅的CM培養(yǎng)基上進(jìn)行壓力篩選[15-17]，每處理3個(gè)重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并拍照記錄。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列

1.2.4 分生孢子萌發(fā)與有性生殖 為檢測(cè)無(wú)性孢子的產(chǎn)生與萌發(fā)狀況，將PH-1、Δ和Δ-C接種PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，用打孔器打取含新鮮菌絲的菌餅，接種在50 mL CMC培養(yǎng)基中，振蕩搖培5 d，用無(wú)菌尼龍濾布過(guò)濾收集分生孢子，接種相同濃度的孢子液于50 mL的YEPD培養(yǎng)基中，25 ℃和175 r/min搖培8 h后，顯微鏡觀察各菌株分生孢子的萌發(fā)情況。試驗(yàn)重復(fù)3次，每處理統(tǒng)計(jì)30個(gè)孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率，以及萌發(fā)產(chǎn)生的芽管長(zhǎng)度，并比較3個(gè)菌株間的差異。

為檢測(cè)突變體的有性生殖情況，將活化的PH-1、Δ和Δ-C菌絲塊接種于胡蘿卜培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)6 d；待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后加入1 mL 0.1%的Tween 20，用無(wú)菌藥匙壓倒菌絲使其融合，放在25 ℃培養(yǎng)箱黑暗處理（黑暗12 h，黑光燈12 h），培養(yǎng)8 d觀察子囊殼的產(chǎn)生，解剖鏡下觀察子囊孢子的釋放。

1.2.5 脂肪酸含量測(cè)定 將新鮮的PH-1、Δ突變體孢子液（1×105個(gè)/mL）分別涂布PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d后收集表面菌絲，用于脂肪酸的提取[18]。菌絲研磨處理，分別取100 mg置于玻璃瓶中，加入1.5 mL溶解液（氯仿﹕甲醇=2﹕1，v/v），渦旋處理10 min，4 ℃和12 000 r/min條件下離心10 min，靜置后取1 mL上清液于新的玻璃管中，加入0.2 mL KCl（0.75%，w/v），渦旋10 min后靜置分層，取下層液體400 μL于新的玻璃管中，加入2 mL濃縮硫酸和甲醇混合液（5/95，v/v），95 ℃酯化處理1.5 h。向反應(yīng)體系中加入1 mL超純水和1 mL正己烷，混勻后靜置10 min分層。取上層提取液進(jìn)行脂肪酸測(cè)定。

1.2.6 菌株的致病力和產(chǎn)毒分析小麥苗期胚芽鞘接種和花期麥穗接種均選用赤霉病高感小麥品種安農(nóng)8455。選取大小均勻一致的小麥籽粒，種子進(jìn)行表面消毒，于25 ℃保濕催芽3 d，待胚芽鞘長(zhǎng)出3 cm左右，剪去胚芽鞘尖端造成斜面損傷。收集不同菌株的分生孢子，調(diào)整孢子液濃度至1×105個(gè)/mL，將2.5 μL分生孢子懸液接種至胚芽鞘尖端，每處理12個(gè)重復(fù)，相對(duì)濕度保持在80%，25 ℃黑暗培養(yǎng)24 h后，每天光照處理12 h，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，測(cè)量小麥基部褐色病斑長(zhǎng)度。試驗(yàn)重復(fù)3次，每組10個(gè)處理，統(tǒng)計(jì)每株幼苗病斑長(zhǎng)度后取平均值進(jìn)行比對(duì)。

收集分生孢子，調(diào)整濃度至1×105個(gè)/mL，將10 μL分生孢子懸液接種至揚(yáng)花期麥穗中部小花，套袋保濕。每處理12個(gè)重復(fù)，14 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，記錄發(fā)病麥穗數(shù)量，計(jì)算病穗率（發(fā)病麥穗數(shù)/接種總麥穗數(shù)）；統(tǒng)計(jì)接種小穗中發(fā)病小花數(shù)量，計(jì)算發(fā)病率（發(fā)病小花數(shù)/每穗總小花數(shù)）。

小麥成熟后，收集發(fā)病麥穗并剝離籽粒，分別研磨成粉末，進(jìn)行毒素測(cè)定。每組取1 g粉末樣品，加入4 mL提取液（乙腈/水=84/16，v/v），充分混勻后靜置10 min，取上清，重復(fù)進(jìn)行二次抽提，混合上清液，濃縮后重溶于1 ml甲醇中，進(jìn)行DON毒素測(cè)定[19]。每處理重復(fù)3次，取平均值，比較突變體與野生型菌株產(chǎn)毒差異。

1.2.7 不同侵染階段的基因表達(dá)分析 為了解在禾谷鐮孢不同生長(zhǎng)、侵染階段的表達(dá)情況，查閱已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，比對(duì)禾谷鐮孢在YEPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)12、24、36、48 h的表達(dá)量，以及接種小麥穗部24、48、72 h的基因表達(dá)量，分析在不同階段的表達(dá)差異。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為2—3次重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值，采用獨(dú)立性T檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差并分析差異顯著性（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 FgOAR1預(yù)測(cè)

在NCBI禾谷鐮孢數(shù)據(jù)庫(kù)和Ensembl Fungi數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST氨基酸序列分析，篩選到一個(gè)，ID為FGSG_03438。生物信息學(xué)分析顯示，該基因不含內(nèi)含子、信號(hào)肽和跨膜區(qū)，CDS編碼區(qū)長(zhǎng)839 bp。對(duì)禾谷鐮孢、稻瘟病菌、黃曲霉（）和釀酒酵母中該酶的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示OAR1蛋白氨基酸序列長(zhǎng)度在不同真菌中相對(duì)穩(wěn)定（263—278 AA），且氨基酸組成存在多個(gè)高度保守區(qū)（圖1）。

Fg：禾谷鐮孢F. graminearum；Af：黃曲霉A. flavus；Mg：稻瘟病菌M. oryzae；Sc：釀酒酵母S. cerevisiae

2.2 FgOAR1基因敲除和回補(bǔ)

運(yùn)用同源重組基因敲除法構(gòu)建Δ突變體。以PH-1基因組DNA為模板，擴(kuò)增的上游同源片段a，長(zhǎng)度為701 bp，下游同源片段b，長(zhǎng)度為695 bp，以pCB1003質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增潮霉素編碼基因前段H1片段，長(zhǎng)度為764 bp，后段H2片段，長(zhǎng)度為930 bp。a和H1片段，b和H2片段進(jìn)行overlap-PCR擴(kuò)增，得到aH1長(zhǎng)度1 464 bp，bH2長(zhǎng)度為1 625 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶大小，與理論值一致（圖2-A），表明基因敲除載體構(gòu)建成功。

同源片段轉(zhuǎn)化PH-1原生質(zhì)體獲得轉(zhuǎn)化子，用4對(duì)引物檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，F(xiàn)gOAR1_5F/6R引物擴(kuò)增目的基因編碼區(qū)，無(wú)陽(yáng)性條帶，表明轉(zhuǎn)化子中目的基因已被替換，h850/h852引物擴(kuò)增aH1與bH2的overlap融合區(qū)，檢測(cè)條帶大小為750 bp，表明轉(zhuǎn)化子中兩個(gè)片段成功融合；引物FgOAR1_7F/h855R和h856F/ FgOAR1_8R分別擴(kuò)增上游同源區(qū)與潮霉素編碼基因的overlap融合區(qū)，潮霉素編碼基因與下游同源片段的overlap融合區(qū)，片段大小分別為1 038和1 042 bp，表明潮霉素成功插入上下游同源片段之間，實(shí)現(xiàn)目的基因替換，擴(kuò)增目的條帶大小與理論值符合（圖2-B），突變體構(gòu)建成功。

同時(shí)，以PH-1基因組為模板，引物FgOAR1_hbF/ R擴(kuò)增目的基因全長(zhǎng)1 643 bp，利用Gap repair方法進(jìn)行回補(bǔ)載體構(gòu)建，引物insert_F/R和FgOAR1_5F/6R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度1 915和614 bp，符合試驗(yàn)預(yù)期（圖2-C）。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與原序列一致，沒(méi)有突變，表明回補(bǔ)載體構(gòu)建成功。回補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化突變體原生質(zhì)體，構(gòu)建回補(bǔ)突變株Δ-C，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶大小與理論值一致（圖2-D）。

A：FgOAR1基因敲除載體構(gòu)建Construction the FgOAR1 gene deletion vector。M：Marker 5000；a：FgOAR1上游同源片段FgOAR1 upstream homologous fragment (701 bp)；b：FgOAR1下游同源片段FgOAR1 downstream homologous fragment (695 bp)；H1：hph抗性基因上端The upper end of the hph resistance gene (764 bp)；H2：hph抗性基因下端The lower end of the hph resistance gene (930 bp)；aH1：a片段和H1片段進(jìn)行Overlap的產(chǎn)物Overlap of a fragment and H1 fragment (1464 bp)；bH2：b片段和H2片段Overlap后的產(chǎn)物Overlap of b fragment and H2 fragment (1625 bp)。B：轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)PCR detection of transformants。M：Marker 5000；CK：假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子false positive transformants；1：引物h850/h852擴(kuò)增條帶Amplification band of primer h850/h852 (750 bp)；2：引物FgOAR1_5F/6R擴(kuò)增，無(wú)條帶Amplification of primer FgOAR1_5F/6R, no band；3：引物FgOAR1_7F/h855R擴(kuò)增條帶Amplification band of primer FgOAR1_7F/h855R (1038 bp)；4：引物h856F/FgOAR1_8R擴(kuò)增條帶Amplification band of primer h856F/FgOAR1_8R (1042 bp)。C：回補(bǔ)片段擴(kuò)增與連接Amplification of complementary fragment。M：Marker 2000，1：引物insert_F/R擴(kuò)增片段Amplification band of primer insert_F/R (1915 bp)；2：引物FgOAR1_5F/6R擴(kuò)增片段Amplification band of primer FgOAR1_5F/6R (614 bp)。D：回補(bǔ)突變體的鑒定PCR identification of complementary mutant。M：Marker 5000；1：引物h850/h852擴(kuò)增片段Amplification band of primer h850/h852 (750 bp)；2：引物FgOAR1_hbF/R擴(kuò)增片段Amplification band of primer FgOAR1_hbF/R (1643 bp)

2.3 菌落形態(tài)以及生長(zhǎng)速度的測(cè)定

在PDA、5×YEG、CM基礎(chǔ)培養(yǎng)基上接種PH-1、Δ和Δ-C菌株，培養(yǎng)3 d后，Δ與PH-1菌株相比菌落形態(tài)、菌落邊緣、氣生菌絲的疏密程度以及色素產(chǎn)生情況均無(wú)明顯差異（圖3）。檢測(cè)菌落生長(zhǎng)直徑，計(jì)算生長(zhǎng)速率顯示，野生型菌株P(guān)H-1在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率最快，為1.20 cm·d-1，Δ的生長(zhǎng)速率為1.19 cm·d-1，與PH-1相比，無(wú)顯著差異（表2）。此外，PH-1菌株與突變體在5×YEG和CM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率相近，未呈現(xiàn)顯著差異。表明在基本培養(yǎng)基中，對(duì)禾谷鐮孢的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。

2.4 菌株在不同壓力脅迫培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)測(cè)定

在含有0.7 mol·L-1NaCl、0.03% H2O2、0.01% SDS和300 μg·mL-1Congo-Red的CM平板上分別接種PH-1、Δ和Δ-C，培養(yǎng)后觀察菌絲形態(tài)。結(jié)果顯示在0.7 mol·L-1NaCl脅迫條件下，PH-1生長(zhǎng)速率為0.98 cm·d-1，Δ的生長(zhǎng)速率0.62cm·d-1，比PH-1菌株降低36.7%，差異顯著；在300 μg·mL-1Congo-Red和0.01% SDS壓力脅迫下，Δ的菌絲生長(zhǎng)速率分別為0.81和0.37 cm·d-1，PH-1的菌絲生長(zhǎng)速率分別為1.15和0.54 cm·d-1，Δ相比PH-1分別顯著降低29.6%和31.5%；在0.03% H2O2脅迫下，Δ的生長(zhǎng)速率相比PH-1也顯著降低20.0%（表3）。在4種壓力脅迫條件下，突變體菌絲的生長(zhǎng)速率顯著低于野生型菌株，表明在不同壓力培養(yǎng)條件下，具有更強(qiáng)的生物功能，可促進(jìn)脅迫條件下菌絲的生長(zhǎng)和發(fā)育（圖4）。

圖3 PH-1、ΔFgOAR1和ΔFgOAR1-C菌株的菌落形態(tài)

表2 3個(gè)菌株的生長(zhǎng)速率測(cè)定

圖4 PH-1、ΔFgOAR1及ΔFgOAR1-C菌株在不同脅迫條件下的菌落形態(tài)

表3 PH-1、ΔFgOAR1和ΔFgOAR1-C菌株在不同脅迫下的生長(zhǎng)速率

*：差異顯著Significant difference (＜0.05)。下同The same as below

2.5 脂肪酸含量測(cè)定

在禾谷鐮孢pH-1和Δ菌株中，均檢出4種類型的脂肪酸，分別為十六烷酸（軟脂酸）、十八烷酸（硬脂酸）、順-9-十八碳一烯酸甲酯（油酸）、十八二烯酸（亞油酸），其中以亞油酸的相對(duì)含量最為豐富，達(dá)到43.34%，硬脂酸最少，為3.82%，軟脂酸（11.78%）和油酸（14.87%）居于二者之間。Δ與pH-1菌株相比，4種脂肪酸的含量均無(wú)顯著差異（圖5），表明在基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)脂肪酸的合成無(wú)明顯影響。

2.6 FgOAR1對(duì)分生孢子產(chǎn)生和萌發(fā)的影響

CMC培養(yǎng)基中培養(yǎng)pH-1、Δ和Δ-C進(jìn)行分生孢子定量分析，發(fā)現(xiàn)Δ、pH-1和Δ-C分生孢子濃度分別為0.81×106、1.26×106和1.15×106個(gè)/mL，與pH-1相比，Δ產(chǎn)孢量顯著降低（圖6-A），表明在分生孢子的形成過(guò)程中具有重要作用。

pH-1、Δ和Δ-C的分生孢子均為鐮刀狀，孢子形態(tài)均勻，每個(gè)孢子有5—7個(gè)隔膜，孢子表型無(wú)明顯差異。孢子萌發(fā)后顯微觀察萌發(fā)狀態(tài)，3個(gè)菌株孢子萌發(fā)率均高于95%，無(wú)顯著差異。進(jìn)一步測(cè)定孢子萌發(fā)8 h后形成的菌絲長(zhǎng)度，PH-1產(chǎn)生菌絲的平均長(zhǎng)度為362 μm，與突變體（353 μm）相比，二者無(wú)顯著差異（圖6-B）。缺失導(dǎo)致禾谷鐮孢無(wú)性生殖過(guò)程分生孢子產(chǎn)量顯著降低，但孢子形態(tài)和萌發(fā)狀況無(wú)明顯變化，表明該基因在孢子的生成過(guò)程中具有重要作用。

C16:0：十六烷酸（軟脂酸）hexadecyclic acid；C18:0，十八烷酸（硬脂酸）octadecanoic acid；C18:1n9c：順-9-十八碳一烯酸甲酯（油酸）octadecenoic acid；C18:2n6c：十八二烯酸（亞油酸）octadecadienoic acid

標(biāo)尺bar =200 μm

2.7 突變體的有性生殖

黑光燈誘導(dǎo)培養(yǎng)8 d后，Δ可產(chǎn)生黑色顆粒狀的子囊殼，且子囊殼的大小、形態(tài)和數(shù)量與PH-1菌株無(wú)明顯差異。子囊殼成熟后，頂端可見(jiàn)噴發(fā)的子囊孢子。壓開(kāi)子囊殼，呈現(xiàn)花簇狀子囊，每個(gè)子囊內(nèi)含8個(gè)子囊孢子，子囊孢子一般含3個(gè)隔膜、4個(gè)細(xì)胞，Δ產(chǎn)生的子囊及子囊孢子數(shù)量與pH-1相比無(wú)明顯變化（圖7）。因此，對(duì)禾谷鐮孢有性生殖過(guò)程中子囊殼、子囊孢子的釋放以及子囊孢子形成無(wú)影響。

圖7 PH-1、ΔFgOAR1及ΔFgOAR1-C菌株的有性生殖

2.8 FgOAR1在侵染過(guò)程中的作用

新鮮孢子接種小麥胚芽鞘7 d后，觀察發(fā)病情況。PH-1侵染小麥胚芽鞘發(fā)病嚴(yán)重，病斑長(zhǎng)度為5.5 cm，Δ也可侵染，但發(fā)病較輕，病斑長(zhǎng)度為1.5 cm，Δ-C發(fā)病狀況與PH-1相近，病斑長(zhǎng)度5.0 cm，表明在小麥苗期生長(zhǎng)階段，缺失導(dǎo)致禾谷鐮孢致病力降低（圖8-A、8-B）。

在小麥揚(yáng)花期進(jìn)行穗部接種，PH-1和Δ均可侵染麥穗，導(dǎo)致小麥發(fā)病，二者病穗率均為100%。從致病程度而言，PH-1發(fā)病嚴(yán)重，接種后更多小花被侵染，小花發(fā)病率98.6%。但Δ發(fā)病率僅為38.6%（圖8-C、8-D）。表明缺失后，禾谷鐮孢對(duì)成株期小麥致病力顯著降低。小麥籽粒成熟后進(jìn)行毒素測(cè)定，結(jié)果顯示接種PH-1和Δ的小麥DON毒素含量分別為431.03和421.05 μg·kg-1，二者無(wú)顯著差異，表明在侵染小麥過(guò)程中，缺失對(duì)毒素的產(chǎn)生無(wú)影響。

A：小麥胚芽鞘的侵染發(fā)病The infection on wheat coleoptile；B：病斑長(zhǎng)度Spot length；C：對(duì)麥穗的侵染The infection on wheat spikelet；D：發(fā)病率統(tǒng)計(jì)Incidence statistics

2.9 FgOAR1在不同階段的表達(dá)

在菌絲生長(zhǎng)階段和侵染小麥階段的表達(dá)量明顯不同[20-21]。在無(wú)脅迫培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，禾谷鐮孢菌絲中的表達(dá)量很低，TPM（Transcript per Kilobase per Million mapped reads）均低于1，在36 h時(shí)達(dá)到最大值0.46。當(dāng)接種到麥穗后，的表達(dá)量明顯增高，接種48 h時(shí)TPM值為115.93，隨侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量也逐漸升高，到72 h時(shí)TPM值最高達(dá)141.18（圖9）。表明在禾谷鐮孢侵染小麥過(guò)程中，的表達(dá)受到誘導(dǎo)，表達(dá)量始終維持在高水平。

Hyphae 12 h, 24 h, 36 h, 48 h：PH-1接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)12、24、36、48 h時(shí)FgOAR1的表達(dá)量The expression level of FgOAR1 of PH-1 cultured in YEPD medium for 12, 24, 36, 48 h, respectively；Wheat 24 h, 48 h, 72 h：PH-1接種小麥麥穗24、48、72 h時(shí)FgOAR1的表達(dá)量The expression level of FgOAR1 of PH-1 inoculated on wheat spikelet for 24, 48, 72 h, respectively

3 討論

3.1 脂肪酸的合成對(duì)禾谷鐮孢生長(zhǎng)具有重要作用

禾谷鐮孢是一種兼性寄生菌，可侵染小麥、玉米、大麥、水稻、燕麥等多種禾谷類作物，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[22]。禾谷鐮孢的侵染和致病受到眾多基因調(diào)控，許多基因已被證明對(duì)禾谷鐮孢的侵染和致病具有重要作用，其編碼蛋白也被認(rèn)定為赤霉病防控的潛在靶位點(diǎn)[23-24]。脂肪酸是真菌細(xì)胞中磷脂、脂多糖和脂蛋白的重要組成部分，對(duì)細(xì)胞膜的形成、病原真菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病等具有重要作用。本研究對(duì)禾谷鐮孢脂肪酸合成途徑的氧酰基載體蛋白還原酶OAR1開(kāi)展研究，構(gòu)建缺失突變體與回補(bǔ)突變體，揭示該基因?qū)坦如犳呱L(zhǎng)、發(fā)育和致病的影響，明確其生物學(xué)功能，可為新型抑菌劑的研發(fā)及作用靶點(diǎn)的篩選提供理論依據(jù)。

3.2 在脅迫條件下，F(xiàn)gOAR1對(duì)禾谷鐮孢的生長(zhǎng)具有更強(qiáng)的促進(jìn)作用

Δ突變體菌株在常規(guī)PDA、CM、YEG培養(yǎng)基上，菌絲直徑、生長(zhǎng)速率與野生型菌株無(wú)顯著差異，表明在常規(guī)培養(yǎng)條件下，缺失后，對(duì)菌絲的生長(zhǎng)無(wú)影響。在禾谷鐮孢的基因組中，存在7個(gè)同源基因，基因編號(hào)分別為FGSG_03438、FGSG_03838、FGSG_09169、FGSG_11198、FGSG_ 04045、FGSG_06029、FGSG_06455，對(duì)所有基因均進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)前4個(gè)基因?yàn)槲⑿Щ?，缺失后?duì)禾谷鐮孢生長(zhǎng)和侵染的影響較小，后3個(gè)基因?yàn)橹餍Щ颍ㄖ滤阑颍笔Ш蠛坦如犳邿o(wú)法生長(zhǎng)。因此，禾谷鐮孢脂肪酸合成途徑中，氧酰基載體蛋白還原酶存在多個(gè)同源基因，本研究敲除的（FGSG_03438）為微效基因，該基因缺失后，其同源基因存在功能補(bǔ)償，故常規(guī)培養(yǎng)條件下無(wú)表型變化。

與常規(guī)培養(yǎng)下的無(wú)表型變化相比，Δ突變體菌株在NaCl、H2O2、SDS和Congo-Red壓力脅迫條件下，菌絲生長(zhǎng)速率顯著低于野生型菌株。在脅迫因子的影響下，同源基因的補(bǔ)償作用不足，可能發(fā)揮更為重要的作用，故該基因缺失后，突變體菌株生長(zhǎng)速率顯著降低。SDS是一種陰離子表面活性劑，可以干擾細(xì)胞膜的生物合成[25]，當(dāng)敲除后，突變體對(duì)SDS的響應(yīng)更敏感，細(xì)胞膜形成受抑制，菌絲生長(zhǎng)減慢，生長(zhǎng)速率顯著低于野生型。參與的脂肪酸合成與細(xì)胞膜形成直接相關(guān)，缺失影響細(xì)胞膜的合成，而細(xì)胞膜表面含有多種蛋白酶和調(diào)控因子，細(xì)胞膜的合成受阻對(duì)禾谷鐮孢的生長(zhǎng)發(fā)育各方面均產(chǎn)生影響。禾谷鐮孢細(xì)胞壁的主要組成成分是幾丁質(zhì)[26]，其生物合成必須依賴于細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞膜合成受阻后，也導(dǎo)致突變體在Congo-Red（幾丁質(zhì)合成抑制劑，破壞細(xì)胞壁完整性）[27-30]的脅迫下，菌絲的生長(zhǎng)速度顯著降低。同時(shí)，細(xì)胞膜的合成受抑制，也引起細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激和滲透壓的響應(yīng)性降低，因此突變體菌株在H2O2、NaCl的協(xié)迫作用下[31]，生長(zhǎng)速率也顯著低于野生型菌株。

3.3 FgOAR1對(duì)禾谷鐮孢的侵染和致病具有重要作用

在禾谷鐮孢侵染小麥試驗(yàn)中，突變體菌株的致病力顯著低于野生型菌株，表明在禾谷鐮孢的侵染和致病過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。在病原菌侵染植物過(guò)程中，病原菌與植物間存在復(fù)雜的互作機(jī)制，植物通過(guò)自身的免疫防御系統(tǒng)，能夠識(shí)別病原菌的入侵，激活防御系統(tǒng)，抵御病原菌的侵染和危害[32]，而植物的防御反應(yīng)對(duì)于病原菌而言，同樣是一種脅迫刺激。在脅迫因子的作用下，被激活，發(fā)揮更重要的作用。因此當(dāng)敲除時(shí)，禾谷鐮孢對(duì)脅迫刺激的響應(yīng)喪失，無(wú)法發(fā)揮作用，禾谷鐮孢侵染能力減弱導(dǎo)致致病力顯著降低。在禾谷鐮孢侵染小麥過(guò)程中，的表達(dá)量受誘導(dǎo)后顯著提高，在禾谷鐮孢的侵染和致病過(guò)程中具有重要作用，因此缺失后，突變體的致病力顯著降低。后續(xù)將進(jìn)一步借助多組學(xué)分析技術(shù)，探究的具體功能，進(jìn)一步揭示禾谷鐮孢響應(yīng)逆境脅迫誘導(dǎo)的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

參與脂肪酸的生物合成，對(duì)菌絲細(xì)胞膜的形成具有重要作用。該基因在脅迫因子誘導(dǎo)條件下能發(fā)揮更重要的作用，有利于脅迫條件下禾谷鐮孢的菌絲生長(zhǎng)，以及侵染小麥過(guò)程中致病力的提升。綜上，對(duì)禾谷鐮孢的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病具有重要影響，可作為潛在的赤霉病防控靶點(diǎn)，用于新型抑菌劑的研發(fā)。

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The effect of 3-oxyacyl ACP reductase geneon the growth, development and pathogenicity of

GONG AnDong, LEI YinYu, WU NanNan, LIU JingRong, SONG MengGe, ZHANG YiMei, YANG Guang, YANG Peng

College of Life and Science, Xinyang Normal University, Xinyang 464000, Henan

【Background】is the main pathogenic fungus which can infect wheat and result in Fusarium head blight. The infection ofleads to huge reduction in crop quality and yield, and produces different types of mycotoxins that endanger grain production and human health. 3-oxoacyl ACP reductase (OAR1), catalyzing carboxyacyl carrier protein to oxyacyl carrier protein, which plays an important role in the fatty acid biosynthesis of【Objective】To reveal the biological functionof, thedeletion mutants were constructed. The phenotype, cell structure, conidia concentration, sexual reproduction and pathogenicity of mutant were analyzed and compared with wild-type strain PH-1. The results will uncover the function of, and provide scientific evidences for the identification of novel antifungal target and control of Fusarium head blight.【Method】Wild-type strainPH-1 was used as material in this study. Split-Marker gene knockout technology was conducted to construct the Δmutants. The Δ-C reverting strain was obtained by the Gap-repair method. All strains were individually inoculated in common media (PDA, CM, YPG), and the stress selection medium containing Congo-Red, SDS, NaCl and H2O2, respectively. The mycelium phenotypes and fatty acid content were recorded. The strains were inoculated in CMC medium to analyze the conidia concentration. The carrot culture-medium was used to analyze the sexual reproduction of each strain. All strains were individually inoculated to the wheat coleoptile and spikelet to analyze the pathogenicity and mycotoxin content, respectively. The disease incidence of mutant strains was calculated and compared with PH-1 strain.【Result】Compared with the wild-type strain PH-1, the growth of Δmutant showed no difference in PDA, YEG and CM media. Whereas, under the pressure of 0.7 mol·L-1NaCl, 0.03% H2O2, 0.01% SDS and 300 μg·mL-1Congo-Red, the growth of Δmutant was significantly reduced compared with PH-1. The evidence demonstrated thatis related to the cell membrane and cell wall formation in. In CMC medium, the conidia concentration of Δmutant (8.1×105conidia/mL) was less than PH-1 (1.26×106conidia/mL) with significant difference; The pathogenicity analysis further demonstrated that the disease incidence of Δmutant was significantly lower than PH-1 in wheat coleoptile and spikelet inoculation tests.【Conclusion】participates in the fatty acid biosynthesis, and plays an important role in cell membrane formation of. The deletion ofresulted in the reduced resistance to pressures, decreased conidia production and pathogenicity. Therefore,is important for the growth, development and pathogenicity process of.

; Fusarium head blight; gene knockout;; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.005

2023-07-28；

2023-09-29

國(guó)家自然科學(xué)基金（31701740）、河南省自然科學(xué)基金（222300420519，222301420111）、河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（24A210025）、河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（232102110202）、南湖學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃

宮安東，E-mail：gongad@xynu.edu.cn。通信作者張藝美，E-mail：xynuym@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）