成株抗性與全生育期抗性基因聚合培育抗條銹性小麥新品種

白斌 杜久元 何瑞 杜曉霖 郭瑩

關(guān)鍵詞：小麥；條銹??；基因聚合；分子標(biāo)記；蘭天132；蘭天196

小麥條銹?。╳heat stripe rust）是危害我國北方小麥安全生產(chǎn)的重要病害之一。西北麥區(qū)又是我國小麥條銹菌最重要的菌源越夏區(qū)和小種易變區(qū)，尤其甘肅隴南地區(qū)（天水市、隴南市）因其地理環(huán)境特殊，成為我國小麥條銹菌核心越夏區(qū)和小種易變區(qū)。近年來，由于暖冬等氣候變化，小麥條銹病在我國西北、黃淮冬麥區(qū)的流行呈偏重發(fā)生，并向長江中下游麥區(qū)等地?cái)U(kuò)展。據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)，2021年全國小麥條銹病發(fā)生面積446.3萬hm2，占全國小麥面積的19.48%，是自2017年以來發(fā)病最重的一年。

利用抗病基因培育抗病品種是長期有效防控條銹病的重要方法。迄今為止，正式命名的小麥抗條銹病基因已有80多個(gè)（Yr1～Yr83），另外還有一些暫未正式命名的抗病基因，如YrZH22．YrZH84和YrZM103等。抗病基因按類別分為全生育期抗性基因和成株期抗性基因，全生育期抗病基因如Yr5，Yr9，Yrl0，Yr15，Yr17，YrZH22和YrZH84等，成株期抗病基因如Yr18，Yr29，Yr30，Yr36和Yr46等。但由于小麥條銹菌致病小種的不斷變異和育種中偏好全生肓期抗性基因的利用，已導(dǎo)致多個(gè)全生育期抗性基因喪失抗病性，造成育種可用的有效抗源和抗病基因資源越來越少、育成品種抗病性表現(xiàn)脆弱。較為突出的例子如20世紀(jì)80-90年代，致病性小種CYR31發(fā)生和流行后，大量利用Yr9單一抗源作為親本育成的推廣品種很快喪失了抗病性。此后，新小種CYR34又導(dǎo)致Yr10、Yr26基因和‘貴農(nóng)22’血緣的抗源喪失抗病性。而含有成株期抗性基因的品種雖然苗期表現(xiàn)感病，但成株期表現(xiàn)抗病，且抗病性較為持久。研究還發(fā)現(xiàn)，品種中若僅含有某一個(gè)已“喪失”部分抗性的全生育期抗性基因，對(duì)條銹病表現(xiàn)感病，但與其他多個(gè)全生育期抗性或成株期抗性基因聚合后，對(duì)條銹病整體表現(xiàn)抗病至輕微感病。如‘Libellu-la’‘Strampelli’‘ Pascal，等品種含有3～5個(gè)成株期抗性位點(diǎn)，在條銹菌越夏菌源區(qū)隴南長期表現(xiàn)出優(yōu)異的成株抗性，其中‘Libellula’和‘Strampelli’已保持抗性逾50年。因此，選育抗病基因聚合品種提高品種抗病持久性，是有效持續(xù)控制西北越夏菌源區(qū)小麥條銹病的重要策略。甘肅隴南作為小麥條銹菌核心越夏菌源區(qū)在我國小麥條銹病的防控中具有非常重要的地位，然而該區(qū)域的小麥品種在生產(chǎn)中多數(shù)表現(xiàn)抗病性時(shí)間短，具有穩(wěn)定抗性且抗性較持久的品種較少。育種中利用單一成株期抗性基因，又存在秋苗菌源量增加、向外傳播等問題。因此，綜合利用全生育期抗病基因和成株期抗性基因，既能減少向外傳播的秋苗菌源量，又能延長品種抗性保持年限。課題組前期研究中育成了含有成株期抗性基因Yr30/Lr27/Sr2，全生育期抗病基因YrZH84等基因的小麥品種‘蘭天15號(hào)’，含有全生育期抗病基因Yr9、Lr37/Yr 17/Sr38和YrZH84的小麥品種‘蘭天26號(hào)’，含有成株期抗性基因Yr30/L27/Sr2，全生育期抗病基因Lr37/Yr17/Sr38的小麥品系‘C69-17-13-14-15-6-1’。為了進(jìn)一步提高品種的抗病持久性，通過常規(guī)育種結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，培育聚合成株期抗性基因和全生育期抗病基因的新品種，為越夏菌源區(qū)甘肅隴南條銹病的品種遺傳多樣性持續(xù)控制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試小麥

‘蘭天15號(hào)’（選育系號(hào)95-62-1，甘審麥2004003）、‘蘭天26號(hào)’（選育系號(hào)00-30-3-2，甘審麥2010007>、‘C69-17-13-14-15-6-1’（92-47航天誘變選育的新品系）均為課題組近年選育的適于甘肅隴南地區(qū)種植的冬小麥品種（系）。通過已知基因的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)合抗病性鑒定，‘蘭天15號(hào)’成株期對(duì)條銹病高抗至免疫，含有成株期抗性基因Yr30/Lr27/Sr2和全生育期抗病基因YrZH84；‘蘭天26號(hào)’高抗條銹病，含有全生育期抗病基因Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84；‘C69-17-13-14-15-6-1’成株期具有高度慢病性特點(diǎn)，含有成株期抗性基因Yr30/Lr27/Sr2和全生育期抗病基因Lr37/Yr17/Sr38。利用‘C69-17-13-14-15-6-1，和‘蘭天15號(hào)’雜交，聚合Yr9、Yr30/Lr27/Sr2、Lr37/Yr 17/Sr38和YrZH84選育出新品種‘蘭天132，。利用‘C69-17-13-14-15-6-1’和‘蘭天26號(hào)’雜交，聚合Yr9、Yr30/Lr27/Sr2和Lr37/Yr17/Sr38育成新品種‘蘭天196’。利用已知抗條銹基因載體材料‘AvSYr9

NIL， （Yr9）、‘AvSYr17 NIL， （Lr37/Yr17/Sr38），‘Opata

85’（Yr27， Yr30）、‘Francolin’（Yr30）、‘92-47’ （Yr30）、‘周8425B’ （YrZH84）作為抗病對(duì)照品種，‘銘賢169，為感病對(duì)照品種。利用甘肅省區(qū)域試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)對(duì)照品種‘蘭天19號(hào)’作為產(chǎn)量性狀選擇標(biāo)準(zhǔn)。

1.2DNA提取和基因型檢測(cè)

采用植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）股份有限公司]提取小麥基因組DNA，并用1．0%的瓊脂糖凝膠和微量分光光度計(jì)（Nano-Drop 2000，Thermo Scientific）檢測(cè)DNA的完整性及濃度。分子標(biāo)記為Yr9的黑麥特異性分子標(biāo)記AVI/AV4，Lr37/Yr 17/Sr38分子標(biāo)記VENTR-TUP/LN2，Yr30/Lr27/Sr2的分子標(biāo)記csSr2和Xwms533．YrZH84分子標(biāo)記Xcfa2040。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。標(biāo)記檢測(cè)試驗(yàn)于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所實(shí)驗(yàn)室完成。分子標(biāo)記引物序列及PCR反應(yīng)條件詳見表1。

PCR反應(yīng)體系（20.0pL）：2×Taq mix（天根生物科技有限公司）10uL，10.0 ng/uL。DNA 1uL，1．0umol/L標(biāo)記引物各1uL，超純水補(bǔ)足至20uL，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性2min；95℃變性30s，退火溫度（表1）下退火40s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。分子標(biāo)記AV1/AV4、VENTRTUP /LN2、csSr2的PCR產(chǎn)物利用1.0%～2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Xcfa2040和Xurns533標(biāo)記的PCR產(chǎn)物利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.3田間試驗(yàn)

‘蘭天26號(hào)’ב蘭天15號(hào)’和‘C69-17-13-14-15-6-1’ב蘭天26號(hào)’的雜交后代試驗(yàn)材料和對(duì)照材料分別于2007年-2015年和2012年-2019年種植于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所清水試驗(yàn)站（34.7°N，106.2°E）。采用常規(guī)育種系譜法對(duì)后代進(jìn)行選育，在相鄰小區(qū)種植高度感病品種‘晉麥47’和‘輝縣紅’作為條銹菌接種和誘發(fā)材料。每個(gè)組合的F1群體種植2行，行長1．0m，F(xiàn)2群體每個(gè)組合單株點(diǎn)播約3000粒，株距4．0cm，對(duì)抗病單株進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)，對(duì)含有目標(biāo)基因聚合體的單株的F3和F4群體采用行播，每個(gè)群體播種2行，行長1.5m，利用分子標(biāo)記跟蹤監(jiān)測(cè)抗病單株，對(duì)豐產(chǎn)性好、含有目標(biāo)基因聚合體的Fs株系進(jìn)行小區(qū)產(chǎn)量比較試驗(yàn)，豐產(chǎn)性和產(chǎn)量均以甘肅省區(qū)域試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)對(duì)照品種‘蘭天19號(hào)’為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，篩選優(yōu)異品系參加甘肅省隴南片區(qū)域試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)。

1.4條銹病抗病性鑒定

成株期抗病性鑒定于2019年-2020年種植季分別在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所清水縣試驗(yàn)站、四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院郫都區(qū)試驗(yàn)站進(jìn)行。每個(gè)材料按行播種（行長1.5m），2次重復(fù)，以高感品種‘晉麥47’（甘肅）和‘銘賢169’（四川）作為感病對(duì)照品種。小麥拔節(jié)期接種甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供的混合小種（CYR34，Gui22-1，CYR32，CYR33，ZS類型）。在感病品種充分發(fā)病時(shí)進(jìn)行成株期抗病性鑒定，反應(yīng)型記載方法和苗期記載方法相同，嚴(yán)重度按葉面病斑面積占總?cè)~面積的百分比計(jì)算。成株抗性綜合評(píng)價(jià)按照《農(nóng)作物抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范

第4部分小麥條銹病》（DB52/T1501. 4-2020）的標(biāo)準(zhǔn)，反應(yīng)型0為免疫，0；～1為高抗，2為中抗，3～4為慢病性，3為中感，4為高感。

苗期抗病性鑒定于2021年1月份在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行，材料播種于塑料盒（直徑8.0cm，高10．0cm）中，待出苗且第一葉伸展后分別接種致病性小種CYR33、CYR34以及混合小種，待感病對(duì)照品種‘銘賢169，充分發(fā)病后進(jìn)行抗病性鑒定。按照《小麥區(qū)域試驗(yàn)品種抗條銹病鑒定技術(shù)規(guī)程》（NY/T 2953-2016）的0、0；、1、2、3、4記載反應(yīng)型，反應(yīng)型O為免疫，0；～2為抗病，3～4為感病，共調(diào)查3次，以最高反應(yīng)型為最終抗病性結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1小麥新品種‘蘭天132’和‘蘭天196’的選育

2007年-2015年，以抗病品種‘蘭天26號(hào)’為母本（含Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84基因），‘蘭天15號(hào)’為父本（含成株抗性基因Yr30/Lr27/Sr2），通過常規(guī)雜交系譜法結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行選育，在F2～F4分離世代，均通過分子標(biāo)記輔助選擇的方式成功獲得聚合成株抗性基因Yr30/Lr27/Sr2、全生育期抗病基因Yr9、Lr37/Yr17／Sr38和YrZH84的植株，并依據(jù)植株的成株抗病性及農(nóng)藝性狀特點(diǎn)選擇優(yōu)異株系進(jìn)行產(chǎn)量試驗(yàn)比較，最終選育出綜合性狀優(yōu)良，且具有Yr30/Lr27/Sr2、Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84基因聚合體的新品系‘蘭天132’（圖1），2014年-2017年參加甘肅省隴南山旱地冬麥區(qū)域試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)，于2018年通過甘肅省品種審定（甘審麥20180012）。

2012年-2019年，以‘C69-17-13-14-15-6-1’（含Yr30/Lr27/Sr2）為母本，以‘蘭天26號(hào)’（含Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84）為父本，通過常規(guī)雜交，系譜法結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇育成聚合Yr9、Yr30/Lr27/Sr2和Lr37/Yr17/Sr38育成新品系‘蘭天196，（圖1）。在F2、F3、F4分離世代，對(duì)具有抗病性且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株、株系進(jìn)行分子標(biāo)記跟蹤檢測(cè)，對(duì)中選的Fs株系進(jìn)行產(chǎn)量和適應(yīng)性試驗(yàn)，最終選擇具有抗病基因聚合體，且高抗條銹病、豐產(chǎn)性好、適應(yīng)性廣的新品系‘蘭天196’，并于2019年-2021年參加甘肅省隴南冬麥區(qū)區(qū)域試驗(yàn)，2021年-2022年參加生產(chǎn)試驗(yàn)，2023年通過甘肅省品種審定（甘審麥20230021）。

2.2條銹病抗病性鑒定

苗期分小種CYR33、CYR34和混合小種鑒定中，‘蘭天132，和親本‘蘭天15號(hào)’‘蘭天26號(hào)’對(duì)CYR33表現(xiàn)免疫，對(duì)CYR34和混合小種均表現(xiàn)感??；成株期抗病性鑒定中，‘蘭天132，和親本‘蘭天15號(hào)’表現(xiàn)免疫，親本‘蘭天26號(hào)’表現(xiàn)抗?。ǚ磻?yīng)型為0；～1），感病對(duì)照品種‘晉麥47’和‘輝縣紅’均高感條銹病，反應(yīng)型4，嚴(yán)重度100%（圖1，表2）。

對(duì)‘蘭天196’進(jìn)行苗期分小種CYR33、CYR34和混合小種鑒定，‘蘭天196’和親本‘C69-17-13-14-15-6-1’‘蘭天26號(hào)’均對(duì)CYR33表現(xiàn)免疫，但對(duì)CYR34和混合小種均表現(xiàn)感?。ǚ磻?yīng)型為3～4）；成株期抗病性鑒定中，‘蘭天196，表現(xiàn)高抗至免疫，親本‘C69-17-13-14-15-6-1’表現(xiàn)高度慢病性，嚴(yán)重度15%～20%，親本‘蘭天26號(hào)’表現(xiàn)抗?。ǚ磻?yīng)型為0～1）（表2）。

2.3主要農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量表現(xiàn)

小麥新品種‘蘭天132，為冬性、無芒、株高95.0cm、穗粒數(shù)44.5個(gè)、小穗數(shù)18.0個(gè)、千粒重47.1g。2014年-2015年、2015年-2016年參加甘肅省隴南旱地冬小麥區(qū)域試驗(yàn)，平均產(chǎn)量6.4t/hm2，較對(duì)照品種‘蘭天19號(hào)’增產(chǎn)5.9%。新品‘蘭天196，為冬性、無芒、株高103.2cm、穗粒數(shù)47.3個(gè)、小穗數(shù)18.6個(gè)、千粒重44.1g。2019年-2020年參加甘肅省隴南旱地冬小麥區(qū)域試驗(yàn)，平均產(chǎn)量6.2t/hm2，較對(duì)照品種‘蘭天19號(hào)’增產(chǎn)6.9%，居10個(gè)品系的第2位（表3）。‘蘭天132’‘蘭天196’均適宜在甘肅省隴南冬麥旱地品種類型區(qū)種植。

2.4 ‘蘭天132’和‘蘭天196’中已知抗病基因聚合體

用Yr9、Lr37/Yr17/Sr38、Yr30/Lr27/Sr2和YrZH84的分子標(biāo)記檢測(cè)親本‘蘭天15號(hào)’‘蘭天26號(hào)’‘C69-17-13-14-15-6-1’，育成新品種及抗病基因載體對(duì)照材料，在‘蘭天132’中檢測(cè)到成株抗性基因Yr30/L27/Sr2、全生育期抗病基因Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84。在‘蘭天196’中檢測(cè)到成株抗性基因Yr30/Lr27/Sr2、全生育期抗性基因Yr9和Lr37/Yr17/Sr38（圖2，表4）。

3結(jié)論與討論

基因聚合育種中，選擇含有目標(biāo)基因的親本進(jìn)行雜交至關(guān)重要。如果能夠明確優(yōu)良抗病品種中的抗性基因背景，可顯著提高多基因聚合品種的選育成功率。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所品質(zhì)實(shí)驗(yàn)室利用黃淮麥區(qū)主推品種‘百農(nóng)64’和‘魯麥21’雜交，育成了多基因聚合、兼抗型成株抗性小麥新品系。而西北越夏菌源區(qū)甘肅小麥抗病育種中多以引進(jìn)抗源或抗病基因?yàn)榭共∮H本和當(dāng)?shù)仄贩N雜交，親本中基因不清楚，抗病基因轉(zhuǎn)育效率低。對(duì)抗病親本‘蘭天15號(hào)’‘蘭天26號(hào)’和‘C69-17-13-14-15-6-1’進(jìn)行已知抗病基因分析，發(fā)現(xiàn)小麥品種‘蘭天15號(hào)’含有成株抗性基因Yr30/Lr27/Sr2和全生育期抗性基因YrZH84，‘蘭天26號(hào)’含有全生育期抗性基因Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84，品系‘C69-17-13-14-15-6-1’含有全生育期抗性基因Lr37/Yr17/Sr38、成株期抗性基因Yr30/Lr27/Sr2及其他未知基因。冬小麥‘蘭天15號(hào)’具有良好的豐產(chǎn)性、抗病性和廣適性，曾在甘肅、陜西、寧夏、青海等地推廣種植，‘蘭天26號(hào)’是甘肅省冬小麥主栽品種，推廣至今連續(xù)10余年推廣面積占甘肅省小麥面積的第一位?！瓹69-17-13-14-15-6-1’具有高產(chǎn)、持久抗病等特點(diǎn)。因此，利用該品種進(jìn)行雜交，優(yōu)異的性狀有利于新品種（系）的選育。此外，選育的小麥新品種‘蘭天132'和‘蘭天196，聚合了具有持久抗稈銹和條銹性且兼抗葉銹的成株抗性基因Yr30//r27/Sr2、兼抗葉銹、條銹和稈銹基因Lr37/Yr17／Sr38或YrZH84，及全生育期抗病基因Yr9，多效性基因聚合提高了育成品種防御多種病害的能力。

曾慶東等對(duì)33份已知Yr基因的單基因系對(duì)主要致病性小種CYR32、CYR33和CYR34的表現(xiàn)進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)僅有Yr5、Yr15和Yr61對(duì)中國當(dāng)前主要流行小種抗病，‘周8425B，對(duì)3個(gè)主要流行小種具有全生育期抗病性，其他基因均表現(xiàn)不同程度的感病，但發(fā)現(xiàn)部分Yr基因聚合的載體品種成株期表現(xiàn)良好的抗病性，如‘Hyak' （Lr37/Yr17/Sr38，YrTye）、‘Compair' （Yr8，Yr19）等具有多個(gè)Yr基因的小麥對(duì)中國主要流行小種具有成株抗性。位于小麥3BS染色體的多效性抗病基因Yr30/Lr27/Sr2與主效基因Sr33聚合后抗稈銹性保持至今已迨70年。位于IBL染色體的多效性抗病基因Lr46/Yr29/Prn39/Sr58雖具有部分抗性，但具有持久抗性特點(diǎn)。聚合多效性基因Lr34/Yr18/Prn38/Sr57、Lr46/Yr29/Pm39/Sr58、Lr67/Yr46/Pm46/Sr55及其他抗病基因，是CIM-MYT、美國、澳大利亞、加拿大及我國開展持久抗病品種選育的重要策略。胡朝月等對(duì)小麥抗條銹病載體品系進(jìn)行抗病性鑒定，發(fā)現(xiàn)Yr17的單基因系A(chǔ)vSYr17 NIL苗期對(duì)CYR17抗?。↖T：1）、對(duì)CYR32中感（IT： 3+）、對(duì)CYR33和CYR34感?。↖T：4），但成株期表現(xiàn)中感（IT：3～3+），具有一定的成株抗病性。近年來，以Yr5和YrZH22為抗源育成的品種已在生產(chǎn)中大面積推廣，但已發(fā)現(xiàn)對(duì)Yr5、Yr15具有毒性的新小種，YrZH22苗期在天水自然發(fā)病的田間表現(xiàn)感病，說明對(duì)YrZH22具有毒性的小種也出現(xiàn)了。能用于我國小麥育種的全生育期抗性和成株抗病基因較少。因此，育種中增加成株抗病基因和全生育期抗性基因的利用，一方面可以延長品種的抗病性保持時(shí)間，另一方面可降低菌源基地小麥品種在苗期對(duì)病原菌的抗性選擇壓力，減少小種變異頻率，降低新小種向主產(chǎn)區(qū)傳輸?shù)念l率。本研究聚合多效性成株抗性基因Yr30/Lr27/Sr2、全生育期抗病基因Yr9、Lr37/Yr17／Sr38和YrZH84，一方面通過基因聚合培育持久成株抗性品種，另一方面可減少在隴南育種中對(duì)Yr5、Yr15和YrZH22等有限的全生育期抗病基因的利用，減輕致病性小種的定向選擇，延長Yr5、Yr15和YrZH22等基因的抗性保持年限。

聚合成株抗病基因Yr30/Lr27/Sr2和全生育期抗病基因Yr9、Lr37/Yr17/Sr38和YrZH84，育成適宜在甘肅隴南推廣種植的小麥新品種‘蘭天132’和‘蘭天196’，成株期均高抗條銹病，并具有抗旱性和較好的豐產(chǎn)性?；蚓酆嫌N對(duì)提高隴南小麥品種抗病持久性具有重要意義，也可為我國選育具有多基因聚合的成株抗性品種提供可行的育種方法和優(yōu)異抗病親本。