影響紅鰭東方鲀生長(zhǎng)性狀的候選基因及其SNP的研究進(jìn)展

薛 雨,王秀利

(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧 大連 116023)

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)是暖水性海洋底棲魚類,分布在北太平洋西部,在我國(guó)各大海區(qū)都有捕獲。紅鰭東方鲀?nèi)怩r味美、營(yíng)養(yǎng)豐富,脂肪含量低,含有豐富的維生素B1、B2以及硒、鋅等多種微量元素,因此被譽(yù)為“魚中之王”。在中國(guó)養(yǎng)殖的眾多河鲀種類中,紅鰭東方鲀是個(gè)體最大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的品種之一,但仍面臨著種質(zhì)退化的問(wèn)題,部分企業(yè)河鲀親魚長(zhǎng)期使用,加上水質(zhì)下降、品種雜交等問(wèn)題使種質(zhì)資源退化,直接使河鲀養(yǎng)殖周期變長(zhǎng),導(dǎo)致養(yǎng)殖成本增加[1]。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是由單個(gè)核苷酸發(fā)生變異而引起在基因組水平上的DNA序列多態(tài)性,包括單個(gè)堿基的顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失[2]。根據(jù)在基因組上的分布位置不同,SNP可以分為基因編碼區(qū)SNPs (cSNPs)、基因間SNP (iSNPs)、基因周邊SNP (pSNPs),其中cSNPs和pSNPs會(huì)對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生影響[3]。根據(jù)對(duì)生物遺傳性狀的不同影響,cSNPs包括兩種方式:同義突變(編碼序列變化不影響翻譯后氨基酸的序列)和非同義突變(編碼序列變化會(huì)影響翻譯后氨基酸的序列變化,改變蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能)[4-6]。SNP具有遺傳穩(wěn)定性高、位點(diǎn)豐富且分布廣泛、富有代表性、二態(tài)性和等位基因性以及檢測(cè)快速(易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化)等特點(diǎn)[7]。

作為第三代分子標(biāo)記技術(shù),SNP已被廣泛應(yīng)用于其他物種。生長(zhǎng)性狀包括體長(zhǎng)、體重和體高等,為紅鰭東方鲀最為重要的經(jīng)濟(jì)性狀,直接影響到經(jīng)濟(jì)效益的高低[8]。調(diào)控紅鰭東方鲀生長(zhǎng)的特定基因,主要由三部分組成:編碼氨基酸的外顯子、非編碼內(nèi)含子以及驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子,當(dāng)任意一部分核酸序列發(fā)生插入、缺失、替換等變化時(shí),都可能影響(上調(diào)/下調(diào))基因或上下游基因的表達(dá)水平甚至改變基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和活性[9],使紅鰭東方鲀的生長(zhǎng)發(fā)育受到影響。部分研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些與紅鰭東方鲀生長(zhǎng)相關(guān)的候選基因中存在著與生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著相關(guān)性的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP),如生長(zhǎng)激素釋放激素GHRH基因、肌細(xì)胞生成素MyoG基因等。

1 生長(zhǎng)軸GHRH/GH/IGF-1相關(guān)基因

對(duì)于生長(zhǎng)而言,主要的內(nèi)分泌途徑是垂體在生長(zhǎng)激素釋放激素(growth hormone-releasing hormone,GHRH)的誘導(dǎo)下分泌的生長(zhǎng)激素 (Growth Hormone,GH)與靶器官表面的生長(zhǎng)激素受體 ( Growth Hormone Receptor,GHR)結(jié)合后激發(fā)肝臟分泌類胰島素生長(zhǎng)因子1 (Insulin -like growth factor 1,IGF-1),即GHRH-GH-IGE-1軸[10]。

1.1 生長(zhǎng)激素釋放激素基因(ghrh)

GHRH是胰高血糖素超家族的成員之一,其主要功能是通過(guò)與垂體前葉的GHRHR結(jié)合來(lái)刺激GH的合成和分泌[11]。除此之外,GHRH還具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育,參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖分化等生物學(xué)過(guò)程的功能[12-14]。

在斑馬魚 (Daniorerio)等魚類研究中發(fā)現(xiàn),與大多數(shù)脊椎動(dòng)物相同,ghrh基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成[15]。在紅鰭東方鲀的研究中,王梓祎等[16]用直接測(cè)序法在紅鰭東方鲀的ghrh基因上篩選到了7個(gè)SNP位點(diǎn),分別為C18T、G315C、C1083T、A1524G、G2017A、T2125C、G2256A,并在其中篩選出3個(gè)與大多數(shù)生長(zhǎng)形狀具有顯著關(guān)聯(lián)性的三個(gè)位點(diǎn)。在其他水產(chǎn)動(dòng)物的研究中,Tao等[17]在北極紅點(diǎn)鮭(Salvelinusalpinus)含有g(shù)hrh的基因位點(diǎn)上篩選到1個(gè)與早期生長(zhǎng)之間存在顯著相關(guān)性的SNP位點(diǎn)。張世勇等[18]利用DNA混池測(cè)序法在斑點(diǎn)叉尾鮰 (Ictalurespunctatus)的ghrh基因內(nèi)含子上檢測(cè)到4個(gè)SNP位點(diǎn),經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)位點(diǎn)與生長(zhǎng)形狀存在顯著的相關(guān)性。Guo等[19]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)在半滑舌鰨 (Cynoglossussemilaevis)的ghrh的關(guān)聯(lián)圖譜上發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與生長(zhǎng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)。

1.2 生長(zhǎng)激素基因(gh)

GH是一種由腦垂體合成分泌的多肽蛋白,是垂體前葉的激素之一。魚類GH是由魚類腦垂體合成和分泌的一種多肽蛋白,對(duì)魚類的生長(zhǎng)發(fā)育起著促進(jìn)作用,參與并影響著魚類的多種代謝。黃軍[20]參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中紅鰭東方鲀和其他近緣物種的生長(zhǎng)激素序列,構(gòu)建了東方鲀生長(zhǎng)激素基因的進(jìn)化樹,運(yùn)用PCR電泳檢測(cè)和克隆測(cè)序技術(shù)在暗紋東方鲀、紅鰭東方鲀和星點(diǎn)東方鲀的gh基因的intron2、intron5以及3’非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)了多處包括堿基缺失、插入和一些單核苷酸突變。王沈同等[21]利用直接測(cè)序法從草魚的GH基因的3’部分序列中篩選到了9個(gè)SNPs,其中G2914T、T2966G位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)草魚的早期生長(zhǎng)存在顯著的影響。譚新等[22]通過(guò)直接測(cè)序等方法在鳙gh基因的第二個(gè)內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)了5個(gè)變異位點(diǎn),最終篩選到C982T位點(diǎn)與鳙的生長(zhǎng)性狀相關(guān)性顯著。魯雙慶等[23]采用長(zhǎng)段PCR及T-A克隆技術(shù)在對(duì)三種鱖魚的gh基因進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)了大量SNP位點(diǎn)。

1.3 類胰島素生長(zhǎng)因子-1基因(igf-1)

IGF-1是一種單鏈多肽,其進(jìn)化上高度保守,結(jié)構(gòu)上與胰島素原同源,在脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[24]。魚類IGF-1的mRNA主要表達(dá)在肝外組織如鰓、腦、生殖腺等中,由成體魚類肝臟合成[25]。于海龍等[26]通過(guò)序列的多重比較在紅鰭東方鲀的igf-1基因中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SNPs(T756A、G1116C),且兩個(gè)突變均發(fā)生在非編碼區(qū),又通過(guò)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該基因的T756A突變位點(diǎn)基因型與紅鰭東方鲀的部分生長(zhǎng)性狀具有極顯著的相關(guān)性。阮瑞霞等[27]分析了不同基因型與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性,在吉富羅非魚igf-1基因中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SNPs,其中位于內(nèi)含子1上的A1307G突變位點(diǎn)僅與雌魚的生長(zhǎng)性狀具有相關(guān)性,而位于內(nèi)含子3上的C6T突變位點(diǎn)除了在增重方面對(duì)雄魚和雌魚具有不同程度的顯著相關(guān)性外,在其他生長(zhǎng)性狀中此位點(diǎn)僅與雌魚存在顯著相關(guān)性。

2 調(diào)節(jié)肌肉生長(zhǎng)

2.1 生肌調(diào)節(jié)因子家族

肌肉調(diào)節(jié)因子 (myogenic regulatory factors,MRFs)基因家族編碼4種肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子,分別是MyoD、MyoG、Myf5和Myf6,它們是生成骨骼肌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,相互協(xié)作,調(diào)控肌肉的生成[28]。

其中,肌細(xì)胞生成素(myogenin,MyoG)基因?qū)∪獾幕蜣D(zhuǎn)錄、肌細(xì)胞生長(zhǎng)周期以及肌細(xì)胞的分化起調(diào)節(jié)作用。生肌決定因子(Myogenic determinant,Myf6)基因的編碼產(chǎn)物可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化融合成肌管[29]、促進(jìn)肌纖維的形成并且維持肌肉的表型[30]。于海龍等[26]通過(guò)序列的多重比較在紅鰭東方鲀的myog基因中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與生長(zhǎng)顯著相關(guān)的SNP突變位點(diǎn) (C434T、T617A),其中C434T發(fā)生在外顯子上,且為同義突變,而T617A處在非編碼區(qū)。同樣的,在紅鰭東方鲀的myf6基因中也發(fā)現(xiàn)了1個(gè)與生長(zhǎng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)(G113T)為同義突變。

2.2 肌肉生長(zhǎng)抑制素基因(mstn)

肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin,MSTN)基因能抑制MyoD家族成員轉(zhuǎn)錄活性負(fù)調(diào)控肌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育,其表達(dá)量與肌肉重量的變化呈反向變化[31]。Ying Wang等[32]通過(guò)DNA測(cè)序在mstn基因中發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP(A748G、C119T),分別位于第二外顯子和第二內(nèi)含子。

3 調(diào)節(jié)食欲和能量代謝

3.1 黑素皮質(zhì)素受體4基因(mc4r)

魚類黑素皮質(zhì)素受體4(melanocortin receptor4,MC4R)有其獨(dú)有的機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)能量平衡的調(diào)控。當(dāng)黑素皮質(zhì)素系統(tǒng)激活MC4R相關(guān)信號(hào)途徑時(shí),對(duì)魚類攝食起到抑制作用,Wan等[33]發(fā)現(xiàn)對(duì)鯉進(jìn)行饑餓處理可以讓鯉腦中mc4r及其他能量平衡調(diào)控基因表達(dá)量發(fā)生顯著減少, 且恢復(fù)攝食后顯著迅速回復(fù)。張麗等[34]通過(guò)對(duì)紅鰭東方鲀的mc4r基因的同源性比較發(fā)現(xiàn)了與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的2個(gè)SNP位點(diǎn)(G48A、G264A),且G264A為同義突變。

3.2 腦型脂肪酸結(jié)合蛋白基因(b-fabp)

有研究發(fā)現(xiàn),腦型脂肪酸結(jié)合蛋白的表達(dá)情況與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及神經(jīng)細(xì)胞的分化可能具有相關(guān)性35],利用原位雜交發(fā)現(xiàn),在斑馬魚發(fā)育早期,腦型脂肪酸結(jié)合蛋白(Brain fatty acid- binding protein,B-FABP)基因在其中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)[36]。楊曉等[37]利用重測(cè)序技術(shù)對(duì)紅鰭東方鲀?nèi)后w進(jìn)行SNP篩選,在b-fabp基因上共發(fā)現(xiàn)3個(gè)與生長(zhǎng)性狀具有相關(guān)性的SNP位點(diǎn)(C442T、G676A、A731C),其中C442T位于第二外顯子上,G676A和A731C位于第三內(nèi)含子上。

4 調(diào)節(jié)骨骼生長(zhǎng)

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Connective tissue growth factor,CTGF)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)軟骨發(fā)育和骨骼發(fā)生,在生物的多種組織和器官中能廣泛表達(dá)。周金旭等[38]通過(guò)多重比較在紅鰭東方鲀的ctgf基因上篩選到了14個(gè)SNP位點(diǎn),其中與生長(zhǎng)具有顯著相關(guān)性的SNP位點(diǎn)分別為C23T、G39T、C270G,且3個(gè)SNP位點(diǎn)皆為錯(cuò)義突變。

5 prkca、pacap、kras、insr、rheb等基因

prkcp為胰高血糖素家族,prkca不但與生長(zhǎng)相關(guān),還在細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用。kras在細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中起重要作用。kras能生成一種蛋白質(zhì),作為信號(hào)指令參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂和增殖并承擔(dān)分化等特殊功能。insr除了結(jié)合胰島素、胰島素受體還可以結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFI和IGFⅡ)。rheb是一種蛋白質(zhì)編碼基因。與RHEB相關(guān)的疾病包括半巨腦畸形和結(jié)節(jié)性硬化癥。王梓祎[39]運(yùn)用全基因組測(cè)序檢測(cè)出的67個(gè)與紅鰭東方鲀體質(zhì)量和體長(zhǎng)極顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn),并進(jìn)行基因注釋和驗(yàn)證,最后通過(guò)實(shí)驗(yàn)總結(jié)及查閱文獻(xiàn)初步確定,prkca(NC 042291. 1,14965050)、pacap(NC 042306. 1,5049379)、kras(NC 042293.1 7196736)、insr(NC 042304. 1,9589878)、rheb(NC 042306.1 3602613)基因及位點(diǎn)可能與生長(zhǎng)相關(guān)。

6 結(jié)束語(yǔ)

隨著生物技術(shù)的發(fā)展,SNP標(biāo)記已受到各國(guó)研究者的廣泛關(guān)注,成為分子領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。在關(guān)于篩選與紅鰭東方鲀生長(zhǎng)性狀相關(guān)SNPs的研究中,對(duì)已被識(shí)別的候選基因與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析并深度挖掘出其中存在的SNP位點(diǎn),已成為目前篩選分子標(biāo)記應(yīng)用最為廣泛的方法。目前,在影響紅鰭東方鲀生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因的研究中,大部分基因都與肌肉生長(zhǎng)調(diào)控因子家族和生長(zhǎng)軸相關(guān),且篩選出的生長(zhǎng)顯著相關(guān)的SNPs位點(diǎn)位于外顯子、內(nèi)含子、5′調(diào)控區(qū)、3′調(diào)控區(qū)上。紅鰭東方鲀產(chǎn)業(yè)方興未艾,找到與體長(zhǎng)、體重、肌肉生長(zhǎng)和骨骼發(fā)育相關(guān)的 SNPs位點(diǎn)和疑似與之相關(guān)的候選基因,為紅鰭東方鲀的分子標(biāo)記輔助選育提供更多的科學(xué)依據(jù)。