鴨圓環(huán)病毒病研究進(jìn)展

李容容，姜世金

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271018）

1 病原學(xué)特征

鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DuCV）屬圓環(huán)病毒科中的圓環(huán)病毒屬，在電子顯微鏡下其體型和其他圓環(huán)病毒差不多，直徑在15～16 nm 左右，是目前所知的最小的動(dòng)植物病毒。DuCV 沒有囊膜，呈現(xiàn)二十面體對(duì)稱的單股負(fù)鏈DNA 結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，DuCV-1/2 很難在細(xì)胞中生長(zhǎng)，但有報(bào)道稱，這種病毒可以在外周血單核細(xì)胞（Peripheral blood monolayer cells, PBMC）、胚胎卵和鴨子中繁殖，并開發(fā)出了相關(guān)滅活疫苗[1]。目前對(duì)DuCV 病原學(xué)特征的研究有限，主要集中在PCR 檢測(cè)和全基因組測(cè)序分析2 個(gè)方面。而未來(lái)的研究需要建立更易感的細(xì)胞系，優(yōu)化培養(yǎng)條件，使該病毒的體外培養(yǎng)更加穩(wěn)定可重復(fù)。

1.1 鴨圓環(huán)病毒的基因組結(jié)構(gòu)

DuCV 的基因組均為單股負(fù)鏈的環(huán)狀DNA分子，其典型的遺傳特點(diǎn)為有3 個(gè)主要開放閱讀框（Rep、Cap、ORF3）、4 個(gè)基因間重復(fù)序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及滾動(dòng)圈復(fù)制和位于Rep 蛋白中的dNTP 結(jié)合域的保守基序。

1.2 三個(gè)主要開放閱讀框

3 個(gè)主要開放的閱讀框Rep、Cap、ORF3，其中Rep 和Cap 編碼的蛋白大部分是圓環(huán)病毒屬的病毒共有的，也是被證實(shí)與病毒復(fù)制相關(guān)的2個(gè)蛋白質(zhì)。Rep 基因，即ORF1，編碼復(fù)制蛋白（replication protein）。Cap 基因，即ORF2，編碼衣殼蛋白（Capsid protein）。ORF3 基因在Rep的互補(bǔ)鏈上，編碼的ORF3 蛋白質(zhì)是一個(gè)具有促細(xì)胞凋亡活性的病毒蛋白，可能是病毒致病的重要因素之一[2]。

1.3 四個(gè)基因間重復(fù)序列

通過利用dottup 程序進(jìn)行基組序列解析，發(fā)現(xiàn)在DuCV 的Rep 和Cap 2 個(gè)ORF 的起始密碼子之間，出現(xiàn)一個(gè)四重串聯(lián)重復(fù)序列（OTR）（CACTTGGGCAG 或者CACTTGGCAG）[3]，而此特征并不存在于其他圓環(huán)病毒基因組。

1.4 莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及滾動(dòng)圈復(fù)制和位于Rep 蛋白中的dNTP 結(jié)合域的保守基序列

在ORF1 和ORF2 的2 個(gè)起始密碼子中間有一段不編碼的區(qū)段，中間保留著一種保守的堿基順序（TATTATTAC）的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。有2 個(gè)反向重復(fù)序列（10 bp 的step）在順序的上游和下游，順序旁邊還有2 個(gè)正向反復(fù)的被看作是和DuCV基因組的滾環(huán)拷貝有關(guān)的六堿基序列GTACTC（nt11～17 和nt18～23）。在莖環(huán)結(jié)構(gòu)與Rep 基因的起始密碼子之間，所對(duì)應(yīng)的 nt25～47 序列，存在著一個(gè)堿基突變或缺失的高突變程度區(qū)域[4]。

2 流行病學(xué)

目前已知DuCV 有3 種基因型：DuCV-1、DuCV-2，以及最近在中國(guó)湖南省發(fā)現(xiàn)的DuCV-3。臨床上感染主要是DuCV-1。DuCV-1 包含4 個(gè)子類別DuCV-la、DuCV-1b、DuCV-1c 以及新概念的子類別DuCV-1d；DuCV-2 分為3 種亞型包括DuCV-2a、DuCV-2b、DuCV-2c。關(guān)于DuCV-3 目前沒有過多的報(bào)道。DuCV-3 于2022 年2 月在中國(guó)湖南省一個(gè)農(nóng)場(chǎng)的成年產(chǎn)蛋鴨中被鑒定出來(lái)，其基因組大小為1 755 nt。DuCV-3 與DuCV-1/2和鵝圓環(huán)病毒（Goose circovirus, GoCV）表現(xiàn)出密切的關(guān)系，并與從鳥類和其他動(dòng)物中鑒定出的其他圓環(huán)病毒表現(xiàn)出相當(dāng)大的距離，表明DuCV-3 是一個(gè)獨(dú)立的物種，可能由水禽圓環(huán)病毒進(jìn)化而來(lái)，其是否是導(dǎo)致鴨子產(chǎn)蛋量下降的致病性病原體還不得而知[5]。就目前已知來(lái)講，DuCV 基因型與宿主品種或地區(qū)沒有關(guān)聯(lián)的結(jié)論[6]。

DuCV 于2003 年在德國(guó)首次發(fā)現(xiàn)于羽化紊亂、身體狀況不佳且體重較輕的綠頭鴨[7]。姜世金首次對(duì)中國(guó)內(nèi)地的病死鴨病料進(jìn)行PCR 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果確認(rèn)中國(guó)內(nèi)地存在DuCV 感染[8]。隨后，該病毒在許多國(guó)家被廣泛檢測(cè)到，包括美國(guó)、韓國(guó)、匈牙利和越南[9]。DuCV 感染可能影響免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制，并導(dǎo)致更嚴(yán)重的繼發(fā)感染。同時(shí)DuCV 普遍存在于番鴨、北京鴨中，許多證據(jù)表明，這種病毒可以水平和垂直傳播，并可能導(dǎo)致持續(xù)感染，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[10-11]。

3 致病機(jī)理

DuCV 的主要特征是宿主誘導(dǎo)的免疫抑制，導(dǎo)致繼發(fā)性感染或宿主多次感染。禽類感染臨床癥狀的共同特征是生長(zhǎng)和發(fā)育遲緩，以及明顯的背部結(jié)痂，羽毛凌亂過程。病毒可能存在于法氏囊、胸腺、肝膽囊、脾臟和腎臟中，其中法氏囊是DuCV 的主要生殖器官。DuCV 的感染會(huì)損害身體的淋巴組織，降低免疫功能，從而降低細(xì)胞和體液的免疫功能，增加其他致病感染的可能性。彭艷伶等的研究論文提到，四川省DuCV 與鴨大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌（RA）、鴨病毒性肝炎Ⅰ型病毒（DHV）等混感率較高[12]。劉少寧等人研究表明，鴨圓環(huán)病毒病和鴨疫里默氏桿菌病或者大腸桿菌等細(xì)菌二重感染率達(dá)到9.57%[4]。魯璇等人的研究結(jié)果表明，山東地區(qū)DuCV 的流行主要以DuCV-1 為主，德州地區(qū)DuCV-1 和DuCV-2 混合感染嚴(yán)重[13]。研究表明，2020 年下半年在山東省內(nèi)的DuCV 和細(xì)菌混合感染檢出率為86.05%（37/43），新型鵝細(xì)小病毒同DuCV 在雛鴨體內(nèi)的共感染均表現(xiàn)出高度的協(xié)同性，造成更嚴(yán)重的免疫抑制和組織損傷，進(jìn)而導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床癥狀[14-17]。

4 臨床癥狀

感染的鴨子臨床特征是發(fā)育遲緩、羽毛干燥、呼吸困難、食欲不振以及生長(zhǎng)和發(fā)育問題。病毒通過呼吸道進(jìn)入器官后，導(dǎo)致呼吸組織逐漸腫脹，最后由于呼吸道狹窄而造成呼吸困難。感染DuCV 的鴨的臨床癥狀主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)受到抑制或體重出現(xiàn)減輕，羽毛雜亂，羽毛軸出血。

5 病理變化

病死鴨肝臟上發(fā)生土黃色斑點(diǎn)，膽汁稀少且明顯下降；部分鴨的淋巴細(xì)胞嚴(yán)重破壞，炎性細(xì)胞大量滲出，法氏囊內(nèi)的淋巴細(xì)胞甲硫氨酸腦啡肽水平顯著降低，法氏囊壞死等。有研究成果指出，DuCV 在自然的生殖狀態(tài)下有可能會(huì)引起原發(fā)性硬化性膽管炎[18]。

6 診斷

目前，實(shí)驗(yàn)室中關(guān)于DuCV 的檢測(cè)所使用的方法主要包括多重PCR 方法、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（Ring-mediated isothermal amplification, LAMP）、熒光定量PCR、Taq-man 探針法、SYBR GreenI 的雙鏈實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)等。

多重PCR 特異性好，靈敏度高，而間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)則更經(jīng)濟(jì)且實(shí)用，可進(jìn)行更大規(guī)模治療與臨床檢測(cè)；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法可在與核酸等溫的情況下，進(jìn)行快速且直接診斷與檢測(cè)臨床標(biāo)本。但相較傳統(tǒng)的PCR 方法來(lái)說(shuō)，熒光定性PCR 方法，靈敏度更高、重疊性好、特異率更高、定性更加精確、速率也較快，特別是SYBR GreenI 的雙鏈實(shí)時(shí)熒光定性PCR 方法，能夠通過Tm 值識(shí)別鴨圓環(huán)病毒和小鴨瘟病毒。而除了上述這些技術(shù)，核酸探針雜交檢驗(yàn)技術(shù)也廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢查中，其檢出靈敏度大大不及PCR檢驗(yàn)，但是可重復(fù)性高和穩(wěn)定性好[19]。目前有實(shí)驗(yàn)室已制備了基于DuCV Cap 蛋白單克隆抗體的膠體金抗原檢測(cè)試紙條，這對(duì)于DuCV 的基層診斷和篩查工作是非常方便快捷的[20]。

7 綜合防控措施

7.1 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

嚴(yán)格科學(xué)管理，遵守“預(yù)防為主、防重于治”八字方針，遵循全進(jìn)全出的防疫措施，保證飼喂飼料健康，隔離病鴨，及時(shí)處理病死鴨的飼養(yǎng)原則。由于DuCV 對(duì)外界的物理、化學(xué)因素抵御力不強(qiáng)，所以定期對(duì)鴨舍進(jìn)行通風(fēng)消毒是消滅鴨圓環(huán)病毒病的有效措施。此外，需要注意的是種鴨的引進(jìn)必須經(jīng)過嚴(yán)格檢疫，一定要先隔離再混群。

7.2 藥物治療

目前還沒有針對(duì)DuCV 的防治藥物，但有研究表明，利用植物多糖在體內(nèi)和體外均抑制DuCV 誘導(dǎo)的PBMC 凋亡且具有抗DuCV 活性的原理，感染DuCV 后雛鴨前5 d 口服16 mg/只·d植物多糖，5 d 后8 mg 植物多糖，在體內(nèi)可以提高鴨的免疫能力，促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，降低病毒載量，在體外能夠減少DuCV 引起淋巴細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能，明顯減弱DuCV 的感染[21]，其中黃芪多糖、松花粉多糖效果要優(yōu)于蘆薈多糖、無(wú)花果葉多糖。也可利用抗病毒類中草藥板藍(lán)根10 g、白術(shù)3 g、黨參5 g、陳皮3 g、黃芪10 g、金銀花10 g、蒼術(shù)5 g、連翹10 g、當(dāng)歸5 g 進(jìn)行治療[12]。

7.3 疫苗免疫

在還沒有獲得病毒體外培養(yǎng)方法的前提下，Cap 或ORF3 的亞單位疫苗或卵黃抗體將成為下一個(gè)有效預(yù)防鴨圓環(huán)病毒病的候選方法。使用在體外PBMC 增殖的DuCV 滅活后免疫雛鴨，可誘導(dǎo)強(qiáng)大的細(xì)胞保護(hù)能力，并誘發(fā)形成了更高的抗體水平，免疫效應(yīng)也較好[1]。以含有Cap 編碼基因的DuCV DNA 疫苗免疫，也能夠誘發(fā)良好的特異性免疫反應(yīng)，降低鴨群感染DuCV 的幾率[22]。

8 結(jié)語(yǔ)

目前人們對(duì)DuCV 的發(fā)病機(jī)制和危害性的了解尚有許多欠缺。由于DuCV 尚沒有體外培養(yǎng)方式，人們對(duì)于它的了解尚十分膚淺。該病是一種十分嚴(yán)峻的免疫抑制性疾病，流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，此病已在中國(guó)鴨群中普遍存在，它可以降低鴨群的免疫力，使鴨群更易感其他嚴(yán)重的疾病，而且目前在湖南省又發(fā)現(xiàn)DuCV-3 這種新的血清型，這給養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)。未來(lái)應(yīng)該更深入地研究其發(fā)病機(jī)制，以期能夠更好的防控該病，減少給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)的嚴(yán)重危害。