枕神經(jīng)電刺激對慢性偏頭痛模型大鼠疼痛相關(guān)行為的影響 *

毛靜瑞 李 揚(yáng) 劉穎璐 孟凡超 劉若卓 韓 珣△ 于生元△

（1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)學(xué)部，北京 100853）

偏頭痛是一種持續(xù)4～72 小時(shí)的中重度單側(cè)搏動性頭痛，常伴惡心嘔吐、畏光畏聲，以及自主神經(jīng)、精神、感覺和運(yùn)動功能的障礙，我國偏頭痛發(fā)病率高達(dá)9.3%[1]。慢性偏頭痛(chronic migraine,CM)在一般人群中的患病率為1%～3%，每年有2.5%的偏頭痛病人發(fā)展為CM，CM 發(fā)作至少15 天并持續(xù)不少于3 個月，且每月頭痛性質(zhì)為偏頭痛的天數(shù)不少于8 天，嚴(yán)重影響病人的生活和工作[2]。目前臨床上治療偏頭痛主要是藥物治療，在最近對8500多名慢性偏頭痛病人的研究中，堅(jiān)持口服藥物6 個月預(yù)防治療的病人僅為25%，能堅(jiān)持口服藥物12個月的病人不到14%[3]。因此亟待發(fā)展有效、安全和持久的CM 非藥物治療方法。

枕神經(jīng)電刺激(occipital nerve stimulation, ONS)是一種備受關(guān)注的非藥物治療方法，本團(tuán)隊(duì)[4]前期的一項(xiàng)納入110 名受試者進(jìn)行關(guān)于評估經(jīng)皮ONS治療偏頭痛的研究中發(fā)現(xiàn)其可顯著減少偏頭痛病人的頭痛持續(xù)時(shí)間，證實(shí)ONS 是治療偏頭痛的有效辦法。植入式ONS 是一種安全而相對有效治療慢性疼痛的方法，其植入技術(shù)難度不高，易于開展，因其長期持續(xù)治療對慢性頑固性疼痛的治療比經(jīng)皮神經(jīng)電刺激更為有效[5]。張德仁等[6]曾報(bào)道1 例植入式ONS 成功治療頑固性枕神經(jīng)痛。多項(xiàng)國外臨床試驗(yàn)探究了植入式ONS 治療CM 病人的有效性及安全性。Schwedt 等[7]提出ONS 對慢性頭痛的緩解率大于50%。Saper 等[8]發(fā)表了ONS 治療CM的前瞻性多中心隨機(jī)單盲對照研究，結(jié)果表明ONS緩解CM 病人頭痛發(fā)作有效率為39%。Silberstein等[9]進(jìn)行ONS 治療CM 的多中心隨機(jī)雙盲對照研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組和對照組比較無差異。關(guān)于ONS治療CM 長期效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)其可降低頭痛發(fā)作天數(shù)和緩解頭痛強(qiáng)度[10]。目前的臨床研究對ONS 治療CM 的有效性存在爭議，且ONS 治療的機(jī)制尚不清楚。本研究采用經(jīng)證實(shí)的CM 模型來探究ONS是否改變了大鼠頭面部疼痛閾值及伴隨哪些相關(guān)行為學(xué)的改變，為進(jìn)一步探究ONS 治療CM 的臨床實(shí)用性及ONS 作用機(jī)制探索提供思路。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動物：雄性SPF 級Sprague-Dawley (SD)大鼠21 只，體重180～220 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司 [許可證號SCXZ（京2019-0010）]，飼養(yǎng)于中國人民解放軍總醫(yī)院SPF 級動物房，溫度22～25℃、濕度40%～60%、12 h/12 h 明暗光照周期、食物和水充足。本實(shí)驗(yàn)過程通過中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，嚴(yán)格遵守動物實(shí)驗(yàn)倫理相關(guān)規(guī)定（倫審第S2021-349-02 號）。

主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及耗材：vonFrey 針刺痛覺測試套件（Anesthesio，美國）；在體多通道神經(jīng)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（Plexon，美國）；25 μl 微量注射器（上海高鴿，平頭）；給藥套管套裝（瑞沃德，62001、62101、62201、62501）。

主要試劑及配制：5-HT (Sigma-Aldrich，H9523)；前列腺素E2（麥克林，P860711）；組胺 (Sigma-Aldrich)；緩激肽（麥克林，B860429）；PBS 磷酸鹽緩沖液 (Solarbio，P1010)。用PBS 溶液溶解5-HT、前列腺素E2、組胺、緩激肽粉末，其終濃度分別為2 mM、0.2 mM、2 mM、2 mM，配制成炎癥湯(inflammatory soup, IS)溶液。

2.實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)分組及流程：21 只SD 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成慢性偏頭痛模型大鼠組（CM 組）、枕神經(jīng)電刺激干預(yù)慢性偏頭痛模型大鼠組（ONS + CM組）、對照組（Con 組），每組7 只。待大鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后制備CM 模型，在置管術(shù)恢復(fù)7 天后首先測定基線痛閾，再用Cineplex?行為分析系統(tǒng)采集大鼠基線行為數(shù)據(jù)15 min。第1、5、9、14 次IS輸注后24 h 先進(jìn)行頭面部機(jī)械痛閾測定及采集大鼠15 min 行為數(shù)據(jù)，再進(jìn)行下次IS 輸注。于第14 次IS 輸注后24 h 進(jìn)行ONS 術(shù)，術(shù)后恢復(fù)24 h 后測定大鼠頭面部機(jī)械痛閾及采集大鼠行為數(shù)據(jù)15 min。

CM 模型制備：三組大鼠均以3%戊巴比妥鈉50 mg/kg 腹腔注射麻醉。備皮、固定及消毒。做顱頂部切口，暴露顱骨。于距前囟 + 1.5 mm、橫向 + 1.5 mm 處鉆一直徑為0.9 mm 圓孔（避免劃破硬腦膜）。將給藥導(dǎo)管置于孔上，用牙科水泥固定（見圖1），縫合切口，碘伏消毒。術(shù)后給予頭孢地尼分散片(10 mg/kg)灌胃3 日，以預(yù)防術(shù)后感染發(fā)生。每只大鼠在同等條件下單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。術(shù)后恢復(fù)7 天后，CM 組和ONS + CM 組大鼠開始每日通過給藥導(dǎo)管輸注10 μl IS刺激硬腦膜，連續(xù)輸注14 天，Con 組給予等量PBS 緩沖液。

圖1 輸注IS 導(dǎo)管置管術(shù)Fig.1 Implantation of the cannula used to infuse IS

ONS：IS 輸注14 天后，ONS + CM 組大鼠禁食過夜，次日手術(shù)。刺激電極滅菌消毒。大鼠以4%異氟烷吸入麻醉成功后固定于操作臺，備皮、消毒。于枕骨上緣至第3 頸椎做正中切口，暴露手術(shù)視野，使用眼科鑷鈍性分離肌肉，暴露枕神經(jīng)。將刺激電極分別放置于兩側(cè)枕神經(jīng)（見圖2），切口敷以礦物油保持組織濕潤。ONS：2/100 Hz，1 mA，刺激5 min，間隔1 min，共刺激3 次(15 min)，電流強(qiáng)度以引起大鼠枕部局部肌肉收縮最小強(qiáng)度值為上限?？p合及術(shù)后同前。CM 組和Con 組均進(jìn)行同樣的手術(shù)且將電極放置于枕神經(jīng)上但未進(jìn)行通電。

圖2 枕神經(jīng)刺激電極放置術(shù)Fig.2 Electrode implantation to produce ONS

多部位分析頭面部機(jī)械痛閾：疼痛閾值檢測均在IS 輸注后24 h 和ONS 后24 h 測定，由vonFrey纖維絲測試大鼠雙側(cè)眼眶周圍、前額及枕部皮膚。纖維絲刻度范圍為0.16～26 g (0.16 g、0.4 g、0.6g、1.0 g、1.4 g、2 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、10.0 g、15.0 g、26 g)。陽性反應(yīng)為出現(xiàn)前爪強(qiáng)烈的撥去纖維絲、頭部快速回縮、甩頭或尖叫中任意一種。數(shù)據(jù)采用up-and-down 法計(jì)算疼痛閾值記為此次測試的疼痛閾值。無論檢測疼痛閾值還是硬腦膜給藥，均需要大鼠充分適應(yīng)環(huán)境平靜的狀態(tài)下進(jìn)行。

其他疼痛相關(guān)行為分析：本實(shí)驗(yàn)需在正常光線且安靜的環(huán)境中進(jìn)行，于每次IS 輸注后24 h 以及ONS干預(yù)后24 h 測定，采用CinePles studio V3 記錄大鼠行為15 min，采用CinePles Editor V3 分析視頻數(shù)據(jù)。

觀察指標(biāo)：①水平運(yùn)動總距離(moving distance,MD)；②探索行為 (exploration behavior, EB)：兩后爪著地，兩前爪向上或趴于籠壁，觸須及口有嗅探動作；③凍結(jié)行為(freezing episode, FE)：四只爪子與地板接觸，觸須不動；④面部梳理行為 (facial grooming)：兩前爪輕柔快速接觸面部區(qū)域的行為模式；⑤身體梳理行為 (body grooming)：兩前爪、舌頭或門牙接觸到面部以外的身體區(qū)域；⑥同側(cè)后爪面部梳理：置管同側(cè)后爪強(qiáng)烈抓撓頭面部或置管處；⑦同側(cè)后爪身體梳理：置管同側(cè)后爪強(qiáng)烈抓撓頭面部以外的身體其他區(qū)域。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0 (IBM, Armonk, New York, USA) 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)；對服從或近似服從正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，對前后測量資料，使用重復(fù)測量方差分析法，事先進(jìn)行球形檢驗(yàn)，未通過球形檢驗(yàn)時(shí)使用Green-House 矯正法分別分析組別、時(shí)間的主效應(yīng)及交互效應(yīng)，后使用組單因素方差分析進(jìn)行差異分析（兩兩比較使用LSD 法）和單因素重復(fù)測量方差分析、配對樣本t檢驗(yàn)分析組別及時(shí)間的簡單效應(yīng)。對未服從正態(tài)分布的計(jì)量資料，使用中位數(shù)（上四分位數(shù)、下四分位數(shù)）進(jìn)行描述，使用廣義估計(jì)方程分析法分析組別、時(shí)間的主效應(yīng)及交互效應(yīng)，后使用非參數(shù)Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)和Frideman 檢驗(yàn)、符號秩檢驗(yàn)分析組別及時(shí)間的簡單效應(yīng)。P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究均為雙側(cè)檢驗(yàn)。圖片用Graphpad prism (ver.8.0.1) 軟件繪制。

結(jié) 果

1.三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)頭面部機(jī)械痛閾的變化

眶周機(jī)械痛閾的變化：基線、第1 次、第5 次IS 輸注后三組大鼠的眶周機(jī)械痛閾無顯著差異。第9 次、第14 次IS 輸注后三組大鼠間出現(xiàn)顯著差異(P< 0.001)，ONS + CM 組和CM 組機(jī)械痛閾分別較Con 組顯著下降。給予ONS 后24 h，ONS + CM 組較CM 組機(jī)械痛閾顯著升高(P< 0.05)，但兩組仍顯著小于Con 組（見圖3）。

圖3 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)眶周機(jī)械痛閾比較***P < 0.001，與Con 組相比；#P < 0.05，與CM 組相比Fig.3 Comparison of periorbital mechanical threshold among three groups of rats at different time***P < 0.001, compared with group Con; #P < 0.05,compared with group CM.

前額機(jī)械痛閾的變化：基線、第1 次IS 輸注后三組大鼠前額機(jī)械痛閾無顯著差異，第5 次IS 輸注后CM 組較Con 組顯著下降(P< 0.05)，第9 次、第14 次IS 輸注后三組大鼠出現(xiàn)顯著差異(P< 0.001)，ONS + CM 組和CM 組分別較Con 組顯著下降。給予ONS后24 h，ONS + CM組較CM組顯著升高(P< 0.01)，與Con 組無顯著差異（見圖4）。

圖4 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)前額機(jī)械痛閾比較*P < 0.05，***P < 0.001，與Con 組相比；##P < 0.01，與CM 組相比Fig.4 Comparison of prefrontal mechanical threshold among three groups of rats at different time*P < 0.05, ***P < 0.001, compared with group Con;##P < 0.01, compared with group CM.

枕部機(jī)械痛閾的變化：基線、第1 次、第5 次IS 輸注后三組大鼠的枕部機(jī)械痛閾無顯著差異。第9 次、第14 次IS 輸注后三組大鼠間出現(xiàn)顯著差異，ONS + CM 組和CM 組分別較Con 組顯著下降(P<0.01,P< 0.001)。給予ONS 后24 h，三組間無顯著差異（見圖5）。

圖5 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)枕部機(jī)械痛閾比較**P < 0.01，***P < 0.001, 與Con 組相比Fig.5 Comparison of occipital mechanical threshold among three groups of rats at different time**P < 0.01, ***P < 0.001, compared with group Con.

2.三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)水平運(yùn)動總距離變化

時(shí)間和組別均對大鼠MD 有顯著影響且兩者之間相互影響（F組別= 5.095；F時(shí)間= 53.555；F交互=5.095；P組別= 0.001；P時(shí)間= 0.001；P交互= 0.001，均成立）。①基線、第1 次IS 輸注后三組大鼠的MD 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第5 次、第9 次、第14 次IS 輸注后ONS + CM 組和CM 組均較Con 組顯著下降；ONS 干預(yù)后，ONS + CM 組較CM 組顯著增加，但顯著低于Con組，CM組仍顯著低于Con組（見表1、圖6）。②ONS + CM 組和CM 組MD 均隨IS 輸注次數(shù)增加而減少，在第5 次輸注后出現(xiàn)顯著下降且持續(xù)至第14 次輸注后，ONS 后ONS + CM 組MD 較ONS 前顯著增加，但處于第5 次和第9 次IS 輸注期間水平，未恢復(fù)至基線水平；CM 在假手術(shù)前后MD 無明顯差異。Con 組大鼠MD 在第5、9、14 次輸注IS 后均較基線明顯下降，但其兩兩之間無顯著差異，且假手術(shù)前后該組大鼠MD 也無明顯差異（見補(bǔ)充表1）。

表1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)水平運(yùn)動總距離比較Table 1 Comparison of moving distance (MD) among three groups of rats at different time

圖6 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)水平運(yùn)動總距離變化*P < 0.05，與Con 組相比；#P < 0.05，與CM 組相比Fig.6 Comparison of moving distance among three groups of rats at different time*P < 0.05, compared with group Con; #P < 0.05, compared with group CM.

3.三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)探索行為變化

時(shí)間和組別均對大鼠EB 有顯著影響且兩者之間相互影響（F組別= 37.458；F時(shí)間= 38.718；F交互=4.266；P組別= 0.001；P時(shí)間= 0.001；P交互= 0.001，均成立）。①基線、第1 次、第5 次IS 輸注后三組大鼠的EB 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第9 次、第14 次IS輸注后ONS + CM 組和CM 組均較Con 組顯著下降；ONS 干預(yù)后，ONS + CM 組較CM 組顯著增加，但顯著低于Con 組，CM 大鼠仍顯著低于Con 組（見表2、圖7）。②ONS + CM 組和CM 組大鼠EB 隨IS 輸注次數(shù)增加而減少，在第9 次IS 輸注后出現(xiàn)差異性下降且持續(xù)至第14 次輸注后，ONS 后ONS + CM 組EB 較ONS 前顯著增加，但處于第5次和第9 次IS 輸注期間水平，未恢復(fù)至基線水平；CM 在假手術(shù)前后EB 無明顯差異。Con 組大鼠EB在第9、14 次輸注IS 后均較基線明顯下降，但其兩兩之間比較無明顯差異，且假手術(shù)前后該組大鼠EB 也無明顯差異（見補(bǔ)充表2）。

表2 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)探索行為比較Table 2 Comparison of exploration behavior (EB) among three groups of rats at different time

圖7 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)探索行為變化*P < 0.05，與Con 組相比；#P < 0.05，與CM 組相比Fig.7 Comparison of exploration behavior among three groups of rats at different time*P < 0.05, compared with group Con; #P < 0.05,compared with group CM.

4.三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)凍結(jié)行為變化

時(shí)間和組別均對大鼠FE 有顯著影響且兩者之間存在相互作用（對主效應(yīng)和交互效應(yīng)：=183.339；X2時(shí)間 = 554.776；= 558.831；P組別=0.001；P時(shí)間= 0.001；P交互= 0.001，均成立）。①基線、第1 次、第5 次IS 輸注后三組大鼠的FE 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第9 次、第14 次IS 輸注后ONS + CM組和CM 組均較Con 組顯著增加；ONS 干預(yù)后，ONS + CM組較CM組顯著減少，但顯著高于Con組，CM 大鼠FE 仍顯著高于Con 組（見表3、圖8）。②ONS + CM 組和CM 組大鼠FE 隨IS 輸注次數(shù)增加而增加，在第9 次IS 輸注后出現(xiàn)顯著增加且持續(xù)至第14 次IS 輸注后，ONS 后ONS + CM 組FE 較ONS 前顯著減少，但處于第5 次和第9 次IS 輸注期間水平，未恢復(fù)至基線水平；CM 在假手術(shù)前后FE 無明顯差異。Con 組大鼠FE 在第9、14 次輸注IS 后均較基線明顯增加，但其兩兩之間比較無明顯差異，且假手術(shù)前后該組大鼠FE 也無明顯差異（見補(bǔ)充表3）。

圖8 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)凍結(jié)行為變化*P < 0.05，與Con 組相比；#P < 0.05，與CM 組相比Fig.8 Comparison of freezing episode among three groups of rats at different time*P < 0.05, compared with group Con; #P < 0.05,compared with group CM.

5.三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)面部梳理行為、身體梳理行為均無顯著差異（P> 0.05，見表4、5）。三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)同側(cè)后爪面部梳理、同側(cè)后爪身體梳理均無顯著差異（P> 0.05，見表6、7）。

表4 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)面部梳理行為比較Table 4 Comparison of facial grooming behavior among three groups of rats at different time

表5 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)身體梳理行為比較Table 5 Comparison of body grooming behavior among three groups of rats at different time

表6 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)同側(cè)后爪面部梳理行為比較Table 6 Comparison of ipsilateral hindpaw facial grooming among three groups of rats at different time

表7 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)同側(cè)后爪身體梳理行為比較Table 7 Comparison of ipsilateral hindpaw body grooming among three groups of rats at different time

討 論

本研究通過重復(fù)IS 刺激硬腦膜建立了CM 模型，探討了ONS 對CM 模型大鼠疼痛相關(guān)行為的影響。本研究結(jié)果表明，ONS 能夠逆轉(zhuǎn)CM 模型大鼠頭面部多部位機(jī)械痛閾降低、水平運(yùn)動總距離及探索行為減少、凍結(jié)行為增多的改變。在第1 次、第5 次IS 輸注后24 h 大鼠頭面部機(jī)械痛閾未下降，第9 次IS 輸注后24 h 大鼠頭面部機(jī)械痛閾降低且可維持在較低閾值。

偏頭痛的發(fā)病目前認(rèn)為主要涉及三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)(trigemino-vascular system, TVS)激活的神經(jīng)源炎癥[11]。重復(fù)IS 輸注刺激硬腦膜可以作用于腦膜及血管傷害性感受器，進(jìn)而三叉神經(jīng)通路激活，模擬頭痛發(fā)作。隨著頭痛慢性化，TVS 外周和中樞神經(jīng)元興奮性及敏感度增強(qiáng)，產(chǎn)生痛覺敏化。臨床中也觀察到高達(dá)79%的偏頭痛病人常在日常活動（如梳頭、剃須、洗臉、戴眼鏡或耳環(huán)）時(shí)感覺疼痛，尤其是頭痛同側(cè)的頭皮和眶周，該現(xiàn)象稱為痛覺超敏[12]。痛覺敏化的機(jī)制尚未清楚，涉及外周敏化和中樞敏化，外周敏化的產(chǎn)生主要是支配硬腦膜和顱內(nèi)血管的三叉神經(jīng)周圍突的敏化，在偏頭痛發(fā)作期間降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)、前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮等炎癥介質(zhì)持續(xù)刺激硬腦膜及血管傷害性感受器，改變傷害感受器的細(xì)胞膜靜息電位水平，使得感受器對平時(shí)無反應(yīng)或者輕微反應(yīng)的機(jī)械刺激產(chǎn)生強(qiáng)烈應(yīng)答導(dǎo)致痛覺超敏現(xiàn)象[11]。中樞敏化主要涉及三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核(trigeminal nucleus caudalis, TNC)、丘腦后核及丘腦腹后內(nèi)側(cè)核等腦區(qū)，該腦區(qū)敏化的神經(jīng)元自發(fā)放電增多，導(dǎo)致皮膚感受野擴(kuò)大，對頭面部以外皮膚的日?；顒踊蚍莻π源碳ぞ鶗a(chǎn)生響應(yīng)[11]，此時(shí)可能出現(xiàn)痛覺超敏現(xiàn)象。另外中樞敏化與突觸可塑性相關(guān)，涉及中央導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、島葉、前額葉皮質(zhì)等腦區(qū)神經(jīng)元突觸發(fā)生功能及結(jié)構(gòu)可塑性改變，而使痛覺超敏現(xiàn)象持續(xù)存在且感受野擴(kuò)大。

偏頭痛病人不同的臨床癥狀可以反映痛覺敏化的不同：①偏頭痛發(fā)作時(shí)病人需避免咳嗽、彎腰等使顱內(nèi)壓增高的活動，可引起頭痛一過性加?。ㄍ庵苊艋?；②偏頭痛發(fā)作時(shí)非傷害性碰觸頭面部皮膚可引起頭面部痛覺超敏現(xiàn)象，病人常拒絕佩戴首飾、口罩、帽子等（TNC 區(qū)敏化）[13]；③偏頭痛發(fā)作間期觸摸軀干四肢皮膚引起該處痛覺超敏現(xiàn)象，病人常避免他人接觸或穿緊身衣褲（丘腦敏化）[13]。本研究表明，對已經(jīng)出現(xiàn)痛覺超敏現(xiàn)象的大鼠行ONS 后頭面部的機(jī)械痛閾下降有所改善。ONS 是一種用于治療慢性疼痛的神經(jīng)調(diào)制方法[4]，但ONS治療偏頭痛的臨床療效存在差異。藥物治療方法通常在偏頭痛病人出現(xiàn)痛覺超敏現(xiàn)象前使用效果更好[12]，當(dāng)偏頭痛病人出現(xiàn)痛覺超敏現(xiàn)象后治療效果欠佳。ONS 治療CM 的機(jī)制尚不清楚，但可能與周圍神經(jīng)、上段頸髓及與三叉神經(jīng)脊束核復(fù)合體(trigeminocervical complex, TCC)有關(guān)，TCC 由三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核和上頸段脊髓背側(cè)角組成，收集來自不同皮膚、肌肉、硬腦膜和內(nèi)臟三叉神經(jīng)和枕神經(jīng)分布區(qū)的傳入沖動[14]。朱品歡等[15]在偏頭痛模型大鼠中觀察到C1～C2后角小膠質(zhì)細(xì)胞明顯被激活。姚軍等[16]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)C2和C1脊神經(jīng)節(jié)阻滯治療頸源性頭痛時(shí)可以改善以枕部、頂部、顳部疼痛為主病人的疼痛程度。ONS 是否能通過枕神經(jīng)傳入影響C2后角小膠質(zhì)細(xì)胞而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用將是一個研究熱點(diǎn)。在一項(xiàng)臨床研究中，對8 例正在進(jìn)行ONS干預(yù)的病人進(jìn)行PET 掃描發(fā)現(xiàn)TCC 區(qū)神經(jīng)元明顯被激活[8]?？紤]可能是ONS 暫時(shí)干擾TNC 區(qū)敏化，這將有助于我們在下一步實(shí)驗(yàn)中對ONS 作用機(jī)制進(jìn)一步研究。目前最為認(rèn)可的ONS 作用理論是疼痛閘門控制機(jī)制，傳導(dǎo)外周觸壓覺的Aβ纖維興奮能抑制傳導(dǎo)痛溫覺的C 纖維傳遞興奮信號，這兩類纖維都可把興奮性刺激傳至脊髓后角的T 細(xì)胞，同時(shí)也與其周圍膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生突觸聯(lián)系。膠質(zhì)細(xì)胞能抑制傳入T 細(xì)胞的疼痛刺激向上傳遞，而從Aβ纖維或C 纖維而來的刺激分別增強(qiáng)或抑制膠質(zhì)細(xì)胞對疼痛傳導(dǎo)的抑制作用[17]。Vincent 等[18]研究證明與未受ONS 干預(yù)的大鼠相比，ONS 干預(yù)后大鼠頸靜脈血和眼球血中的CGRP 表達(dá)顯著降低，因此ONS作用是否與GGRP 有關(guān)，待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果證明，CM 模型大鼠水平運(yùn)動總距離和探索行為減少而凍結(jié)行為增加的改變，在前期IS 輸注后24 h 大鼠的上述行為無明顯改變，后期多次IS 輸注后24 h 大鼠水平運(yùn)動總距離和探索行為減少，凍結(jié)行為增加，該種行為改變發(fā)生在大鼠頭面部機(jī)械痛閾維持于較低閾值，即痛覺超敏現(xiàn)象持續(xù)存在時(shí)，這可能是CM 組及ONS + CM 組大鼠因痛覺超敏現(xiàn)象而產(chǎn)生回避運(yùn)動行為。同樣臨床上病人偏頭痛發(fā)作時(shí)也伴有“不愿活動、喜休息、喜保持固定姿勢”的行為樣改變，僅低頭或轉(zhuǎn)頭等日?；顒泳蜁觿∑^痛，因此，在偏頭痛發(fā)作時(shí)病人可因回避頭部活動而出現(xiàn)回避運(yùn)動的行為[19]。運(yùn)動回避尤其是頭部運(yùn)動回避的機(jī)制涉及腦膜、顱內(nèi)血管或前庭器官，已知腦膜血管周圍神經(jīng)源性炎癥是偏頭痛發(fā)作的一部分，腦膜刺激通常會導(dǎo)致運(yùn)動不耐受，特別是引起頭部顛簸的活動，這可能是由于痛覺超敏結(jié)構(gòu)的易感性增加所致[19]。CM 病人活動度降低，這可能導(dǎo)致長期運(yùn)動回避行為的跡象，類似于本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。病人因害怕而避免引起或加重疼痛的運(yùn)動因素，長期回避運(yùn)動會導(dǎo)致慢性肌肉骨骼痛、慢性腰痛和纖維肌痛[20]，而疼痛反過來又維持和加劇慢性疼痛，這又是一個全新的研究領(lǐng)域。

本研究結(jié)果表明，Con 組大鼠也出現(xiàn)水平運(yùn)動總距離和探索行為減少而凍結(jié)行為增加的改變。實(shí)際操作中，Con 組大鼠每日也受到了導(dǎo)管給藥操作的應(yīng)激，只是在應(yīng)激后沒有持續(xù)的頭痛，這種溫和的應(yīng)激對于大鼠產(chǎn)生了一定程度的影響，并且由于給藥管的固定問題，需要大鼠孤籠飼養(yǎng)，這種缺乏社交的飼養(yǎng)環(huán)境對于大鼠來說也是一種負(fù)面事件。另外，在大鼠抑郁行為檢測的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)抑郁會導(dǎo)致運(yùn)動總距離縮短，探索行為減少[21]。有關(guān)情緒障礙的研究高度一致地報(bào)道了在偏頭痛人群中重癥抑郁的患病率增高。情感障礙是偏頭痛慢性化轉(zhuǎn)變的一項(xiàng)危險(xiǎn)因素[22]。在本研究中大鼠水平運(yùn)動總距離、探索行為改變出現(xiàn)在痛覺超敏現(xiàn)象持續(xù)存在即大鼠發(fā)生偏頭痛慢性化之后，因此大鼠行為結(jié)果變化的影響因素是否涉及抑郁等情緒障礙有待進(jìn)一步探索。本研究表明，ONS 不僅可以改善CM 模型大鼠的痛覺超敏現(xiàn)象，還可以逆轉(zhuǎn)其他疼痛相關(guān)行為的改變，其中常用于評價(jià)動物模型抑郁行為的探索行為、運(yùn)動距離也發(fā)生變化。近年來偏頭痛逐漸被認(rèn)為是一種腦功能障礙疾病，基于全腦體素的形態(tài)測量研究顯示偏頭痛病人皮質(zhì)體積顯著減少[23]，與情緒障礙相關(guān)的腦區(qū)常涉及前額葉皮質(zhì)、島葉、海馬等大腦皮質(zhì)。因此，ONS 是否可通過影響大腦皮質(zhì)而引起CM 大鼠疼痛相關(guān)行為改變有待進(jìn)一步研究。

本研究不足之處：本研究表明單次ONS 可以改善CM 模型大鼠疼痛相關(guān)行為改變，但單次ONS效果的持續(xù)時(shí)間及多次ONS 是否會更有效仍待研究。下一步將采用植入式電極來探究不同模式ONS的治療效果。另外，三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)同側(cè)后爪面部梳理行為、同側(cè)后爪身體梳理行為無顯著差異，但Melo-Carrillo 等[24]的研究表明輸注IS 后45 min內(nèi)該組大鼠較對照組大鼠同側(cè)后爪梳理行為顯著增加。分析本研究與此不一致的原因：①本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)表明單次給予IS 后30 min，面部機(jī)械痛閾顯著下降，3 h 降至最低，5～6 h 恢復(fù)至初始水平，則每次輸注IS 相當(dāng)于CM 背景上的更劇烈的急性發(fā)作，所以IS 注射后即刻單側(cè)梳理行為增加，而在IS 注射后的24 h 該行為在三組間無明顯差異；②考慮多次重復(fù)IS 注射后大鼠凍結(jié)行為增加活動度減少，單側(cè)梳理行為受影響。因此我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中增加檢測行為的時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)一步探究出現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因。

綜上所述，目前臨床研究提示ONS 是一種治療CM 的可行方法，但ONS 治療CM 的機(jī)制未明。本研究表明ONS 可改善CM 大鼠頭面部機(jī)械痛閾降低、水平運(yùn)動總距離和探索行為減少、凍結(jié)行為增加的現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)了ONS 改善CM 的有效性，可采用該動物模型進(jìn)一步探索ONS 發(fā)揮作用的機(jī)制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。