探討宏基因組學(xué)第二代測(cè)序在肺部感染病原體檢測(cè)中的臨床價(jià)值

周文清 辛 虹 彭 麗 楊文興 李慧芬 江西省萬(wàn)載縣人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 336100

肺部感染作為感染性疾病中發(fā)病率最高的一種,其病原菌的明確極大關(guān)系到患者的治療及預(yù)后[1],而傳統(tǒng)培養(yǎng)、涂片鏡檢、RT-PCR、特異性抗體測(cè)定等方法存在病原體檢出率低、培養(yǎng)周期長(zhǎng)等缺陷。因此,在肺部感染病原菌檢測(cè)上需要檢出率更高、檢測(cè)范圍更廣的方法。宏基因組二代測(cè)序技術(shù)(Metagenomic next-generation sequencing,mNGS)目前已廣泛、深入地應(yīng)用于肺部感染領(lǐng)域。在應(yīng)用mNGS技術(shù)診斷肺部感染病原體時(shí),通常會(huì)選擇支氣管肺泡灌洗液,與痰液相比,它可以避免口咽菌群的污染,并且敏感性比血液更高[2-3]。本研究評(píng)估了mNGS技術(shù)在肺部感染患者診斷中的應(yīng)用價(jià)值,并通過(guò)病原菌檢出率、檢出種類等方面與常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法進(jìn)行了比較,旨在為肺部感染患者的病原體診斷增添新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年4月—2022年8月我院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的肺部感染患者87例作為觀察對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合美國(guó)胸科協(xié)會(huì)關(guān)于肺部感染的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)肺部聽(tīng)診可聞及啰音;(3)病情危重需要盡快明確肺部感染病原體;(4)特殊疾病患者如免疫抑制、合并基礎(chǔ)疾病、反復(fù)住院的重癥感染患者等,需要盡快明確肺部感染病原體;(5)傳統(tǒng)微生物檢測(cè)技術(shù)反復(fù)檢測(cè)結(jié)果均為陰性且治療效果不佳;(6)臨床懷疑為RNA 病毒感染,如流感病毒感染等所致;(7)疑似某種特殊病原體感染;(8)長(zhǎng)期發(fā)熱和(或)伴有其他臨床癥狀、病因不明的肺部感染;(9)患者或其家屬簽署檢測(cè)研究知情同意書(shū)。此處納入標(biāo)準(zhǔn)納入了病情危重患者,而重癥肺炎定義與普通肺炎定義有所區(qū)別。87例患者中,男61例,女26例;年齡17～86歲,平均年齡(56±6.78)歲。

1.2 方法 所選患者均采取了常規(guī)(痰)涂片+培養(yǎng)方法以及mNGS技術(shù)進(jìn)行病原體檢測(cè)。(1)標(biāo)本獲取:對(duì)患者行支氣管鏡檢查以及肺泡灌洗術(shù),留取支氣管肺泡灌洗液。(2)常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法:對(duì)患者行誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)檢查以及肺泡灌洗液送至本院檢驗(yàn)科進(jìn)行涂片、培養(yǎng),檢測(cè)病原微生物。(3)mNGS檢測(cè):將采集的標(biāo)本送至金域醫(yī)學(xué)或迪安診斷檢驗(yàn)中心進(jìn)行mNGS檢測(cè)。嚴(yán)格按檢驗(yàn)中心的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范執(zhí)行標(biāo)本的采集、運(yùn)輸、保存等。先通過(guò)DNA片段化、修復(fù)末端、測(cè)序接頭連接以及 PCR 擴(kuò)增等步驟制備文庫(kù),然后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。再進(jìn)行人工智能化分析,精準(zhǔn)識(shí)別病原微生物,由權(quán)威臨床微生物專家和臨床專家結(jié)合長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)和全球臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定數(shù)據(jù)庫(kù)權(quán)重基質(zhì),結(jié)合權(quán)重選舉式菌種水平標(biāo)記法自動(dòng)快速分析解讀。

1.3 臨床確診 由1位呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科主任醫(yī)師、3位主治醫(yī)師、1位影像科主治醫(yī)師、1位檢驗(yàn)科主治醫(yī)師組成的臨床小組,結(jié)合患者血清病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果、常規(guī)涂片檢測(cè)結(jié)果、mNGS結(jié)果、胸部CT影像、抗生素療效、臨床癥狀等綜合研判致病病原體。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 本研究主要考察mNGS技術(shù)與常規(guī)涂片檢測(cè)技術(shù)的陽(yáng)性檢出率、病原體類型、不同類型病原體的檢出情況、以及檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)(后文僅僅在討論中可見(jiàn)相關(guān)敘述,而本實(shí)驗(yàn)未見(jiàn)相關(guān)數(shù)據(jù)以及分析)等

2 結(jié)果

87例患者中,經(jīng)mNGS檢測(cè)到病原微生物的有74例,檢出率85.06%;而通過(guò)常規(guī)涂片、培養(yǎng)的方法進(jìn)行檢測(cè),僅有9例檢測(cè)到病原微生物,檢出率僅10.34%,顯著低于mNGS檢測(cè)方法(P<0.05),詳見(jiàn)表1。

表1 mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法檢出病原微生物類型、檢出率比較[n(%)]

利用mNGS技術(shù),在87例患者中共檢測(cè)到細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、衣原體五大類病原微生物,檢出的細(xì)菌種類最多(檢出的病原菌中細(xì)菌占比最高),有47例患者(54.02%)檢出的病原體屬于細(xì)菌,其中25例分屬于4種革蘭氏陽(yáng)性菌,22例分屬于5種革蘭氏陰性菌。從單個(gè)微生物來(lái)看,細(xì)菌中檢出最多的是結(jié)核分枝桿菌,共19例(21.84%)。檢測(cè)到了3種真菌,其中煙曲霉占比最高,有8例患者檢測(cè)出并被確診為煙曲霉感染。除此之外,檢出的病原微生物中還有5種病毒、1種支原體(肺炎支原體)、1種衣原體(鸚鵡熱衣原體)。

只有9例患者同時(shí)能夠利用常規(guī)涂片檢查和mNGS的方法檢出致病病原微生物,均為細(xì)菌感染,其中5例結(jié)核分枝桿菌、4例銅綠假單胞菌。在真菌和病毒中的檢出率,NGS也大大高于常規(guī)檢查。而在支原體和衣原體的檢測(cè)上,兩者的檢出率高于常規(guī)檢測(cè)。

3 討論

肺部感染作為呼吸系統(tǒng)中最為常見(jiàn)并且致死率極高的疾病之一,致病原微生物的準(zhǔn)確判斷對(duì)于疾病的診療至關(guān)重要。然而臨床常規(guī)使用的涂片檢查等手段存在一定局限性,并且由于肺部感染的病原菌種類多樣,因此超過(guò)2/3的臨床肺部感染疾病無(wú)法確診病原微生物,以至于無(wú)法精準(zhǔn)用藥[4]。mNGS可以通過(guò)高通量二代測(cè)序技術(shù)將樣本中的所有微生物基因進(jìn)行測(cè)序檢測(cè),一次性獲取待檢樣品中可能存在的多種病原體基因組序列。mNGS在肺部感染病原微生物診斷中的應(yīng)用廣泛,尤其是在病重、反復(fù)培養(yǎng)未能找到病原微生物、罕見(jiàn)微生物感染的患者中具有極大優(yōu)勢(shì)。本文中,使用mNGS技術(shù)的病原微生物檢出率高達(dá)85.06%,顯著優(yōu)于檢出率僅10.34%的常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法(P<0.05)。在很多其他研究中,mNGS也表現(xiàn)出更高的檢出率,例如在李殷康等人針對(duì)肺部感染患者的研究中,mNGS檢出率為83.33%,而常規(guī)涂片+培養(yǎng)檢測(cè)僅有23.33%的[5]。陳婷婷等人的研究結(jié)果也顯示類似的結(jié)論,mNGS檢出肺部感染陽(yáng)性率高達(dá)72.41%,遠(yuǎn)高于血清學(xué)檢測(cè)(25.86%)或者傳統(tǒng)方法(24.14%)[6]。在檢出的病原微生物類型上,mNGS技術(shù)檢測(cè)到細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、衣原體五大類病原微生物。細(xì)菌感染是肺部感染中最常見(jiàn)的,本文結(jié)果也是如此,檢出的病原微生物中細(xì)菌占比最高,達(dá)到54.02%。mNGS技術(shù)在細(xì)菌的檢出率上顯著優(yōu)于常規(guī)涂片檢查(P<0.05)。其中,在革蘭氏陽(yáng)性菌中,占比最高的是結(jié)核分枝桿菌,共檢測(cè)到19例(21.84%),在革蘭氏陰性菌中,最多的是銅綠假單胞菌6例(6.90%)。結(jié)核分枝桿菌在中國(guó)的流行率較高,而銅綠假單胞菌是支氣管擴(kuò)張癥患者呼吸道標(biāo)本中最常見(jiàn)的病原菌[7]。常規(guī)涂片+培養(yǎng)檢測(cè)到的9例病原微生物也是分布于這兩種細(xì)菌。在Li等人的研究中也顯示,在細(xì)菌診斷上,mNGS的靈敏度和特異性均高于培養(yǎng)法以及涂片法[8]。在真菌感染的患者中,最多的是煙曲霉感染,而病毒感染患者中鼻病毒較為常見(jiàn)。在細(xì)菌和真菌的檢出率比較上,mNGS技術(shù)也顯著優(yōu)于常規(guī)涂片+培養(yǎng)檢測(cè)(P<0.05)。對(duì)于支原體以及衣原體的培養(yǎng),所需的條件苛刻,此外還需要比較恢復(fù)期血清學(xué)、尿抗原等臨床指標(biāo)才能進(jìn)行確診。在本研究中通過(guò)mNGS技術(shù)檢測(cè)出的2例肺炎支原體和2例鸚鵡熱衣原體均無(wú)法通過(guò)常規(guī)培養(yǎng)檢出。從該結(jié)果看,mNGS技術(shù)在支原體和衣原體檢測(cè)中更具優(yōu)勢(shì),但結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能由于樣本量較少,因此還需要在未來(lái)的研究中擴(kuò)大樣本范圍以針對(duì)具體不同類型病原微生物進(jìn)行對(duì)比得出明確結(jié)論。使用常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法檢出率低可能是由于常規(guī)培養(yǎng)基以及一般培養(yǎng)條件下,無(wú)法培養(yǎng)出某些特殊種類的病原微生物,例如很多對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻的苛養(yǎng)菌需要在體外培養(yǎng)時(shí)加入特殊的營(yíng)養(yǎng)成分[9]。因此當(dāng)遇到肺炎鏈球菌、嗜血桿菌屬等病原微生物時(shí),通過(guò)常規(guī)培養(yǎng)通常無(wú)法顯示陽(yáng)性結(jié)果。而mNGS技術(shù)無(wú)須對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng),因此不受培養(yǎng)環(huán)境的限制,通過(guò)對(duì)核酸進(jìn)行高通量測(cè)序,就可以分析樣本中的微生物種類及豐度信息[10]。除此之外,mNGS受抗生素暴露的影響也更小。時(shí)效性對(duì)于肺部感染疾病的治療很關(guān)鍵,在更早期就能明確病原菌,從而針對(duì)性治療,能夠有效控制感染,防止疾病進(jìn)一步進(jìn)展。在本文中,mNGS技術(shù)檢測(cè)的樣本從送檢至出結(jié)果不超過(guò)48h,而利用常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法通常需要耗時(shí)3～4d時(shí)間才能獲得培養(yǎng)結(jié)果,而結(jié)核分枝桿菌檢出時(shí)間更是長(zhǎng)達(dá)2～8周,此外還經(jīng)常出現(xiàn)培養(yǎng)病原菌陰性的情況[5]。因此從及時(shí)治療的角度來(lái)看,mNGS技術(shù)更有優(yōu)勢(shì),能夠盡早明確病原菌,從而進(jìn)行針對(duì)性治療。在常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法檢出的病原菌陰性后,再考慮使用mNGS技術(shù)再次檢測(cè),則可能會(huì)對(duì)疾病最佳治療有所影響。雖然隨著mNGS技術(shù)的不斷成熟與發(fā)展,目前的檢測(cè)費(fèi)用與剛問(wèn)世時(shí)相比已明顯降低,在臨床上的普及性推廣,大多數(shù)患者能接受。常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法目前仍然是不可或缺的重要病原微生物檢測(cè)手段,在此基礎(chǔ)上,根據(jù)患者病情、經(jīng)濟(jì)情況等因素綜合考量應(yīng)用mNGS技術(shù)以提高檢測(cè)效率,盡早明確病原微生物并進(jìn)行針對(duì)性治療。