液滴式數(shù)字PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)什曼原蟲(chóng)的方法比較

陳維琳,侯 杰,王 念,馬 瑩

利什曼病是由利什曼原蟲(chóng)引起的病媒傳播寄生蟲(chóng)病,通過(guò)雌性白蛉傳播,被世界衛(wèi)生組織列為被忽視的熱帶病之一[1]。人類利什曼病主要有3種臨床表現(xiàn)形式:內(nèi)臟利什曼病、皮膚利什曼病和皮膚黏膜利什曼病,由不同蟲(chóng)種感染所致。其中,內(nèi)臟利什曼病又被稱為黑熱病,主要由杜氏利什曼原蟲(chóng)和嬰兒利什曼原蟲(chóng)引起,是最嚴(yán)重的利什曼病。據(jù)世界衛(wèi)生組織2016年全球內(nèi)臟利什曼病的流行情況,我國(guó)每年有超過(guò)100例新發(fā)病例,以感染嬰兒利什曼原蟲(chóng)為主[2]。

內(nèi)臟利什曼病的經(jīng)典診斷方法是通過(guò)在顯微鏡下觀察骨髓或組織標(biāo)本中的圓形或橢圓形無(wú)鞭毛體[1]。此種方法對(duì)人體有創(chuàng),檢測(cè)靈敏度隨取材部位以及不同檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)而有所差異,檢出率不理想。目前,有多種血清學(xué)檢測(cè)方法,包括直接凝集試驗(yàn)(the direct agglutination test,DAT)、免疫層析實(shí)驗(yàn)(the immuno-chromatographic test,ICT)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、免疫熒光檢測(cè)和免疫印跡檢測(cè)等[1],這些方法存在一些局限性,如鉤狀效應(yīng)、交叉反應(yīng)以及治愈后的患者體內(nèi)依然存在抗體,不宜作為療效監(jiān)測(cè)的指標(biāo)。并且,我國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有基于以上檢測(cè)方法的試劑盒可用于內(nèi)臟利什曼病的診斷。因此,建立一種可用于常規(guī)診斷和監(jiān)測(cè)療效的靈敏的內(nèi)臟利什曼病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法是很有必要的。

國(guó)內(nèi)外許多研究建立了利什曼原蟲(chóng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)檢測(cè)方法,具有良好的靈敏度和特異性[3-5]。但以qPCR建立的檢測(cè)方法若要對(duì)樣本中的病原體進(jìn)行定量,需要使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,這對(duì)于利什曼原蟲(chóng)的檢測(cè)有相當(dāng)難度。液滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)可產(chǎn)生線性信號(hào),不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制即可實(shí)現(xiàn)單分子絕對(duì)定量。數(shù)字PCR的高靈敏度使其可用于靶標(biāo)DNA低載量、多樣性時(shí)的檢測(cè)。有研究報(bào)道數(shù)字PCR在某些寄生蟲(chóng)感染檢測(cè)方面具有明顯的潛在優(yōu)勢(shì),特別是瘧疾和血吸蟲(chóng)病[6]。已有的結(jié)果表明數(shù)字PCR檢測(cè)方法對(duì)低載量DNA具有較高的敏感性和特異性,可以在種的水平上對(duì)寄生蟲(chóng)進(jìn)行區(qū)分鑒定[7-11]。而對(duì)于內(nèi)臟利什曼病檢測(cè)方面的研究少之又少。因此,本研究的目的是以ddPCR為平臺(tái),建立一種內(nèi)臟利什曼病檢測(cè)方法,將其結(jié)果同建立的qPCR檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏度、精密度比較,分析ddPCR在內(nèi)臟利什曼病檢測(cè)中的可行性,以期為臨床診斷、療效監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建 從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)選取數(shù)條杜氏利什曼原蟲(chóng)小環(huán)動(dòng)基體DNA序列(GenBank: AF399822.1、EU370883.1、KU201297.1、X84844.1、Y11401.1、Y11402.1、Z35275.1),使用SnapGene(6.0.2)進(jìn)行序列比對(duì),確定約200 bp保守區(qū)域,位于Y11401.1的1～200 bp。選擇pUC57載體構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(Sangon Biotech,Shanghai,China),并與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì),保證其準(zhǔn)確性。

1.2 引物和探針設(shè)計(jì) 根據(jù)保守序列,使用Primer Premier 5 設(shè)計(jì)引物,在NCBI Primer-BlAST上對(duì)引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證。隨后使用Primer Express 3.0.1設(shè)計(jì)探針。所設(shè)計(jì)的引物和探針的信息見(jiàn)表1,在參考序列的位置見(jiàn)圖1。

注:紅色標(biāo)記部分為上、下游引物序列,綠色標(biāo)記部分為探針序列,箭頭代表序列方向。圖1 引物和探針在參考序列上的位置Fig.1 Positions of the primers and probe on the reference sequence

表1 引物和探針Tab.1 Primer and probe information

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立 以質(zhì)粒為模板,反應(yīng)總體系為20 μL:10 μL 2×T5 Fast qPCR Mix(Probe)(Tsingke Biotechnology,Chengdu,China),0.8 μL 10 μmol/L 上游引物,0.8 μL 10 μmol/L下游引物,0.4 μL 10 μmol/L 熒光探針,1 μL模板DNA,7 μL ddH2O。使用Gene9660PCR擴(kuò)增儀(Bioer Technology, Hangzhou, China)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性95 ℃ 5 min后,變性95 ℃ 10 s,退火53 ℃ 20 s,共40個(gè)循環(huán),退火時(shí)采集熒光。

1.4 液滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法的建立 以質(zhì)粒為模板,反應(yīng)總體系為15 μL: 7.5 μL 2×T5 Fast qPCR Mix(Probe)(Tsingke Biotechnology,Chengdu,China),1.35 μL 10 μmol/L 上游引物,1.35 μL 10 μmol/L下游引物,0.375 μL 10 μmol/L 熒光探針,1 μL模板DNA,3.425 μL ddH2O。將總反應(yīng)體系全部轉(zhuǎn)移至微流控芯片中,隨后將芯片轉(zhuǎn)移至DG32 droplet generator(Pilot Gene Technologies, Hangzhou, China),生成液滴,再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性95 ℃ 10 min后,變性95 ℃ 30 s,退火53 ℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán);徹底延伸25 ℃,10 min,反應(yīng)終止。接下來(lái),將擴(kuò)增后的芯片加載到iScaner5 Droplet Reader(Pilot Gene Technologies, Hangzhou, China)上,自動(dòng)測(cè)量每個(gè)液滴的熒光振幅,使用GenePMS Version 1.0.1(Pilot Gene Technologies, Hangzhou, China)計(jì)算靶標(biāo)DNA的濃度,并以copies/ μL表示。

1.5 qPCR和ddPCR靈敏度、線性及精密度評(píng)價(jià) 使用5個(gè)質(zhì)粒濃度(分別為1.0×104copies/μL、1.0×103copies/μL、1.0×102copies/μL、1.0×10 copies/μL、1.0 copies/μL)以及陰性對(duì)照進(jìn)行靈敏度測(cè)試。使用4個(gè)質(zhì)粒濃度(1.0×104copies/μL、1.0×103copies/μL、1.0×102copies/μL、1.0×10 copies/μL)進(jìn)行線性和精密度的評(píng)價(jià),每個(gè)濃度重復(fù)10次。

1.6 不同利什曼蟲(chóng)株的檢測(cè)

1.6.1 DNA提取 將6株液氮凍存的利什曼原蟲(chóng)(表2)解凍,轉(zhuǎn)移至15 mL無(wú)菌離心管,加入約5 mL生理鹽水,震蕩混勻,3 000 r/min,離心10 min,去上清液,再重復(fù)此步驟2次。在沉淀中加入蛋白酶K約100 μL,再加入ddH2O補(bǔ)至約400 μL,吹打混勻,放至56 °C溫箱孵育過(guò)夜。

表2 6株利什曼原蟲(chóng)蟲(chóng)株信息Tab.2 Information on six Leishmania isolates

按照動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒(Tsingke Biotechnology,Chengdu,China)操作步驟提取基因組DNA。最終得到50 μL體積的基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 對(duì)已提取的6株利什曼原蟲(chóng)DNA分別進(jìn)行qPCR和ddPCR檢測(cè) 以梯度稀釋的質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,將qPCR檢測(cè)得到Cq值轉(zhuǎn)換成kDNA拷貝數(shù),用于和ddPCR比較。

2 結(jié) 果

2.1 靈敏度和重復(fù)性比較 由檢測(cè)不同梯度濃度的質(zhì)粒(1.0×104copies/μL、1.0×103copies/μL、1.0×102copies/μL、1.0×10 copies/μL、1.0 copies/μL)所得到的2種方法檢測(cè)下限結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3,qPCR和ddPCR 2種方法最低可檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)質(zhì)?？截悢?shù)均為1.0×10 copies/μL。

注:質(zhì)粒濃度a為1.0×104 copies/μL;b為1.0×103 copies/μL;c為1.0×102 copies/μL;d為1.0×10 copies/μL,1.0 copies/μL和陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增。圖2 qPCR擴(kuò)增曲線Fig.2 qPCR amplification curve

注:質(zhì)粒濃度A為1.0×104 copies/μL;B為 1.0×103 copies/μL;C為 1.0×102 copies/μL;D為1.0×10 copies/μL;E為1.0 copies/μL;F為陰性對(duì)照。

使用不同梯度濃度的質(zhì)粒(1.0×104copies/μL、1.0×103copies/μL、1.0×102copies/μL、1.0×10 copies/μL)進(jìn)行線性與精密度評(píng)價(jià),每個(gè)濃度重復(fù)10次。ddPCR的重復(fù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4,結(jié)果顯示ddPCR檢測(cè)的定量結(jié)果與質(zhì)粒濃度高度相關(guān):R2=0.999 9。從表3可以看出,qPCR的平均Cq值依次為23.63、26.971、30.454、33.761。ddPCR的平均濃度依次是492.458 copies/μL、46.138 copies/μL、3.21 copies/μL、0.25 copies/μL。建立的qPCR檢測(cè)不同濃度質(zhì)粒時(shí)的變異系數(shù)較小(2.96%～4.26%),不同濃度之間的變異系數(shù)差別不大,而ddPCR檢測(cè)的變異系數(shù)隨著檢測(cè)樣本濃度的降低,變異系數(shù)有增大的趨勢(shì)(12.07%～62.96%)。

圖4 ddPCR平臺(tái)上10倍稀釋質(zhì)粒與kDNA拷貝數(shù)之間的關(guān)系Fig.4 Relationship between 10-fold diluted plasmid and kDNA copy number on the ddPCR platform

表3 ddPCR與qPCR重復(fù)性比較Tab.3 Comparison of reproducibility between ddPCR and qPCR

2.2 2種方法檢測(cè)不同利什曼原蟲(chóng)蟲(chóng)株結(jié)果比較

對(duì)6株利什曼原蟲(chóng)進(jìn)行qPCR和ddPCR檢測(cè)。根據(jù)不同梯度濃度質(zhì)粒的拷貝數(shù)和Cq值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖5),計(jì)算6株利什曼原蟲(chóng)的qPCR定量結(jié)果(copies/μL)。2種檢測(cè)在不同蟲(chóng)株之間的靈敏度具有一定的差異,見(jiàn)表4。qPCR和ddPCR對(duì)DD8和L100兩株的靈敏度相近[15.81vs17.78 (copies/μL);1.25vs1.49 (copies/μL)];LIU和LEM兩株的qPCR檢測(cè)結(jié)果高于ddPCR[99.76vs28.68 (copies/μL);3.97vs0.38 (copies/μL)],qPCR檢測(cè)方法對(duì)其更加靈敏;5AS和K27兩株的ddPCR檢測(cè)結(jié)果高于qPCR[18.82vs1.25 (copies/μL);1.61vs0.4 (copies/μL)],ddPCR對(duì)其更加靈敏。L100和5AS兩株qPCR檢測(cè)結(jié)果接近,但是ddPCR檢測(cè)結(jié)果相差很大。

圖5 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve for qPCR

表4 qPCR和ddPCR檢測(cè)不同利什曼原蟲(chóng)蟲(chóng)株結(jié)果對(duì)比Tab.4 Comparison of the results of qPCR and ddPCR for detection of Leishmania isolates

3 討 論

目前臨床上內(nèi)臟利什曼病的診斷方法有顯微鏡檢查、血清學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)技術(shù)等。顯微鏡檢查需要觀察到無(wú)鞭毛體,其在巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞大量破壞和增生,巨噬細(xì)胞增生主要見(jiàn)于脾臟、肝臟、淋巴結(jié)和骨髓等器官,檢測(cè)敏感性和取材部位有關(guān):脾臟90%以上,骨髓50%～80%以上,淋巴結(jié)吸出物甚至更低[12]。除了在合并艾滋病毒感染的患者中有較高的寄生蟲(chóng)血癥外,血液樣本的敏感性很低[13]。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)告有幾種血清學(xué)檢測(cè)方法可用,最常用的是基于杜氏利什曼原蟲(chóng)全前鞭毛體的DAT和基于rK39的ICT,但特異性抗體可在患者體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在,不能區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染,即不能作為監(jiān)測(cè)治療效果的指標(biāo)[14-15],并且這些產(chǎn)品國(guó)內(nèi)很難獲得。分子技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性,目前國(guó)內(nèi)外已有許多研究建立了qPCR技術(shù)檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)。蘆晶等[16]將建立的qPCR檢測(cè)方法與rK39檢測(cè)方法對(duì)比,qPCR方法展示了較好的靈敏度和特異度;另一項(xiàng)研究[17]表明,qPCR檢測(cè)方法可以作為準(zhǔn)確檢測(cè)內(nèi)臟利什曼病、黑熱病后皮膚利什曼病以及復(fù)發(fā)內(nèi)臟利什曼病患者靜脈血或皮膚病變組織中利什曼原蟲(chóng)的一種分子工具, 并且能夠評(píng)估治療效果。已報(bào)道用于利什曼原蟲(chóng)檢測(cè)的分子靶標(biāo)有kDNA、18SrDNA、7SLRNA、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、迷你外顯子(mini-exon)、HSP70、GP63等[18]。由于kDNA的高拷貝數(shù)(約10 000拷貝/寄生蟲(chóng)細(xì)胞),其廣泛作為利什曼原蟲(chóng)檢測(cè)的分子標(biāo)志物[19-22]。

本研究中我們選擇了利什曼原蟲(chóng)的小環(huán)動(dòng)基體DNA作為分子靶標(biāo),針對(duì)其約200 bp的保守片段設(shè)計(jì)引物和探針,建立了qPCR和ddPCR 2種方法。qPCR定量需要用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,在本研究中,由于利什曼原蟲(chóng)的標(biāo)準(zhǔn)品難獲得,故而以質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)Cq值換算得到的利什曼原蟲(chóng)kDNA拷貝數(shù)與實(shí)際值之間存在一定的差距。ddPCR的原理是將總PCR反應(yīng)體系分隔在幾萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的液滴中,形成“油包水“的結(jié)構(gòu),然后進(jìn)行PCR反應(yīng),含有單分子模板的液滴在擴(kuò)增后具有熒光信號(hào),當(dāng)儀器讀取每一個(gè)微滴熒光信號(hào)后,根據(jù)熒光信號(hào)和泊松分布原理可以計(jì)算出樣品的濃度,實(shí)現(xiàn)單分子絕對(duì)定量[23-25]。需要注意的是,本研究中ddPCR實(shí)際檢測(cè)的質(zhì)?？截悢?shù)低于預(yù)期值。可能是由于預(yù)期值是通過(guò)已知分子量的DNA換算得來(lái),有一定的誤差,并且在質(zhì)粒稀釋過(guò)程中存在損耗。

本研究以質(zhì)粒作為樣本,和qPCR檢測(cè)方法相比,ddPCR檢測(cè)方法在靈敏度上并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì),檢測(cè)下限均為1.0×10 copies/μL。同樣的,從僅有的一篇關(guān)于利什曼原蟲(chóng)ddPCR檢測(cè)方法的研究中發(fā)現(xiàn)[26],以L18S為靶標(biāo),將稀釋后的巴西利什曼原蟲(chóng)作為標(biāo)準(zhǔn)品,確定最低檢測(cè)限,結(jié)果顯示ddPCR平臺(tái)的最低檢測(cè)限遠(yuǎn)高于已發(fā)表的實(shí)時(shí)熒光定量PCR平臺(tái)的檢測(cè)限(100 vs 1個(gè)寄生蟲(chóng)/mL)。在其他寄生蟲(chóng)研究中,ddPCR在低濃度標(biāo)本的檢測(cè)中表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì),可作為布病的分子流行病學(xué)調(diào)查的有效手段,以及樣本中布魯氏菌濃度的確定在指導(dǎo)臨床用藥、監(jiān)測(cè)病情發(fā)展和觀察療效中具有重要意義[27]。因此,后續(xù)還需要更多的研究探討如何優(yōu)化體系,從而提升利什曼原蟲(chóng)ddPCR檢測(cè)方法的靈敏度。

在本研究中,ddPCR的重復(fù)性隨著樣本濃度的降低,數(shù)值波動(dòng)越大。主要考慮以下幾點(diǎn)原因:不同于qPCR,ddPCR得到的結(jié)果是每個(gè)反應(yīng)樣品濃度(copies/μL),不同樣品濃度之間的變化會(huì)大于以Cq值呈現(xiàn)出來(lái)的變化;在實(shí)際操作過(guò)程中,液滴式數(shù)字PCR轉(zhuǎn)液以及壓片不均勻會(huì)造成損耗,當(dāng)樣品濃度降低,損耗帶來(lái)的影響增大。在Ramírez JD等[26]的研究中,在高濃度利什曼原蟲(chóng)樣本中,ddPCR的精密度弱于qPCR,隨著利什曼原蟲(chóng)濃度的降低,二者的變異系數(shù)越接近。

從檢測(cè)導(dǎo)致內(nèi)臟利什曼病的蟲(chóng)株結(jié)果來(lái)看,L.infantum(LIU和LEM)的qPCR檢測(cè)方法比ddPCR檢測(cè)方法更加靈敏,而二者對(duì)L.donovani(DD8)檢測(cè)靈敏度差異不大?？紤]提取的蟲(chóng)株kDNA與構(gòu)建質(zhì)粒的序列之間的相似程度未達(dá)到100%,引物、探針和靶標(biāo)的結(jié)合程度會(huì)影響擴(kuò)增效率。和qCPR相比,ddPCR對(duì)反應(yīng)的條件(反應(yīng)預(yù)混液、探針、溫度、時(shí)間等)要求更高,對(duì)ddPCR擴(kuò)增效率影響更大。通過(guò)NCBI Primer-BLAST驗(yàn)證,本方法的引物和探針未見(jiàn)其可擴(kuò)增其他種類的蟲(chóng)株,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看,二者也可檢測(cè)導(dǎo)致皮膚利什曼病的蟲(chóng)株,其中ddPCR在檢測(cè)L.major上表現(xiàn)出了較好的靈敏度。對(duì)于qPCR檢測(cè)結(jié)果相似的L.aethiopica(L100)和L.major(5AS),ddPCR檢測(cè)結(jié)果卻表現(xiàn)出較大的差異。因此,可能需要重新尋找靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物和探針,探索qPCR和ddPCR在除L.infantum和L.donovani外蟲(chóng)株之間的檢測(cè)優(yōu)缺點(diǎn)。

對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)和絕對(duì)定量的ddPCR方法與qPCR方法相比,不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以更直觀地得到待測(cè)樣品的濃度。除此之外,由于ddPCR將總體系生成上萬(wàn)個(gè)油包水的有效的樣本分區(qū),避免了非特異性擴(kuò)增以及最小化或消除液滴間的交叉污染[28]。但是,ddPCR檢測(cè)方法具有以下局限性,檢測(cè)通量小;所需的儀器設(shè)備以及芯片價(jià)格較為昂貴;增加的轉(zhuǎn)液、生成液滴、閱片步驟對(duì)操作人員要求較高,導(dǎo)致耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)。與qPCR相比,樣品濃度過(guò)高(超過(guò)105copies/μL)可能會(huì)影響有效液滴的生成,這樣會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果不符,因此對(duì)于高濃度樣本需要稀釋后進(jìn)行檢測(cè)。因此,以杜氏利什曼原蟲(chóng)kDNA為靶標(biāo),建立的ddPCR檢測(cè)方法用于臨床還需進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究首次以杜氏利什曼原蟲(chóng)小環(huán)動(dòng)基體DNA為分子靶標(biāo),根據(jù)其保守序列設(shè)計(jì)引物和探針,嘗試建立液滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法,并以質(zhì)粒為樣本從檢測(cè)限、重復(fù)性、成本等方面將其與qPCR進(jìn)行比較。在靈敏度方面,2種方法的檢測(cè)下限均為1.0×10 copies/μL;ddPCR的重復(fù)性隨待測(cè)樣本濃度降低而越差,而qPCR的重復(fù)性更加穩(wěn)定。因此,和qPCR相比,ddPCR沒(méi)有表現(xiàn)出特別明顯的優(yōu)勢(shì)。在對(duì)不同利什曼原蟲(chóng)蟲(chóng)株檢測(cè)中,二者靈敏度具有差異,ddPCR對(duì)個(gè)別分離株表現(xiàn)出了較高靈敏度。ddPCR所需的檢測(cè)時(shí)間和耗材價(jià)格均高于qPCR。數(shù)字PCR被認(rèn)為是寄生蟲(chóng)學(xué)中的一種“新”技術(shù),由于高度敏感性和特異性,人們對(duì)其臨床診斷和篩查的潛力越來(lái)越感興趣,大多數(shù)研究主要用來(lái)分析檢測(cè)低寄生蟲(chóng)負(fù)荷和區(qū)分不同的物種[29]。利什曼原蟲(chóng)ddPCR檢測(cè)方法的建立,以及在內(nèi)臟利什曼病的臨床診斷方面的應(yīng)用還需要更多的研究。

利益沖突：無(wú)