2010—2019年咸陽市食品及芝麻醬加工環(huán)節(jié)中單增李斯特菌污染狀況及其分子流行病學特征分析

張俊君,王瑩瑩,楊 囡,王麗娟,劉 剛,秦 龍

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一種重要的食源性人獸共患病原菌,在自然界普遍存在,且不易被凍融、強烈光照等因素殺死,抗熱能力強,可在范圍較廣的pH條件下生長,具有嗜冷性,能在4 ℃的溫度下存活和繁殖,形成生物膜可長期在食品生產(chǎn)加工企業(yè)存活,是威脅冷藏食品安全的主要病原菌之一[1]。近年來由單增李斯特菌引起的食物中毒事件在國內(nèi)外常有發(fā)生,主要是通過食用被污染的食物進行傳播[2-3],易感人群包括老人、新生兒、孕婦和免疫缺陷人群,可導致發(fā)熱性胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)、新生兒感染等,病死率較高[4-5]。許多國家將單增李斯特菌列為進出口食品的必檢項目[6],我國于2001年建立了全國食源性致病菌監(jiān)測網(wǎng),在全國范圍內(nèi)開展不同種類食品中單增李斯特菌污染狀況監(jiān)測。

本研究對咸陽市2010—2019年12類食品及芝麻醬加工環(huán)節(jié)中的單增李斯特菌進行分離鑒定、血清學分型、脈沖場凝膠電泳(PFGE)、全基因組測序(Whole Genome Sequencing,WGS),并進行多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST),核心基因組多位點序列分型(core genomeMLST,cgMLST),以了解咸陽市食品中單增李斯特菌的污染情況,初步建立咸陽市單增李斯特菌PFGE指紋圖譜庫,掌握單增李斯特菌的分子流行病學特征。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 按照國家食品安全風險監(jiān)測工作手冊[7],于2010—2019年采集了咸陽市區(qū)及其管轄縣(禮泉縣、長武縣、彬縣、三原縣、涇陽縣、淳化縣)的超市、農(nóng)貿(mào)市場、街邊小攤和芝麻醬加工過程等樣本,10年共采集12類1 699份樣本,主要包括生肉制品、熟肉制品、水產(chǎn)品、速凍米面制品、即食非發(fā)酵性豆制品、糕點及餅干、中式?jīng)霭璨?、冷凍飲?冰激凌)、陜西特色食品、外賣、水果/水果干、芝麻醬加工過程樣本,進行單增李斯特菌檢測。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及設備 木糖、鼠李糖和PALCAM瓊脂購自北京路橋公司,LB增菌液購自廣東環(huán)凱公司,血平板和單增李斯特菌顯色平板購自青島海博公司,API20E生化鑒定條和革蘭陽性菌鑒定卡購自法國梅里埃公司,單增李斯特菌分型血清購自日本生研株式會社,限制性內(nèi)切酶XbaI和AscI購自美國NEB公司,全基因組DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司,微生物質譜購儀購自青島融智生物公司,脈沖場電泳系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.3 菌株分離和培養(yǎng) 依據(jù)《國家食品安全風險監(jiān)測工作手冊》和GB4789.30-2010《單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》,進行預增菌、二次增菌、選擇性培養(yǎng),再通過生化反應和微生物質譜進行鑒定。

1.4 血清學分型 單增李斯特菌血清凝集O抗原和H抗原實驗參照日本生研血清試劑的使用說明操作。

1.5 脈沖場凝膠電泳(PFGE) 參照中國CDCPulseNet標準操作規(guī)程,進行膠塊的制備、裂解、洗滌,用內(nèi)切酶AscI進行酶切,電泳圖譜用BioNumerics7.6進行標記和分析,用UPGMA聚類方法建立系統(tǒng)發(fā)生樹,以相似系數(shù)100%確定為同一帶型,參照PulseNet的PFGE條帶命名原則對帶型進行命名。

1.6 全基因組測序 分離鑒定得到單增李斯特菌,使用全基因組DNA提取試劑盒提取DNA,送至上海伯杰醫(yī)療科技股份有限公司進行全基因組測序,測序策略為全基因組鳥槍法,將質控檢測合格的DNA打斷,構建不同插入片段的文庫,用Illumina NovaSeq對文庫進行雙末端測序,使用BioNumerics7.6軟件對測序原始序列進行拼接和分析。

1.7 菌株譜系、血清型和MLST分析 利用法國巴斯德研究所的單增李斯特菌數(shù)據(jù)庫(https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html)分析72株菌全基因組序列,得到菌株譜系、序列型(ST)和克隆群(clonal complex,CC)信息?；诨蛐蛄蟹殖?個血清群(Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅳa和Ⅳb)[8]。按照MLST的7個管家基因中只有1個位點不同定義為同一個CC型,使用BioNumerics7.6軟件構建譜系和CC型生成樹。

1.8 核心基因組多位點序列分型(core geno-meMLST,cgMLST) cgMLST的進化樹構建通過BioNumerics 7.6軟件完成。cgMLST分析框架采用法國巴斯德研究所報道的方法,包括單增李斯特菌EGD-e參考菌株上1 748個高度保守的核心基因[9],根據(jù)cgMLST中等位基因差異數(shù)≤150個,定義為一個亞群(sublineage,SL),亞群中等位基因差異數(shù)≤10個視為同源,11～24個視為可能相關,>25個視為非同源[9-10]。BioNumerics 7.6采用Complete linkage方法,比例因子Scaling factor設為1[9],等位基因差異數(shù)≤10個認為是同源菌株。

1.9 抗性相關基因分析 使用本地BLASTN軟件,將李斯特菌基因組島LGI1(CP001602)、LGI2(NZ_CM001159)分別與72株菌基因組進行比對,參數(shù)設置中基因覆蓋度及一致性閾值均為大于85%。

1.10 質量控制 使用中國CDC食品與營養(yǎng)安全所下發(fā)的單增李斯特菌參考菌株(CMCC54004)做為質控菌株。

1.11 統(tǒng)計學分析 利用Excel完成數(shù)據(jù)整理,使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法,檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 單增李斯特菌檢出情況 2010—2019年共采集1 699份樣品,檢出單增李斯特菌72株,總檢出率4.24%。不同種類食品中,有8類食品檢出單增李斯特菌,生肉制品檢出率最高(18.49%),其次為水產(chǎn)品(8.75%)、熟肉制品(6.11%)、中式?jīng)霭璨?5.31%)、速凍米面制品(4.84%)、陜西特色食品(2.58%)、芝麻醬加工過程樣品(2.31%)、外賣(1.43%)。有4類監(jiān)測食品中未檢出單增李斯特菌。不同種類食品中單增李斯特菌檢出率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(表1)。

表1 2010—2019年咸陽市不同食物種類中單增李斯特菌檢出情況Tab.1 Detection of L. monocytogenes in different foods in Xianyang from 2010 to 2019

2.2 血清型鑒定結果 72株分離株分為5種血清型:1/2a(31/72,43.06%)、1/2b(22/72,30.56%)、1/2c(10/72,13.89%)、4b(6/72,8.33%)、4a(3/72,4.17%)。1/2a、1/2b和1/2c為咸陽市市售食品中單增李斯特菌的主要血清型(圖1)。

2.3 PFGE分型結果 72株單增李斯特菌基因組DNA采用AscI酶切后,產(chǎn)生8～12個條帶,分子量大小在20～1 000 kb。經(jīng)BioNumerics 7.6軟件分析,共獲得40種PFGE圖譜類型(GX6A16.XY0001-GX6A16.XY0040,后文簡寫為XY0001-XY0040),相似度在25.5%～100%。XY0009型(16/72,22.22%)、XY0004型(8/72,11.11%)和XY0003型(5/72,6.94%)為主要的圖譜類型。不同種類的食品中可以檢出相同的帶型(表2)。本研究選取了一家具有代表意義的醬制品加工廠,原料為芝麻,對企業(yè)從原料、加工中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品、環(huán)境、儀器設備等全過程進行采樣分離,XY0009型中有14株分離株來自該芝麻醬生產(chǎn)企業(yè),并且分離自多個生產(chǎn)環(huán)節(jié)(圖1,表3)。

表2 各類食品中PFGE圖譜分布Tab.2 Distribution of PFGE types among various food types

表3 某企業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)單增李斯特菌檢出情況Tab.3 Detection of L. monocytogenes in the production process of an enterprise

2.5 譜系、血清型、序列型和CC型分型結果 72株單增李斯特菌菌株分為3個譜系,其中譜系Ⅱ為優(yōu)勢譜系(56.94%,41/72),以Ⅱa為優(yōu)勢血清型(43.06%,31/72),分屬16種序列型和15種CC型(表4),優(yōu)勢序列型為ST224、ST8、ST9、ST87,其中ST224全部分離自某芝麻醬生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)過程,ST8、ST9、ST87主要分離自生肉制品、中式?jīng)霭璨撕退賰雒酌嬷破?且在不同年份均有檢出?？剐曰蚍治鑫窗l(fā)現(xiàn)株菌攜帶抗季胺鹽類消毒劑基因組島LGI1,有6株來自水產(chǎn)品和生肉制品中的CC2型菌(8.33%,6/72)攜帶LGI2(抗鎘基因cadA和cadC以及抗砷基因arsD2、arsA1、arsR1、arsD2、arsR2、arsA2、arsB1、arsB2)。

表4 72株單增李斯特菌譜系、血清和CC型構成情況Tab.4 Lineages, serotypes, and CC types of 72 L. monocytogenes strains

2.6 cgMLST分型結果 譜系Ⅰ菌中1 748個等位基因差異數(shù)最大為1 250,譜系Ⅱ型為1 410,譜系Ⅲ為1 600。通過cgMLST分析,共分為19個亞群(sublineage,SL),與CC型(15個)基本一致(圖2)。按照cgMLST等位基因差異數(shù)≤10個認定為同源性的標準,27株SL004、SL006和SL007菌株共有6組同源菌株(圖3)。

注:分支上的數(shù)值為等位基因差異數(shù)。圖2 72株單增李斯特菌cgMLST聚類圖Fig.2 cgMLST dendrogram of 72 L.monocygenes strains

注:SL004:11株CC8,SL006:9株CC9,SL007:7株CC87,分支上的數(shù)值為等位基因差異數(shù)。圖3 27株亞群SL004、SL006和SL007單增李斯特菌cgMLST聚類圖Fig.3 cgMLST dendrogram of 27 L. monocytogenes strains belonging to sublineages 004, 006, and 007

3 討 論

近年來,食源性致病菌污染所導致的食品衛(wèi)生安全事件受到社會各界的廣泛關注,由食源性致病菌引起的食源性疾病已經(jīng)成為一個世界性公共衛(wèi)生問題。我國自2009年開始建立全國食源性致病菌監(jiān)測網(wǎng)絡,目前已經(jīng)建立起覆蓋各省、市、縣并逐步延伸到農(nóng)村地區(qū)的監(jiān)測體系,通過及時、準確的檢測為食源性疾病的暴發(fā)提供預警,為制定有效的防控措施提供依據(jù)。咸陽市于2010年加入全國監(jiān)測網(wǎng)絡,2013年和2014年已有相關調查報道[11-12]。

本研究對2010—2019年咸陽市12類食品和芝麻醬加工過程中單增李斯特菌進行了監(jiān)測,在8類食品中檢出單增李斯特菌,總檢出率4.24%,總檢出率低于綿陽市(9.7%)[3],高于渭南市(2.98%)[13]和河北省(1.34%)[14],與北京市順義區(qū)(4.28%)[15]接近。不同食品種類中單增李斯特菌檢出率差異具有統(tǒng)計學意義,生肉制品檢出率最高(18.49%),其次為水產(chǎn)品(8.75%)、熟肉制品(6.11%)和中式?jīng)霭璨?5.31%),與北京市[16]、吉林省[17]報道結果一致,符合Meta分析研究中我國東北和中部地區(qū)肉制品檢出率高的結論[18]。

在檢出率較高的這4類食品中,生肉制品在復雜的屠宰、加工、流通、運輸過程易受到單增李斯特菌的污染。水產(chǎn)品在加工過程反復與案板、刀具、容器接觸也易受污染。熟肉制品在加工過程中如果沒有充分燒熟煮透,就可能使存在于生肉中的單增李斯特菌存活繁殖,而且制作好的熟肉制品若未有效冷藏、與其他生肉共同存儲也會導致被單增李斯特菌污染;中式?jīng)霭璨硕嗖捎美浼庸し绞街谱?可能在加工過程中受到單增李斯特菌污染,且食用前不再加熱直接入口。應加強宣傳教育,提高居民個人食品安全意識,生熟案板分開,避免直接食用生肉制品及生食水產(chǎn)品。同時加強對這幾類食品在加工、儲存、運輸和銷售環(huán)節(jié)的衛(wèi)生監(jiān)督,防止由單增李斯特菌引起食源性疾病的發(fā)生。

根據(jù)菌體O抗原和鞭毛H抗原,可將單增李斯特菌分為13個血清型,對人致病的主要血清型為4b,其次是1/2a和1/2b,三者約占本病的90%[19]。本研究分離的72株單增李斯特菌有5種血清型,優(yōu)勢型為1/2a、1/2b和1/2c,與我國食品中單增李斯特菌最常見的血清型相一致[20]。72株分離株分為40種PFGE圖譜類型,初步建立了咸陽市單增李斯特菌PFGE指紋圖譜庫,可為單增李斯特菌引起食品污染監(jiān)測提供預警及食源性疾病病原學分析和溯源提供參考數(shù)據(jù)。

單增李斯特菌主要分為4個譜系(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),病人來源的分離株主要屬于譜系Ⅰ[8,21],ST87、ST3和ST7是其主要ST型;譜系Ⅱ菌株主要分離自食品,最常見的序列型為ST9、ST8、ST87[22]。本研究中72株單增李斯特菌分離株全部來自食品,譜系、血清群、ST型和CC型多樣化,以譜系Ⅱ和血清型Ⅱa為主,分屬15個CC型和16個序列型,其中優(yōu)勢序列型ST8、ST9、ST87在不同年份的生肉制品、中式?jīng)霭璨撕退賰雒酌嬷破分袡z出率較高,特別是ST87常在臨床中檢出,故對于檢出ST87的食品應進行重點監(jiān)測。

本研究分離到6株(8.33%)4b血清型單增李斯特菌,全部來自于水產(chǎn)品和生肉制品,均為CC2型,抗性基因分析均攜帶有LGI2,LGI2存在于CC2型菌株,特別是4b血清型菌株中,有助于提高菌株的毒力[23-24],故應對此污染現(xiàn)象加以重視。另外結合PFGE分型結果可以看出,9型圖譜中15株1/2b血清型菌株的PFGE帶型聚類效果好,相似度100%,而1/2a和1/2c血清型菌株的PFGE型別較分散,菌株同源性差,相比較血清分型,PFGE分型效果更好。另外分析本研究中菌株來源、分離時間與PFGE的關系發(fā)現(xiàn),XY0003、XY00034、XY00035型圖譜中,不同來源、不同年份分離到的菌株也出現(xiàn)相同的PFGE圖譜類型,提示咸陽市不同市售食品之間可能存在相同的污染來源,或者存在交叉污染的可能性,并且污染源持續(xù)存在。另一方面,不同時間采集的同一類來源食品中可以分離到不同PFGE圖譜類型的菌株,如生肉制品中22株菌,分屬15個PFGE圖譜類型,表明這些來源的單增李斯特菌的持續(xù)污染來自于不同的克隆株,需要引起食品衛(wèi)生部門的重視。

2018-2019在某芝麻醬生產(chǎn)企業(yè)專項監(jiān)測中檢測到單增李斯特菌污染,首次檢測,在前處理區(qū)、灌裝區(qū)和整箱包裝區(qū)的原料、環(huán)境、儀器設備、中間產(chǎn)品和終產(chǎn)品中檢出12株單增李斯特菌,灌裝區(qū)分離株占66.67%,PFGE分型圖譜類型一致,提示該企業(yè)整個生產(chǎn)環(huán)節(jié)存在單增李斯特菌交叉污染,灌裝區(qū)受污染情況最為嚴重。首次檢測結果反饋后該企業(yè)實施了整改措施,啟動清洗消毒程序,并對原料進行了熟制處理。10個月后進行第2次采樣,自原料中檢出2株單增李斯特菌,生產(chǎn)環(huán)節(jié)未檢出,企業(yè)采取的措施有效控制了污染,分析該企業(yè)的可疑污染源主要為原料與后續(xù)加工環(huán)節(jié)的交叉污染,也提示該企業(yè)要加強生產(chǎn)原料的質量控制。第2次分離的2株菌與首次分離的12株菌PFGE分型為同一圖譜類型,疑為同一個污染菌株的持續(xù)污染,經(jīng)cgMLST分型,14株菌均為ST224型,13株菌屬同一個亞群,首次分離的1株菌為另一亞群,等位基因差異數(shù)較大,推斷該企業(yè)首次采樣時生產(chǎn)環(huán)境中可能存在2個克隆株污染,同時顯示相對于PFGE方法,cgMLST方法的分辨率更高,分型效果更好。單增李斯特菌作為食品加工環(huán)境常駐菌,與其攜帶應激生存島和其他環(huán)境抗性基因有關[25-27],結合水產(chǎn)品和生肉制品中單增李斯特菌攜帶LGI2的情況,下一步搜集臨床病例及分離菌株,從毒力基因和抗性基因水平研究其致病性。

本研究中ST224型為優(yōu)勢序列型,這與芝麻醬企業(yè)生產(chǎn)過程交叉污染導致該型單增李斯特菌高檢出率有關,16株ST224型分離株中有2株分離自其他食品,而在本地還未有食品中ST224型菌株檢出的報道,推斷該企業(yè)的原料在市場流通環(huán)節(jié)與污染ST224型菌株的食品存在持續(xù)交叉污染。

全基因組測序技術分辨率力強,已成為流行病學調查和分子溯源的重要工具。PFGE分型技術重復性好,并且已經(jīng)標準化,是近幾年國家食品安全風險監(jiān)測和食源性疾病監(jiān)測中要求的一項溯源技術。本研究中PFGE和cgMLST分型結果為72株分離株分屬40個帶型和19個亞群,PFGE有較高的分辨率,但按照菌株等位基因差異數(shù)≤10的同源性判定標準,27株SL004、SL006和SL007優(yōu)勢菌株識別出6組同源菌株,這6組同源菌株的PFGE帶型均不相同,相對于PFGE方法,cgMLST技術分型能力更強,可做為食源性疾病暴發(fā)調查的主要手段[28]。

通過本次研究,了解了咸陽市食品污染單增李斯特菌的基本狀況、風險較高的食品種類、優(yōu)勢菌型以及遺傳進化特征,對于今后的監(jiān)測重點以及下一步的研究指明了方向。在同源性菌株識別方面,cgMLST分型優(yōu)勢明顯,尤其為某企業(yè)尋找單增李斯特菌的污染來源提供了準確依據(jù)。今后的監(jiān)測工作以及食源性疾病事件調查中,將結合PFGE和全基因組測序分析,重點依靠cgMLST分型對可能出現(xiàn)的食源性疾病事件進行預警,為食源性疾病暴發(fā)后的識別、溯源和調查提供技術支持。

利益沖突：無