2017-2021年遼寧省市售食品中沙門菌的血清型、分子分型及耐藥性分析

于 淼,耿英芝,張銘琰,張眉眉

沙門菌是自然界中最常見的人獸共患病原菌,是導(dǎo)致食源性疾病暴發(fā)的主要因素之一[1]。沙門菌易通過污染的蛋類、奶類和肉類等食物進(jìn)入身體引發(fā)疾病。據(jù)報(bào)道,國內(nèi)多地多次暴發(fā)沙門菌引起的食物中毒事件[2-4]。沙門菌的流行具有地域性,不同地區(qū)流行的沙門菌分子特征和耐藥性也明顯不同。因此沙門菌之間的同源性鑒定對疾病的溯源有重要意義,可以借助脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)來分析該地區(qū)沙門菌的流行病學(xué)特征。

由于養(yǎng)殖業(yè)的不合理使用抗菌藥物,加上耐藥株的廣泛傳播,導(dǎo)致沙門菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重,并出現(xiàn)了多重耐藥的情況。其耐藥基因通過水平轉(zhuǎn)移的方式,最終進(jìn)入對人致病或機(jī)會(huì)致病的病原體中[5],導(dǎo)致人類對沙門菌的耐藥譜不斷拓寬。本研究收集了2017-2021年遼寧省食品中分離出的沙門菌菌株,了解血清型分布、分子分型和耐藥性情況,為控制和治療食源性沙門菌引起的傳播和疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本研究的89株沙門菌來自2017-2021年遼寧省各市采集的市售食品,包括水產(chǎn)品、肉與肉制品、食用菌及其制品、蔬菜及其制品等6 069份樣品,按照GB4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門菌檢驗(yàn)》檢驗(yàn)方法[6]分離獲得,其中2017年7株、2018年9株、2019年8株、2020年55株和2021年10株。PFGE分子分型方法選用沙門菌H9812作為Marker菌株,藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株選用大腸埃希菌ATCC25922,所有菌株均保藏于遼寧省疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑與儀器 沙門菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(CHROMAgar);GN生化鑒定卡(梅里埃);沙門菌診斷血清(日本生研);革蘭陰性需氧菌藥敏測試板(星佰);蛋白酶K(Sigma);Seakem Gold瓊脂糖(LONZA);10×TBE、EDTA、Tris-HCl等緩沖液(Promega公司);XbaⅠ限制性內(nèi)切酶(美國Promega公司);Gelred染液(美國BIOTIUM 公司),以上試劑均在有效期內(nèi)。比濁計(jì)(法國bioMrieux公司);CHEF-Mapper脈沖場電泳儀凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad );GELDOC凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng)及血清學(xué)鑒定 將各市上送的沙門菌株進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn),所有菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定為沙門菌。采用玻片凝集法,根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2016和沙門菌診斷血清說明書,對沙門菌株進(jìn)行O相凝集反應(yīng)和H相血清誘導(dǎo)分型,參照Kauffman-White沙門抗原表鑒定沙門菌血清型,沙門菌抗血清選用日本生研。

1.2.2 PFGE分子分型 參照國家食源性疾病監(jiān)測工作手冊中沙門菌PFGE分子分型標(biāo)準(zhǔn)方法。先將菌懸液調(diào)至4.0～4.5麥?zhǔn)蠞岫?制備膠塊,后經(jīng)XbaI限制性內(nèi)切酶37 ℃ 酶切2 h;初始時(shí)間為2.16 s;終末時(shí)間為63.80 s,電泳時(shí)間19 h。取出膠塊后馬上放入Gelred染色液中震蕩染色25 min,用凝膠成像儀讀取圖譜。經(jīng)BioNumerics 7.6軟件對PFGE成像電泳圖譜結(jié)果進(jìn)行聚類分析。聚類分析算法采用非加權(quán)算術(shù)平均組對方法(UPGMA),每條帶型間的相似度用Dice系數(shù)衡量,條帶位置差異容許度為1.5%,優(yōu)化值為1.5%,相似度100%認(rèn)定為同一PFGE帶型。

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC),實(shí)驗(yàn)用10類15種抗微生物藥物包括氨芐西林(AMP)、氨芐西林/舒巴坦(AMS)、頭孢西丁(CFX)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、慶大霉素(GEN)、氯霉素(CHL)、亞胺培南(IMI)、四環(huán)素(TET)、阿奇霉素(AZI)、環(huán)丙沙星(CIP)、萘啶酸(NAL)、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑(SXT)、多粘菌素E(CT)。將備檢菌株經(jīng)2次傳代培養(yǎng)后,制作0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?取60 μL加入含有12 mL無菌營養(yǎng)肉湯的加樣槽中,充分混勻,然后用8通道微量移液器依次取100 μL稀釋菌液加入到除陰性對照孔外的95孔藥敏板中,陰性對照孔加無菌肉湯培養(yǎng)液100 μL,將接種后的藥敏板放置36 ℃溫箱16～18 h培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照2022版美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)[7]制定的藥敏試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

2 結(jié) 果

2.1 血清型分布 2017-2021年從遼寧省食品樣本中檢出的89株沙門菌分離自肉與肉制品、水產(chǎn)品、食用菌及其制品、蔬菜及其制品、蛋與蛋制品、水果及其制品6大類食品,其中肉與肉制品檢出率最高(7.9%),水產(chǎn)品檢出率次之(1.9%),血清型也主要分布在肉與肉制品中,見表1。

表1 食品中沙門菌檢出率及血清型分布Tab.1 Detection rate and serotype distribution of Salmonella in food

本研究中89株沙門菌共檢測到8個(gè)血清群、包含32種血清型。其中D群腸炎沙門菌檢出率略高為23.6%(21/89),其次為肯塔基沙門菌為16.8%(15/89),其它血清型菌株均低于10%。見表2。

表2 89株沙門菌的血清型分布特征Tab.2 Serotype distribution of 89 Salmonella isolates

2.2 PFGE分子分型 89株沙門菌經(jīng)XbaⅠ酶切后,得到帶型不一的PFGE圖譜,見圖1。根據(jù)電泳產(chǎn)生條帶的數(shù)量和位置的不同進(jìn)行聚類分析,共發(fā)現(xiàn)81種帶型(把菌株間100%相似度判定為同一PFGE帶型),各帶型包含菌株數(shù)1～4株,相似度為47.4%～100%。同一血清型出現(xiàn)相差較遠(yuǎn)的PFGE帶型,如鼠傷寒沙門菌、斯坦利沙門菌。部分里森沙門菌、肯塔基沙門菌、腸炎沙門菌均出現(xiàn)成簇現(xiàn)象。

圖1 89株沙門菌的脈沖場凝膠電泳分型聚類分析結(jié)果Fig.1 PFGE patterns of 89 Salmonella isolates

2.3 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對89株沙門菌進(jìn)行15種抗微生物藥物耐藥實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,沙門菌對萘啶酸(NAL)的耐藥率最高,為52.8%(47/89),其主要來自于雞肉產(chǎn)品90.9%(30/33)。對四環(huán)素(TET)的耐藥率次之為37.1%(33/89),對氨芐西林(AMP)和頭孢唑林(CFZ)耐藥率均為24.7%(22/89)。有28株沙門菌對所有測試藥物均敏感(見表3)。有39株沙門菌分離株耐3類及3類以上藥物,共產(chǎn)生35種耐藥譜,多重耐藥率為43.8%(39/89),其中12株沙門菌分離株具4種藥物抗性,占比13.5%(12/89);4株沙門菌分離株具12種藥物抗性占4.5%(4/89),見表4。

表3 89株沙門菌對不同藥物的敏感性Tab.3 Antibiotic susceptibility of 89 Salmonella isolates

表4 沙門菌耐藥譜分布菌株數(shù)Tab.4 Distribution of drug-resistant Salmonella strains

本研究89株沙門菌耐藥結(jié)果顯示,血清型與耐藥性存在一定關(guān)聯(lián)。姆班達(dá)卡沙門菌、阿貢納沙門菌對抗生素均敏感;里森沙門菌對四環(huán)素100%(6/6)耐藥,腸炎沙門菌對萘啶酸95%(19/20)耐藥。檢出的15株肯塔基沙門菌多重耐藥譜4重到12重,其中對7種及7種以上抗生素耐藥占86.7%(13/15),耐藥狀況最為嚴(yán)重。

不同食品來源菌株的耐藥情況有所不同,肉及肉制品耐一種以上藥物為70%(49/70),水產(chǎn)品耐一種以上藥物為42.8%(6/15),蔬菜及其制品耐一種以上藥物為25%(1/4), 耐藥結(jié)果顯示, 肉及肉制品耐藥率較高、水產(chǎn)品次之。

3 討 論

本研究中經(jīng)血清鑒定分析,89株沙門菌共分8個(gè)血清群、總計(jì)32個(gè)血清型,結(jié)果顯示,食品中沙門菌血清型呈現(xiàn)多態(tài)性分布。其中以D群腸炎沙門菌為優(yōu)勢血清型,占比23.6%(21/89),且大部分于2020年分離得到。據(jù)報(bào)道,李欣等[8],吳春敏等[9]研究的食品和患者中的沙門菌血清型分布特征基本一致,均以腸炎沙門菌為主,本研究與耿英芝等[10]報(bào)道的2016-2020年遼寧省食源性疾病監(jiān)測結(jié)果相比較,沙門菌食品分離株與患者分離株血清型流行特征也一致,均以腸炎沙門菌為主。但是,相較于病源性分離株檢出的13種血清型,本次食品分離株檢出32種血清型,可見食品中血清型更為多樣化,了解遼寧省食品中沙門菌血清分布特征,有助于食源性疾病的防控工作。

沙門菌血清型的鑒定工作繁瑣,具有局限性,需要借助PFGE分子分型方法進(jìn)一步研究沙門菌相同血清型間的基因同源性。PFGE一直被廣泛用于食源性疾病暴發(fā)溯源工作中,是當(dāng)前分子流行病學(xué)應(yīng)用的“金標(biāo)準(zhǔn)”[11],本研究顯示,與腸炎沙門菌較一致,部分血清型的沙門菌存在成簇現(xiàn)象,如肯塔基沙門菌、里森沙門菌,可見相同血清型的沙門菌之間PFGE帶型相似度較高,這與婁靜等[12]、姚素霞等[13]研究結(jié)果較一致。通過使用分子生物學(xué)技術(shù)和血清型鑒定分析,可較好用于疾病暴發(fā)溯源工作,為疾病防控提供科學(xué)依據(jù)。

本研究選取10類15種抗生素進(jìn)行耐藥試驗(yàn),結(jié)果顯示,整體耐藥率為68.5%,菌株均有不同程度耐藥,某些菌株還存在多重耐藥問題,說明遼寧省地區(qū)食品中沙門菌耐藥情況不容樂觀。其中萘啶酸耐藥率最高為52.8%(47/89)、四環(huán)素耐藥次之為37.1%(33/89),這與廣州市2016-2018食品中的沙門菌對氨芐西林耐藥率為56.3%耐藥結(jié)果有所不同[14],但與胡豫杰等研究的2016年我國26個(gè)省沙門菌耐藥情況結(jié)果相吻合[15]。沙門菌感染臨床推薦用藥為喹諾酮類和三代頭孢類,但本研究中對一代喹諾酮類耐藥為52.8%(47/89),三代喹諾酮類耐藥率為21.3%(19/89),中介率也達(dá)34.8%(31/89),對三代頭孢類耐藥率為11.2%(10/89)和16.8%(15/89),提示本地區(qū)臨床用藥慎重選用喹諾酮類藥物。最敏感藥物為亞胺培南,耐藥率為0,這與多地區(qū)研究結(jié)果相似[15-16],分析原因可能與其在體內(nèi)穩(wěn)定性差,很少用于養(yǎng)殖業(yè)有關(guān)。本研究所采雞肉食品中萘啶酸耐藥率高達(dá)90.9%(30/33),多重耐藥情況十分嚴(yán)重,其中檢出的4株12種抗生素耐藥也均來自雞肉分割品,多重耐藥率為66.7%(22/33),可見本省禽類飼養(yǎng)行業(yè)存在不合理使用抗生素情況;多粘菌素已在2018年被禁止用于動(dòng)物飼料添加劑,但本次研究中多粘菌素耐藥率為20.2%(18/89),提示我省還要加強(qiáng)對飼料添加劑的監(jiān)管。

沙門菌有2 500多種血清型,不同血清型的沙門菌對抗生素的耐藥譜不同,本研究89株沙門菌中檢出的15株肯塔基沙門菌對抗生素多重耐藥最為嚴(yán)重,經(jīng)綜合抗生素耐藥情況,如本地區(qū)發(fā)生肯塔基沙門菌引起的食源性疾病臨床可應(yīng)用頭孢西丁及亞胺培南抗生素進(jìn)行治療。本文中20株腸炎沙門菌19株對萘啶酸耐藥,耐藥率90.5%(19/21),對氨芐西林耐藥率也高達(dá)61.9%(13/21),同廣州市報(bào)道相符[17],推測為一代喹諾酮類和青霉素類的廣泛使用對細(xì)菌產(chǎn)生選擇壓力的結(jié)果。提示本地區(qū)應(yīng)合理、規(guī)范使用抗生素,避免細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生。

綜上所述,2017-2021年遼寧省檢出食品中沙門菌呈現(xiàn)出多種血清型,多種PFGE型及多種耐藥譜,高度散發(fā)狀態(tài)。尤其耐藥問題不容樂觀應(yīng)引起各部門高度重視,需從生禽牲畜飼料添加的源頭抓起,守護(hù)好人民食品健康。同時(shí)進(jìn)一步充實(shí)PFGE生物庫數(shù)據(jù),為因沙門菌引起的疾病暴發(fā)流行提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無