基于利什曼原蟲(chóng)K26重組抗原檢測(cè)黑熱病特異抗體的免疫層析試條方法的建立與效果評(píng)價(jià)

石 鋒,丁 丹,高春花,張 璟,賈孝凱,王 穎,危芙蓉

內(nèi)臟利什曼病俗稱黑熱病,在全球廣泛區(qū)域?qū)е聡?yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題,也嚴(yán)重危害我國(guó)西部人民的健康和生命[1]。準(zhǔn)確、早期診斷對(duì)黑熱病的治療和控制至關(guān)重要。建立合適的黑熱病檢測(cè)方法滿足臨床快速診斷和現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查的需要是當(dāng)務(wù)之急。在傳統(tǒng)的病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法中,免疫層析試條法更為簡(jiǎn)便,快捷可靠[2-4]。研究表明,K26蛋白是一種對(duì)黑熱病具有特異性的高抗原性蛋白,本課題組對(duì)我國(guó)利什曼原蟲(chóng)分離株K26抗原進(jìn)行了基因克隆和蛋白表達(dá),ELISA結(jié)果顯示檢測(cè)黑熱病的敏感性和特異性均接近90%或以上。鏈球菌G蛋白(SPG)能特異地同免疫球蛋白IgG分子的Fc段結(jié)合而不影響其Fab段與抗原分子結(jié)合的能力,是一種高效的用于抗體檢測(cè)、純化、清除的蛋白。本研究以我國(guó)利什曼原蟲(chóng)K26重組抗原作為包被抗原,以膠體金標(biāo)記鏈球菌G蛋白作為檢測(cè)探針,檢測(cè)內(nèi)臟利什曼病特異抗體的免疫層析試條法,并對(duì)其檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 人用rK39免疫層析試條購(gòu)自美國(guó)InBios公司;利什曼原蟲(chóng)pET32a-K26-SC6重組質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存;組氨酸標(biāo)簽親和純化柱(Ni-NTA樹(shù)脂)為GE healthcare公司產(chǎn)品,鏈球菌G蛋白(SPG)、兔抗SPG購(gòu)自美國(guó)GE公司;硝酸纖維素(NC)膜、交聯(lián)釋放墊(GFCP20300)、吸水墊(CFSP223000)和樣品墊(GRADE2)為美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。氯金酸(HAuCl·Cl3·4H2O)(滬試牌)購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。XZ1000型噴膜機(jī)為美國(guó)Bio-Dot公司產(chǎn)品。

1.2 血清樣品 病原學(xué)確診內(nèi)臟利什曼病患者血清110份,其中新疆喀什、四川九寨溝縣和新疆伽師縣血清分別為35、45和30份。瘧疾患者血清、細(xì)粒棘球蚴病、日本血吸蟲(chóng)病患者血清各10份,弓形蟲(chóng)病、并殖吸蟲(chóng)病和華支睪吸蟲(chóng)病患者血清各5份為實(shí)驗(yàn)室保存的陽(yáng)性血清,健康人血清40份。

1.3 rK26重組抗原的制備 將轉(zhuǎn)化有 pET32a-K26-SC6 重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)后, 隨機(jī)挑選菌落, 于 LB-Amp 培養(yǎng)基培養(yǎng)至 OD600=0.6 時(shí), 加入1 mmol/L IPTG,28 ℃誘導(dǎo)4 h,用蛋白抽提劑、蛋白酶抑制劑、溶菌酶和核酸酶裂解表達(dá)細(xì)菌,Ni-NTA樹(shù)脂親和純化表達(dá)產(chǎn)物。12% SDS-PAGE 檢查重組蛋白表達(dá)情況后測(cè)純化蛋白濃度,-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 rK26免疫層析試條的制備 用膠體金標(biāo)記SPG,將利什曼原蟲(chóng) K26 重組抗原(檢測(cè)線)和兔抗 SPG(對(duì)照線)分別噴涂在 NC 膜上適當(dāng)位置制成膠體金免疫試條[5]。

1.5 rK26免疫層析試條檢測(cè)條件的選取 將適量樣本血清加在樣品墊上,然后滴加適量樣本稀釋液,適時(shí)觀察并記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.6 rK39試條的檢測(cè)方法 rK39試條檢測(cè)方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。簡(jiǎn)言之,取20 μL待檢血清滴于試條樣品墊上,吸干后再加 2～3 滴(約150 μL)chase 緩沖液。質(zhì)控帶和檢測(cè)帶均出現(xiàn)紅色條帶,判為陽(yáng)性,只有質(zhì)控帶出現(xiàn)紅色條帶則判為陰性,如果質(zhì)控帶不出現(xiàn)紅色條帶則說(shuō)明試條失效。檢測(cè)結(jié)果均在15 min內(nèi)判斷。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS 9.4 軟件對(duì)2種試條的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和一致性檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 rK26重組抗原的制備 K26-SC6基因片段長(zhǎng)度為404個(gè)堿基(Accession no.MN688116),推測(cè)編碼的氨基酸個(gè)數(shù)為134個(gè)。推導(dǎo)的氨基酸序列如下:TKDSAKKPQKRADNIHKTTETNHRGA-AGVPPKHAGGAMNDSALKEDGHTQKNDGGA-PKEDGHTQKNDGDGPKEDDHAHNDGDGPKE-DDHAHNDGDGPKEDDHAHNDGGGPKEDDH-AHNDGGG PKEGENLQQNDG。rK26重組抗原的表達(dá)和純化情況如圖1。

M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量;1為未誘導(dǎo)全細(xì)胞; 2為IPTG誘導(dǎo)全細(xì)胞;3為誘導(dǎo)全細(xì)胞裂解上清; 4為誘導(dǎo)全細(xì)胞裂解沉淀; 5為純化后的重組蛋白。圖1 K26-SC6重組蛋白表達(dá)和純化的12% SDS-PAGE電泳分析Fig.1 SDS-PAGE (12%) analysis of pET32a-K26-SC6 expressed in E. coli BL21 cells

2.2 rK26試條的制備 檢測(cè)線上的利什曼原蟲(chóng)K26重組抗原工作濃度為1.3 mg/mL,噴涂量為1 μL/cm;質(zhì)控線二抗抗體(兔抗SPG)工作濃度為1.0 mg/mL,噴涂量為1 μL/cm;鏈球菌G蛋白(SPG)探針的工作濃度(以蛋白濃度計(jì)):100 μg/mL,噴涂量為40 μL/cm。

2.3 rK26試條的檢測(cè)條件 每次檢測(cè)取5 μL血清,緩慢滴加4滴(120～200 μL)樣本稀釋液。只要檢測(cè)帶出現(xiàn)紅色條帶, 不論強(qiáng)弱即判為陽(yáng)性, 否則為陰性。檢測(cè)結(jié)果均在15 min 內(nèi)判斷。

2.4 rK26試條法和rK39試條法檢測(cè)結(jié)果 rK26試條法和rK39試條法對(duì)內(nèi)臟利什曼病患者血清、健康人血清和其他寄生蟲(chóng)病患者血清進(jìn)行檢測(cè),部分檢測(cè)結(jié)果如圖2。

卡板:rK26 綠色試條:rK39圖2 rK26試條法和rK39試條法部分檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of rK26 and rK39 strip tests

rK26試條法和rK39試條法檢測(cè)內(nèi)臟利什曼病患者血清的敏感性分別為91.82%(101/110)和93.64%(103/110);與10份瘧疾患者血清、10份日本血吸蟲(chóng)病患者血清、10份細(xì)粒棘球蚴病患者血清、5份弓形蟲(chóng)病患者血清、5份并殖吸蟲(chóng)病患者血清和5份華支睪吸蟲(chóng)病患者血清均無(wú)交叉反應(yīng),40份健康者血清也均為陰性,總特異性為100.00%(表1)。

表1 rK26試條法和rK39試條法檢測(cè)寄生蟲(chóng)病患者和健康人血清Tab.1 Detection results of sera from different patients and controls with the rK26 and rK39 immunochromatographic strip tests

2.5 rK26試條法和rK39試條法檢測(cè)黑熱病患者血清結(jié)果比較 rK26試條法和rK39試條法共檢

測(cè)110份黑熱病患者血清,二者均檢測(cè)陽(yáng)性的例數(shù)為100份,均為陰性的例數(shù)為7份。rK26試條法檢測(cè)出的101份內(nèi)臟利什曼病患者血清中,rK39試條法有1份顯示陰性,rK39試條法檢測(cè)出的103份內(nèi)臟利什曼病患者血清中,rK26試條法有3份顯示陰性(表2)。rK26試條法和rK39試條法檢測(cè)黑熱病患者血清敏感性之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.25,P=0.62),2種試條法檢測(cè)黑熱病患者血清的結(jié)果一致性較好(κ=0.73)。

表2 rK26試條法和rK39試條法檢測(cè)內(nèi)臟利什曼病患者血清結(jié)果比較Tab.2 Comparison of detection results in sera from patients with visceral leishmaniasis with the rK26 immunochromatographic strip or rK39 immunochromatographic strip

3 討 論

以骨髓、脾等穿刺物涂片染色鏡檢、體外原蟲(chóng)培養(yǎng)和易感動(dòng)物接種等病原學(xué)檢查是內(nèi)臟利什曼病最古老的診斷方法,迄今仍是內(nèi)臟利什曼病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但這些方法敏感性較低,對(duì)專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員要求較高,容易漏檢、誤檢,而且對(duì)患者有一定的傷害風(fēng)險(xiǎn),并不適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。致內(nèi)臟利什曼病的利什曼原蟲(chóng)感染能誘導(dǎo)人、犬產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng),據(jù)此常以免疫學(xué)方法檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)特異抗體,以檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)感染,具有很高的敏感性[6]。但免疫學(xué)方法中如間接熒光抗體試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫印跡等方法耗時(shí),需要特殊的材料和設(shè)備,難以廣泛使用,而免疫層析試條法更為簡(jiǎn)便,快捷可靠,特別適合在基層和現(xiàn)場(chǎng)使用,成為近年來(lái)推廣迅速的新技術(shù)。Burns JM等[7]從恰氏利什曼原蟲(chóng)的類(lèi)Kinesin基因中獲得了基因片段K39,并證實(shí)其存在于所有引起內(nèi)臟利什曼病的利什曼原蟲(chóng)蟲(chóng)種(株)中。美國(guó)InBios公司以此基因片段的重組抗原K39制備的rK39免疫層析試條在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用中取得較好的效果[8-9],是目前唯一商品化的快速檢測(cè)內(nèi)臟利什曼病的產(chǎn)品,但K39基因只在發(fā)病時(shí)(有癥狀)表達(dá),因此,該產(chǎn)品不能應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查,應(yīng)用存在局限性[10-11]。另外,rK39試劑盒價(jià)格昂貴,而黑熱病多發(fā)于貧困國(guó)家和地區(qū),患者難以負(fù)擔(dān)較高費(fèi)用,從而限制了該試劑盒的推廣和普及。

K26蛋白也被稱為親水性?；砻娴鞍譈(hydrophilic acylated surface protein B,HASPB),K26抗原編碼基因編碼含有多個(gè)由10～11個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的重復(fù)序列[12]。同地區(qū)的利什曼原蟲(chóng)26蛋白重復(fù)區(qū)數(shù)量、順序和排列不同,且同是嬰兒利什曼原蟲(chóng)的不同蟲(chóng)株中K26蛋白觀察到的重復(fù)序列也不同[13]。有報(bào)道表明K26蛋白是一種對(duì)內(nèi)臟利什曼病具有特異性的高抗原性蛋白,對(duì)利什曼原蟲(chóng)無(wú)癥狀感染也有很好的檢測(cè)效果[11],但用于血清學(xué)診斷黑熱病的K26抗原最好是來(lái)自當(dāng)?shù)乩猜x(chóng)蟲(chóng)株[14]。本課題組對(duì)我國(guó)3種類(lèi)型黑熱病流行區(qū)利什曼原蟲(chóng)分離株K26抗原分別進(jìn)行了基因克隆和蛋白表達(dá),ELISA結(jié)果顯示檢測(cè)黑熱病患者血清的敏感性均為90%以上,而對(duì)瘧疾、日本血吸蟲(chóng)病、細(xì)粒棘球蚴病、弓形蟲(chóng)病、并殖吸蟲(chóng)病和華支睪吸蟲(chóng)病患者血清均無(wú)交叉反應(yīng),40份健康者血清也均為陰性,特異性均高達(dá)100%。來(lái)源于我國(guó)3種類(lèi)型內(nèi)臟利什曼病流行區(qū)的利什曼原蟲(chóng)K26重組蛋白對(duì)黑熱病患者血清的陽(yáng)性檢出率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.53,P=0.77),且3種K26抗原對(duì)源自新疆喀什(人源型黑熱病流行區(qū)),四川(人犬共患型黑熱病流行區(qū))和新疆伽師(野生動(dòng)物源型黑熱病流行區(qū))的黑熱病患者血清的檢測(cè)結(jié)果之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究以利什曼原蟲(chóng)K26重組抗原(SC6株)作為包被抗原,以膠體金標(biāo)記SPG為檢測(cè)試劑,成功建立了檢測(cè)內(nèi)臟利什曼病的免疫層析試條,該試條檢測(cè)內(nèi)臟利什曼病患者血清的敏感性為91.82%(101/110),檢測(cè)其他寄生蟲(chóng)病患者血清和正常人血清也表現(xiàn)出很好的特異性,高達(dá)100%。與平行檢測(cè)的rK39試條法之間無(wú)論是敏感性還是特異性的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2種試條法檢測(cè)黑熱病患者血清的結(jié)果一致性較好(κ=0.73)。

本研究制備的內(nèi)臟利什曼病檢測(cè)免疫層析試條,血清用量較rK39試條少,在樣品墊部分使用特殊濾血紙,可以有效過(guò)濾掉全血中的紅細(xì)胞,避免紅細(xì)胞在檢測(cè)中對(duì)判讀結(jié)果造成干擾,這樣在檢測(cè)過(guò)程中可以無(wú)需分離血清,直接采全血即可進(jìn)行檢驗(yàn),可增加受試者依從性,方便基層和現(xiàn)場(chǎng)的使用。以后還需在現(xiàn)場(chǎng)擴(kuò)大測(cè)試,以作進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

利益沖突：無(wú)