2021—2022年溫州市細菌性食源性疾病暴發(fā)事件流行病學及病原學特征分析

章樂怡,樓輝煌,林謙閣,劉雪薇,李海燕,胡玉琴,洪程基,李 毅

食源性疾病是一個日益嚴重的公共衛(wèi)生問題,造成了全球疾病負擔和死亡率,美國食源性疾病每年給社會造成的負擔約為 360 億美元[1]。其中在細菌性食源性疾病中,沙門菌和副溶血性弧菌所致事件數及患病人數最多[2]。副溶血性弧菌在沿海省份引起的暴發(fā)比例最多,沙門菌在內陸省份引起的暴發(fā)比例最大[3]。2011—2020年浙江省細菌性食源性疾病暴發(fā)事件中病原菌以副溶血性弧菌居首位(58.41%),其次是沙門菌(18.38%)[4]。

本文采集2021—2022 年溫州市細菌性食源性疾病暴發(fā)事件的監(jiān)測數據,分析其流行病學特征和變化趨勢,并對分離的病原菌進行血清學鑒定、PFGE分子分型、全基因組測序及藥敏試驗等,以了解本地區(qū)食源性疾病暴發(fā)病原菌的流行趨勢、菌株的血清型別的變遷、分子分型特征及抗菌藥物耐藥性。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 樣本來自2021年、2022年溫州市19起細菌性食源性疾病暴發(fā)事件,在相關病人標本和食品、環(huán)境標本中分離出114株病原菌,包括副溶血性弧菌(55株)、彎曲菌(44株)、金黃色葡萄球菌(6株)、沙門菌 (6株)、致瀉大腸埃希菌(3株),其中事件1-10病原菌為副溶血性弧菌,事件11-12病原菌為金黃色葡萄球菌,事件13病原菌為致瀉大腸埃希菌,事件14病原菌為沙門菌,事件15-19病原菌為彎曲菌。

1.2 主要儀器和試劑 全自動微生物質譜鑒定系統(tǒng)MALDI Biotyper Smart(布魯克北京科技有限公司);CHEF Mapper 型脈沖場凝膠電泳儀、Gel XR 型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司);QuantStudio7FlexPCR儀(美國Thermo Fisher);彎曲菌瓊脂稀釋法抗生素最低抑菌濃度(MIC)檢測試劑盒購自青島中創(chuàng)匯科科技有限公司,革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板CHNM4F購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。所有試劑在有效期內使用。測序由蘇州微次元生物科技有限公司完成。

1.3 實驗室檢測

1.3.1 病原菌分離鑒定 參照《浙江省食源性疾病監(jiān)測工作手冊》中的檢測方法,對暴發(fā)事件中的相關標本進行副溶血性弧菌、彎曲菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、致瀉性大腸埃希菌分離,用質譜方法、PCR方法、血清學分型等進行病原菌型別確定,用酶聯(lián)免疫法進行金黃色葡萄球菌腸毒素測定。

1.3.2 菌株耐藥性分析 沙門菌、副溶血性弧菌的藥敏實驗采用美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI) 推薦的微量肉湯稀釋法。包含了9大類14種抗菌藥物。將新鮮的菌培養(yǎng)物制成0.5麥氏濁度菌懸液,取10 μL加入到11 mL CAMHBT肉湯中,得到試驗用菌懸液。用加樣儀在藥敏板中每孔加入50 μL菌懸液,36 ℃培養(yǎng)過夜后讀取結果,記錄MIC值。沙門菌、副溶血性弧菌耐藥結果參照CLSI M45 2015(3th edition)、CLSI M100 2022(32th edition) 進行判讀,大腸埃希菌(ATCC25922)作為質控菌株。

彎曲菌藥敏實驗根據CLSI推薦的彎曲菌瓊脂稀釋法。包含了7大類11種抗菌藥物?？漳c彎曲菌(ATCC33560)作為質控菌株。42 ℃微需氧培養(yǎng)48 h后讀結果。記錄彎曲菌對各類藥物的最低抑菌濃度值(MIC值),根據美國NARMS(National Antimicrobial Resistance Monitoring System)標準(https://www.cdc.gov/narms/antibiotics-tested.html)及文獻報道對彎曲菌的耐藥進行判定[5]。

1.3.3 副溶血性弧菌、沙門菌脈沖場凝膠電泳(PFGE)分析 按照《2022 年國家食源性疾病監(jiān)測工作手冊》中食源性致病菌PFGE 操作程序制Plug,沙門菌、副溶血性弧菌分別以XbaI、NotI內切酶為限制性內切酶,沙門菌 H9812 作為分子質量標準。電泳條件設置參照手冊進行。電泳后用 GelRed進行染色和純水脫色,最后用凝膠成像儀成像,并使用Bionumerics 7.6生物信息學軟件對分離株的指紋圖譜進行聚類分析。

1.3.4 全基因測序 利用全基因組測序對彎曲菌、金黃色葡萄球菌、致瀉大腸埃希菌進行MLST分析,對分離的菌株進行基因組DNA提取后外送開展細菌全基因組測序。測序后獲得的數據提交至pubMLST數據庫,獲取每個菌株7個管家基因的等位基因號,根據等位基因號確定ST型。并使用 BioNumeric軟件對彎曲菌進行聚類,生成彎曲菌最小生成樹。

2 結 果

2.1 流行病學結果 2021—2022年共發(fā)生19起細菌性食源性疾病聚集事件,包括10起副溶血性弧菌事件(發(fā)病200例)、5起彎曲菌事件(發(fā)病83例)、1起致瀉性大腸埃希菌事件(發(fā)病7例)、2起金黃色葡萄球菌事件(發(fā)病20例)、1起沙門菌事件(發(fā)病11例)。事件發(fā)生時間分布在3至11 月,其中5月、7月、9月、11月均3起。暴發(fā)場所分別為酒店餐飲(10起)、學校(7起)、公司食堂(1起)和家庭(1起)。誘發(fā)因素分別為加工不當(10.53%,2/19)、生熟交叉污染 (42.11%,8/19)、原因不明9起(47.37%,9/19)。詳見圖1。

圖1 2021—2022年食源性疾病暴發(fā)事件流行病學調查情況Fig.1 Epidemiological investigation of foodborne outbreaks from 2021 to 2022

2.2 實驗室病原學檢測結果

2.2.1 副溶血性弧菌血清型及PFGE分型結果 10起副溶血性弧菌事件中共分離到55株副溶血性弧菌菌株,包括47株病人株,8株食品及環(huán)境株。9起事件由副溶血性弧菌O10∶K4血清型引起的,僅1起事件由O3∶K6血清型引起。其中事件4中病人株以O10∶K4為主要血清型,但有一株病人株為O3∶K6血清型,事件 4、6、7、8、9、10分離的副溶血性弧菌均為O10∶K4血清型,且每起事件菌株間的 PFGE圖譜一致,同源性高達 100%。事件 2、3、5中菌株PFGE圖譜相似度分別為92.2%、96.9%、94.1%,同源性相對較高,條帶數完全一致。事件1中3株菌的PFGE圖譜相似度為100%,有一株菌相似度88.6%。事件3、6、9中有食品或物表涂抹物中分離出副溶血性弧菌,但血清型與病人株均不一致,均無法溯源到食品。47株病人株PFGE圖譜見圖2。

圖2 47株副溶血性弧菌病人株PFGE聚類分析Fig.2 PFGE cluster analysis of 47 V. parahaemolyticus patient strains

2.2.2 彎曲菌MLST分型結果 5起彎曲菌事件共分離44株彎曲菌,經全基因組測序得到彎曲菌 MLST分型結果,44株彎曲菌分為7種ST型。其中事件17彎曲菌 ST型最為復雜,檢出4種ST型,分別為ST2031、ST7533、ST11105、ST11106,刀具砧板表面、蒸柜容器把手表面均檢出空腸彎曲菌(ST2031、ST11105),且分別有對應ST型的病人株檢出。事件16、19病人株均為單一的ST型,分別為ST257、ST11711,而事件15(2021年)和事件18(2022 年)均為ST9079。見圖3。

注:在最小生成樹中,圓圈周圍的數字代表彎曲菌MLST型別,圓圈的大小表示這個ST型的分離株數量。圓圈內不同顏色代表不同的事件。圖3 44株彎曲菌分離株的最小生成樹Fig.3 Minimum spanning tree of 44 Campylobacter isolates

2.2.3 金黃色葡萄球菌及其腸毒素結果 全基因組測序結果表明,事件11為家庭暴發(fā)事件,分離的金黃色葡萄球菌的ST型為ST188,其中病人、物體表面和食品株均為同一ST型,腸毒素結果為A型腸毒素;而事件12中出現(xiàn)18個病例,由于采樣不及時,僅3個病例金黃色葡萄球菌分離成功,且分離出金黃色葡萄球的ST型均不同,分別為ST88、ST188、ST25,腸毒素結果均為A型腸毒素。

2.2.4 沙門菌血清型、PFGE分型及MLST分型結果 本研究中事件14的病原菌為腸炎沙門菌(9,12:m:-),6株分離株的MLST型別均為ST11,PFGE帶型有2種,但這2種帶型僅存在一條差異,根據Tenover原則[6-7],他們屬于緊密相關,見圖4。

圖4 腸炎沙門菌PFGE分型結果Fig.4 PFGE cluster analysis of Salmonella Enteritidis

2.2.5 大腸埃希菌毒力基因及全基因組測序結果 事件15分離出3株腸聚集性大腸埃希菌 (EAEC),PCR毒力基因結果均為aggR、pic/astA陽性,MLST結果顯示其中2株為ST156,另一株為ST4383。

2.2.6 藥敏結果

2.2.6.1 44株彎曲菌分離株對11種抗菌藥物的耐藥結果 44株空腸彎曲菌分離株中,以四環(huán)素、萘啶酸、環(huán)丙沙星耐藥率最高,分別達95.45%、90.91%、86.36%,其中5株彎曲菌出現(xiàn)多重耐藥(11.36%,5/44)。除兩起事件(事件15、16)分離的病人株之間耐藥完全一致,其他事件分離的病人株之間耐藥有差異。見表1。

表1 44株空腸彎曲菌分離株對11種抗菌藥物的耐藥率Tab.1 Drug resistance rate of 11 antimicrobial agents to 44 Campylobacter isolates

2.2.6.2 沙門菌、副溶血性弧菌對14種抗菌藥物的耐藥結果 6株腸炎沙門菌對青霉素類(氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦)、四環(huán)素、萘啶酸、多黏菌素E、頭孢唑啉耐藥,對其他幾類抗菌藥物敏感。55株副溶血性弧菌無多重耐菌株出現(xiàn),其中50株副溶血性弧菌對頭孢唑啉耐藥,耐藥率達90.91%,對碳青霉烯類等五大類抗菌藥物均100%敏感。見表2。

表2 沙門菌和副溶血性弧菌分離株對14種抗菌藥物的耐藥率Tab.2 Drug resistance rate of 14 antimicrobial agents to V. parahaemolyticus and Salmonella isolates

3 討 論

近年來我國平均每年發(fā)生食物中毒的人數接近 5 萬人[8],2011—2020 年我國微生物食物中毒事件中主要的致病微生物為沙門菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌[4]。本文通過對2021—2022年溫州市細菌性食源性疾病暴發(fā)事件分析,顯示本市副溶血性弧菌暴發(fā)事件占首位,這與本市地處華東沿海有一定關系。但本地區(qū)彎曲菌引起的食物中毒報告數呈上升趨勢,已超過以往華東地區(qū)常見的沙門菌、金黃色葡萄球菌[9]。據美國的文獻報道彎曲菌是最常見的食源性病原菌,每10萬人中有19.5例感染[10]。而國內彎曲菌事件的低報告率事實上是由于檢測手段的缺乏導致,這是一個被低估了的致病因素[11]。

據文獻報道,84.91%細菌性食物中毒的暴發(fā)發(fā)生在5月至10月[2]。本研究中的副溶血性弧菌暴發(fā)事件符合細菌性食物中毒明顯的季節(jié)性特征,大多發(fā)生在7月至10月,尤其在高溫、高濕的夏季發(fā)生頻率較高。而本研究中彎曲菌暴發(fā)事件則集中在4月、5月、11月,發(fā)生的季節(jié)氣溫相對比較低。在本市往年食源性疾病日常監(jiān)測中也發(fā)現(xiàn)彎曲菌感染沒有明顯的季節(jié)性,一年四季中均有檢出[11]。

19起細菌性食源性疾病事件的誘發(fā)因素分類情況分析表明有8起(42.11%)誘因是生熟交叉污染,而原因不明占了9起(47.37%)。在副溶血性弧菌暴發(fā)事件中,盡管3起事件的剩余食品(包括海產品及熟食)中均檢出副溶血性弧菌,但經分子溯源后發(fā)現(xiàn)與病人株非同源,表明食品中污染的副溶血性弧菌型別非常多,沒有檢測到與病人株同型別的目標菌,由于發(fā)生的場所主要是酒店和學校食堂,菜品的復雜性、留樣的規(guī)范性都是溯源不成功的因素。本研究中彎曲菌暴發(fā)事件全部發(fā)生在學校,其中一起彎曲菌事件在廚房的刀具砧板表面、蒸柜容器把手均分離到菌株,且與病人基因型一致。另一起發(fā)生在家庭的金黃色葡萄球菌事件中,在食物、物表和病人中檢測到同一ST型的菌株。故生熟交叉還是廚房普遍存在的問題,原料間、原料與廚具間的污染均會造成暴發(fā)事件的發(fā)生。

本研究中10起副溶血性弧菌事件中有9起為O10∶K4血清型,只有一起事件為O3∶K6血清型。O3∶K6和O1∶KUT曾是與2008—2014年中國南方疫情相關的主要血清型[12],而近幾年本市的食源性疾病監(jiān)測數據表明,2019年開始出現(xiàn)O10∶K4,2020年逐漸變成優(yōu)勢血清型。2021年O10∶K4血清型占80.49%[13]。由于副溶血性弧菌基因重組頻繁發(fā)生,如果重組發(fā)生在O和K抗原編碼基因簇周圍,血清型可能會發(fā)生改變[14],O10∶K4是由O3∶K6大流行克隆進化而來,它是血清變異之一[15]。密切關注副溶血性弧菌血清型的變異情況對本地區(qū)該菌在人群中的流行提供準確溯源依據。副溶血性弧菌耐藥結果顯示無多重耐菌株出現(xiàn),90.91% 副溶血性弧菌對頭孢唑啉耐藥,與深圳報道的副溶血性弧菌事件中的耐藥結果相似[16]。

在本研究中彎曲菌事件出現(xiàn)了7種ST型的彎曲菌,其中一起事件來源復雜,檢出了4種ST型,其他均是由單一的ST型引起的。而2021年、2022年有兩起事件均為ST9079,這些菌株在遺傳關系上非常的接近,然而這個ST型在本市以往的散發(fā)病例監(jiān)測中并沒有發(fā)現(xiàn),表明本市彎曲菌病人株存在遺傳多態(tài)性。這些彎曲菌菌株對四環(huán)素、萘啶酸、環(huán)丙沙星耐藥率較高,同時11.36%的菌株出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。

國內沙門菌監(jiān)測研究中顯示[17],腸炎沙門菌在 2006、2012、2019年均占主導地位,該血清型在沙門菌引起的感染性腹瀉中也屬于優(yōu)勢血清型[18-19],在我國沙門菌暴發(fā)事件中則是出現(xiàn)頻率很高的一種沙門菌[20]。由于沙門菌同一血清型內各菌株管家基因堿基序列的高度保守,絕大多數腸炎沙門菌ST型為ST11,本事件中6株腸炎沙門菌ST型均為ST11,但6株菌出現(xiàn)2種PFGE帶型,這2種帶型僅存在一個條帶的差異,由于細菌的基因存在高度變異性,當有1～3條條帶的差別時,則說明菌株間的親緣關系較近。沙門菌耐藥結果表明對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、萘啶酸、頭孢唑啉等均耐藥,與蘇州報道基本一致。沙門菌的耐藥日益嚴重,故需加強對沙門菌耐藥性的主動監(jiān)測,指導臨床合理用藥,降低抗菌藥物耐藥性的影響。

利益沖突：無