PKD通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路調(diào)控單核細(xì)胞增生李斯特菌感染Caco-2細(xì)胞

李家政,張峰源,許晶晶,姜旭淦,陳盛霞

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)簡(jiǎn)稱單增李斯特菌,是一種革蘭陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌,可導(dǎo)致侵襲性李斯特菌病。Lm可在人體內(nèi)無(wú)癥狀定植,健康人可能會(huì)出現(xiàn)自限性的胃腸炎,但免疫功能低下的患者、老年人、孕婦和新生兒則表現(xiàn)出發(fā)熱性胃腸炎、菌血癥、敗血癥、腦膜炎和胎兒死亡等癥狀,致死率高達(dá)20%～30%[1-2]。Lm從低水平抑制感染狀態(tài)到暴發(fā)性疾病發(fā)作的轉(zhuǎn)變機(jī)制尚不清楚。目前研究表明,腸道微生物群的組成[3-4]、腸道粘液屏障[5]、小腸分泌細(xì)胞分泌抗菌蛋白和防御肽[6-7]、誘導(dǎo)激活NLRP3炎癥小體從而增加促炎細(xì)胞因子的成熟和釋放[8]等均可抵抗Lm感染,這可能是導(dǎo)致Lm無(wú)癥狀定居和長(zhǎng)潛伏期的因素。

蛋白激酶D(protein kinase D,PKD)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,哺乳動(dòng)物中有3種亞型:PKD1、PKD2和PKD3。PKD現(xiàn)已成為甘油二酯(diacylglycerol,DAG)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵信號(hào)節(jié)點(diǎn),可被多種細(xì)胞刺激激活,影響細(xì)胞基本功能,包括分泌、遷移、增殖、存活、血管生成和免疫反應(yīng)等[9]。但對(duì)于PKD在Lm感染時(shí)所發(fā)揮的功能,尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

穿越腸道屏障是Lm致病的第一步,也是最關(guān)鍵的一步。腸道上皮細(xì)胞炎癥因子的激活和釋放、緊密連接蛋白的表達(dá)和重塑、上皮細(xì)胞更新等對(duì)Lm侵襲和穿過(guò)腸上皮細(xì)胞屏障非常重要[10-11]。由于Caco-2細(xì)胞體外培養(yǎng)匯合形成細(xì)胞單層,表現(xiàn)出緊密連接介導(dǎo)的屏障功能及頂端刷狀緣形態(tài)等特征,現(xiàn)被廣泛用作腸道屏障的模型[12]。此實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討Lm感染對(duì)Caco-2細(xì)胞PKD表達(dá)的影響,研究PKD在調(diào)控Lm感染Caco-2細(xì)胞存活率和炎癥中的作用及機(jī)制,為進(jìn)一步研究PKD在Lm穿過(guò)腸道上皮細(xì)胞屏障時(shí)的功能以及發(fā)現(xiàn)治療Lm靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞 Lm EGD株由天津醫(yī)科大學(xué)申艷娜教授惠贈(zèng),甘油菌保存于-80 ℃冰箱。Caco-2細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司,液氮中長(zhǎng)期保種。

1.2 主要試劑 Caco-2細(xì)胞專用培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;腦心浸出液肉湯(brain heart infusion,BHI)培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;CCK-8、RNA-easy Isolation Reagent、HiScript III RT SuperMix for qPCR、AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒均購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司;PKD抑制劑CID755673購(gòu)自美國(guó)MCE公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、羊抗鼠辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)二抗和羊抗兔HRP二抗購(gòu)自北京康為生物科技有限公司;ERK1/2抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技;IκBα抗體購(gòu)自杭州華安技術(shù)有限公司;p-ERK1/2、p-IκBα抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;NLRP3抗體購(gòu)自德國(guó)Novus公司。

1.3 Caco-2細(xì)胞和Lm的培養(yǎng) Caco-2細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,用Caco-2細(xì)胞專用培養(yǎng)基置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2～5 d傳代1次,取第3-6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好且匯合度達(dá)90%的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。Lm接種于滅菌BHI培養(yǎng)液中,37 ℃ 250 r/min恒溫空氣浴搖床培養(yǎng)増菌至Lm處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(菌液OD600值為0.7～0.8),取出菌液,離心后用無(wú)菌PBS洗滌沉淀2次,然后用PBS重懸并調(diào)整菌懸液OD600=1用于實(shí)驗(yàn),此時(shí)細(xì)菌濃度約為1×109CFU/mL。

1.4 Lm感染Caco-2細(xì)胞模型 Caco-2細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中。按1.3制備Lm的PBS菌懸液,分別以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為1、10、100感染Caco-2細(xì)胞,共孵育2 h后加入終濃度為100 μg/mL慶大霉素殺死胞外菌,殺菌45 min后用無(wú)菌PBS輕柔洗滌2次,加入無(wú)抗生素完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以加入Lm為計(jì)時(shí)起點(diǎn),收集3 h、6 h、9 h、12 h細(xì)胞提取RNA。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)PKD mRNA表達(dá) 根據(jù)RNA-easy Isolation Reagent試劑盒操作說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA,利用HiScript III RT SuperMix for qPCR試劑盒制備cDNA,按AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒操作進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置,預(yù)變性:95 ℃ 5 min;循環(huán)反應(yīng):95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);熔解曲線:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。統(tǒng)計(jì)熒光值,用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的表達(dá)量。PKD1、PKD2和PKD3引物來(lái)源于PrimerBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pga.mgh.harvard.edu/ primerbank/index.html),GAPDH為內(nèi)參基因,引物序列見(jiàn)表1,引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.1 Primer information

1.6 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分NC組、Lm組、Lm+DMSO組和Lm+CID755673組。NC組:即細(xì)胞對(duì)照組,Caco-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng);Lm組:即感染組,以MOI=100 Lm感染Caco-2細(xì)胞,方法同1.4;Lm+DMSO組:即DMSO對(duì)照組,先用含0.01% DMSO完全培養(yǎng)基孵育Caco-2細(xì)胞2 h,再進(jìn)行MOI=100 Lm感染;Lm+CID755673組:即CID755673抑制劑組,先用含實(shí)驗(yàn)設(shè)定CID755673濃度的完全培養(yǎng)基孵育Caco-2細(xì)胞2 h,再進(jìn)行MOI=100 Lm感染。

1.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 Caco-2細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔板中,按照1.6操作處理各組細(xì)胞,以加入Lm為計(jì)時(shí)起點(diǎn)。9 h后向每孔加入10 μL CCK-8試劑,孵育4 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光值。

1.8 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) Caco-2細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中,按照1.6操作處理各組細(xì)胞,以加入Lm為計(jì)時(shí)起點(diǎn),收集9 h細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白并測(cè)定蛋白濃度。以每孔80 μg蛋白上樣,100 V恒壓電泳至蛋白完全分離后,以350 mA恒流冰浴轉(zhuǎn)膜90 min;5%脫脂奶粉封閉1 h,TBST洗膜3次(10 min/次);加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次(10 min/次);再加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗,搖床室溫孵育1 h,TBST洗膜3次(10 min/次)后ECL顯色檢測(cè)蛋白表達(dá)情況,并用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 Lm感染促進(jìn)Caco-2細(xì)胞表達(dá)PKD 為確定Lm感染對(duì)Caco-2細(xì)胞PKD表達(dá)的影響以及建立Lm感染Caco-2細(xì)胞模型,我們用qRT-PCR法檢測(cè)不同MOI(1,10,100)的Lm感染細(xì)胞3 h、6 h、9 h和12 h時(shí)細(xì)胞表達(dá)PKD的變化。當(dāng)Lm感染Caco-2細(xì)胞9 h,MOI=10和100時(shí)PKD1、PKD2和PKD3 的mRNA表達(dá)水平均顯著增高,其中MOI=10時(shí)PKD1的mRNA水平最高、MOI=100時(shí)PKD2和PKD3的mRNA水平最高(FPKD1=15.33,FPKD2=52.79,FPKD3=23.23,均P<0.05)(圖1A)。當(dāng)MOI=100,Lm感染Caco-2細(xì)胞9 h和12 h時(shí)PKD1、PKD2和PKD3的mRNA表達(dá)水平均顯著增高,其中PKD1和PKD2的mRNA水平在12 h最高,PKD3的mRNA水平在9 h最高(FPKD1=21.85,FPKD2=179.0,FPKD3=69.52,均P<0.05)(圖1B)。結(jié)果表明,Lm感染促進(jìn)Caco-2細(xì)胞表達(dá)PKD。綜合以上結(jié)果,以MOI=100、感染時(shí)間9 h建立Lm感染Caco-2細(xì)胞模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注:A為不同MOI(1,10,100)Lm感染Caco-2細(xì)胞9 h;B為MOI=100 Lm感染細(xì)胞3 h、6 h、9 h、12 h。①P<0.05,②P<0.01,③P<0.001,ns無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖1 Lm感染Caco-2細(xì)胞PKD mRNA表達(dá)水平Fig.1 PKD mRNA level in Caco-2 cells infected with Listeria monocytogenes

2.2 抑制PKD降低Lm感染的Caco-2細(xì)胞存活率 為進(jìn)一步探索PKD在Lm感染Caco-2細(xì)胞中的作用,我們采用CCK-8法測(cè)定PKD抑制劑CID755673對(duì)Lm感染Caco-2細(xì)胞存活率的影響。與Lm組相比,細(xì)胞存活率隨CID755673濃度升高而降低(F=4.831,P<0.05)(圖2)。結(jié)果表明,Lm感染Caco-2細(xì)胞時(shí),PKD是細(xì)胞存活的重要調(diào)節(jié)蛋白,抑制PKD可降低細(xì)胞存活率。選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)的CID755673濃度為10 μmol/L。

注:①P<0.05。圖2 PKD抑制對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of PKD inhibition on cell viability

2.3 抑制PKD導(dǎo)致Lm感染的Caco-2細(xì)胞炎癥蛋白表達(dá)減少 已有研究結(jié)果表明Lm感染能快速激活細(xì)胞炎癥通路[13-14],但此過(guò)程中PKD是否發(fā)揮作用尚不清楚。我們采用Western blot法檢測(cè)PKD對(duì)Lm感染Caco-2細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。與NC組相比,Lm組細(xì)胞NLRP3和p-IκBα蛋白表達(dá)增加。與Lm組相比,Lm+CID755673組細(xì)胞NLRP3和p-IκBα蛋白表達(dá)顯著減少(FNLRP3=35.02,Fp-IκBα=45.19,均P<0.01;FIκBα=4.124,P>0.05)(圖3)。結(jié)果表明,Lm感染Caco-2細(xì)胞時(shí),PKD是調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥的重要因子,抑制PKD可減少細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)。

注:②P<0.01,③P<0.001。圖3 PKD抑制對(duì)細(xì)胞炎癥蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of PKD inhibition on inflammatory protein expression

2.4 抑制PKD可抑制Lm感染的Caco-2細(xì)胞ERK1/2信號(hào)通路 以上結(jié)果(圖2和圖3)表明,Lm感染Caco-2細(xì)胞時(shí),PKD可調(diào)節(jié)細(xì)胞存活率和炎癥,但具體機(jī)制尚不清楚。我們采用Western blot法檢測(cè)PKD對(duì)Lm感染Caco-2細(xì)胞ERK1/2信號(hào)通路的影響。與NC組相比,Lm組細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)增加。與Lm組相比,Lm+CID755673組細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著降低(F=326.9,P<0.001)(圖4)。結(jié)果表明,Lm感染時(shí),PKD是ERK1/2信號(hào)通路上游的重要調(diào)節(jié)蛋白,Lm感染激活的ERK1/2信號(hào)通路可被PKD抑制劑CID755673抑制。

3 討 論

Lm是一種食源性病原體,攝入含有帶菌的食品并通過(guò)胃腸道進(jìn)入宿主是李斯特菌病暴發(fā)的原因[15]。真核細(xì)胞限制細(xì)菌感染可能是通過(guò)細(xì)胞自主防御、營(yíng)養(yǎng)免疫和先天免疫反應(yīng)(包括誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡)的共同作用[16-17]。破壞宿主腸道屏障是Lm致病的關(guān)鍵機(jī)制[18]。Lm穿過(guò)腸道上皮屏障的主要途徑有3條:李斯特菌粘附蛋白(listeria adhesion protein,LAP)介導(dǎo)的Lm易位、內(nèi)化素A(internalin A,InlA)與E-鈣粘蛋白(E-cadherin)結(jié)合介導(dǎo)的Lm轉(zhuǎn)胞吞作用、M細(xì)胞(microfold cell)介導(dǎo)的Lm易位[11]。在Lm感染的早期(幾個(gè)小時(shí)內(nèi)),LAP介導(dǎo)途徑發(fā)揮主要作用,協(xié)調(diào)復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)事件,激活調(diào)節(jié)分子NF-κB和肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK),打開(kāi)上皮細(xì)胞間的連接,促進(jìn)細(xì)菌易位[19]。與此同時(shí),緊密連接的開(kāi)放,增加E-cadherin的暴露,促進(jìn)InlA進(jìn)入E-cadherin及其易位。還有研究表明,在上皮細(xì)胞擠出、杯狀細(xì)胞胞吐作用和細(xì)胞凋亡過(guò)程中,E-cadherin短暫地暴露于多細(xì)胞連接處的管腔表面,此時(shí)Lm利用連接重塑粘附并侵入上皮[10]。由此可見(jiàn),在Lm的腸道感染階段,炎癥通路及細(xì)胞連接屏障的完整性對(duì)Lm的感染進(jìn)程起重要作用。

PKD蛋白是炎癥過(guò)程中的主要參與者,與許多疾病的發(fā)展緊密相關(guān)。PKD可以調(diào)節(jié)NF-κB、HSP27和COX-2的活性,腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生都需要PKD參與[9]。在一些感染性疾病中,病原體可誘導(dǎo)PKD的激活,并且PKD的激活對(duì)于病原菌介導(dǎo)的NF-κB的激活以及促炎介質(zhì)的表達(dá)是必不可少的[20-21]。趨化因子和促炎介質(zhì)的成熟和釋放,是機(jī)體抵抗病原體感染的重要環(huán)節(jié),因此PKD在機(jī)體抗感染中發(fā)揮重要作用。PKD是正常細(xì)胞中細(xì)胞周期G2-M和有絲分裂期的新型細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子,能通過(guò)NF-κB,ERK1/2,Akt和熱休克蛋白90(HSP90)等信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活[9]。Wei N等報(bào)道了結(jié)腸癌細(xì)胞系中藥理學(xué)抑制PKD或轉(zhuǎn)染PKD2靶向siRNA能夠抑制NF-κB活性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。Xiong J等發(fā)現(xiàn)PKD2活性缺乏導(dǎo)致ZO-1和MUC2蛋白水平顯著下降,緊密連接蛋白的缺陷可能導(dǎo)致上皮屏障功能障礙[23]。據(jù)此,PKD可能是維持上皮屏障功能的重要調(diào)節(jié)蛋白,本研究也獲得同樣的結(jié)果。

越來(lái)越多的研究表明,ERK1/2信號(hào)通路在激活炎癥反應(yīng)[24]和細(xì)胞抗凋亡[25]中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示,Lm感染Caco-2細(xì)胞時(shí),抑制PKD會(huì)抑制ERK1/2信號(hào)通路,降低細(xì)胞存活率,減少細(xì)胞炎癥,這些可能會(huì)促進(jìn)Lm感染進(jìn)程。

綜上所述,PKD在Lm感染Caco-2細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Lm感染促進(jìn)Caco-2細(xì)胞表達(dá)PKD,Lm感染的Caco-2細(xì)胞通過(guò)PKD-ERK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞存活率和炎癥,從而調(diào)控Lm感染。由于CID755673對(duì)3種PKD亞型均有抑制效果,后續(xù)需進(jìn)一步研究PKD1、PKD2和PKD3在Lm穿越腸道屏障中的作用及其機(jī)制。

利益沖突：無(wú)