液體發(fā)酵樺褐孔菌胞內(nèi)多糖提取及抗氧化活性測(cè)定

金東箭 金朝霞

摘要：樺褐孔菌（Inonotus obliquus）多糖因具有良好的功能性調(diào)味特性，引起了食品行業(yè)的廣泛關(guān)注。然而，目前對(duì)液體純化培養(yǎng)樺褐孔菌胞內(nèi)多糖的研究較少，缺乏系統(tǒng)的提取工藝優(yōu)化和性質(zhì)分析。該研究旨在比較熱水浸提法和超聲波輔助提取法對(duì)樺褐孔菌胞內(nèi)多糖的提取效果，并利用Design Expert 13.0軟件構(gòu)建超聲波提取以及熱水浸提樺褐孔菌胞內(nèi)多糖的響應(yīng)面模型。結(jié)果表明，超聲波輔助提取法優(yōu)于熱水浸提法，其最佳提取工藝條件為超聲功率508.25 W、料液比1∶19.38、超聲時(shí)間18.40 min。在此條件下，樺褐孔菌胞內(nèi)多糖的最佳理論預(yù)測(cè)值為43.81 mg/g。此外，該研究還探討了超聲波輔助提取法得到的樺褐孔菌胞內(nèi)多糖的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)DPPH自由基和羥基自由基（·OH）均有較強(qiáng)的清除能力，其IC50值分別為1.70，1.98 mg/mL。該研究為樺褐孔菌胞內(nèi)多糖的工業(yè)化生產(chǎn)以及其在食品風(fēng)味物質(zhì)的開發(fā)利用中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：樺褐孔菌；胞內(nèi)多糖；超聲波輔助提??；Design Expert 13.0；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：TS201.3????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2023）12-0044-09

Extraction and Antioxidant Activity Determination of Intracellular Polysaccharides

from Inonotus obliquus by Liquid Fermentation

JIN Dong-jian， JIN Zhao-xia*

（College of Biological Engineering， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， China）

Abstract： Inonotus obliquus polysaccharides have attracted widespread attention in the food industry due to their excellent functional seasoning properties. However， there is limited research on intracellular polysaccharides from Inonotus obliquus in liquid purification culture currently， and there is a lack of systematic extraction process optimization and property analysis. The aim of this study is to compare the extraction effects of hot water extraction method and ultrasonic-assisted extraction method on the intracellular polysaccharides from Inonotus obliquus， and to construct response surface models of ultrasonic extraction and hot water extraction of intracellular polysaccharides from Inonotus obliquus by Design Expert 13.0 software. The results show that ultrasonic-assisted extraction method is superior to hot water extraction method.The optimal extraction process conditions are ultrasonic power of 508.25 W， solid-liquid ratio of 1∶19.38 and ultrasonic time of 18.40 min. Under these conditions， the best theoretical predictive value of intracellular polysaccharides from Inonotus obliquus is 43.81 mg/g. In addition， the antioxidant activity of? intracellular polysaccharides from Inonotus obliquus obtained by ultrasonic-assisted extraction method is also investigated. It is found that the polysaccharides have strong scavenging capacity on DPPH free radicals and hydroxyl free radicals （·OH）， with IC50 values of 1.70， 1.98 mg/mL respectively. This study has provided a basis for the industrial production of intracellular polysaccharides from Inonotus obliquus and their application in the development and utilization of food flavor substances.

Key words： Inonotus obliquus; intracellular polysaccharides; ultrasonic-assisted extraction; Design Expert 13.0； antioxidant activity

樺褐孔菌，又名白樺茸、樺樹菇或西伯利亞靈芝，是一種生長(zhǎng)在北緯40°～50°溫帶地區(qū)的食用和藥用真菌。它含有豐富的多糖和三萜類物質(zhì)，具有多種功效。在食用方面，它不僅可以作為功能性調(diào)味品為食品提供獨(dú)特的風(fēng)味，而且能夠發(fā)揮保健作用[1]。段勝利等[2] 以樺褐孔菌多糖為原料，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化加工工藝得到最佳條件，制得抗氧化活性良好、口感適中的樺褐孔菌多糖復(fù)合運(yùn)動(dòng)飲品。李亞楠等[3] 以樺褐孔菌提取物為原料，通過單因素試驗(yàn)和多因素試驗(yàn)優(yōu)化制成了復(fù)合飲料，該飲料呈焦糖色，無沉淀，具有特有風(fēng)味和清淡的茉莉花香味，具有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景。另外，樺褐孔菌多糖可以在作為調(diào)味品的同時(shí)改善食品本身的缺陷。楊晨芝等[4]利用樺褐孔菌多糖促進(jìn)了乳酸菌的發(fā)酵，使酸奶的穩(wěn)定性及保質(zhì)期得到進(jìn)一步的提高。但由于野生資源有限且難以采集，人工栽培技術(shù)得到了快速發(fā)展。相比于固體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)技術(shù)更節(jié)省時(shí)間和資源[5]。

真菌多糖的研究和開發(fā)正處于快速發(fā)展階段，提取方法也日益多樣，各有利弊。當(dāng)前，對(duì)多糖的提取方法可以概括為三類：傳統(tǒng)法[6-10]、酶法[11]和物理法[12-13]。傳統(tǒng)法操作簡(jiǎn)單，條件容易達(dá)到，但耗時(shí)較長(zhǎng)。酶法是利用酶除去細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞內(nèi)容物，不會(huì)破壞內(nèi)部物質(zhì)，副產(chǎn)物少，環(huán)境友好，能耗低，操作要求低[14-15]，但這種方法的成本較高。而物理法是利用超聲波、微波等物理因素輔助提取，通過空化效應(yīng)和高頻交流電場(chǎng)使細(xì)胞壁破裂，釋放內(nèi)容物。相較于前兩者其提取效率高，操作簡(jiǎn)單，能耗低，耗時(shí)短。還有一些物理方法的組合，如高壓脈沖電場(chǎng)和超聲波微波結(jié)合提取法等，這類方法對(duì)儀器和成本的要求較高[16-21]。然而，目前對(duì)熱水浸提法和超聲波輔助提取法進(jìn)行比較的報(bào)道較少，本研究旨在探討這兩種方法對(duì)樺褐孔菌多糖提取率和活性的影響，為樺褐孔菌多糖的開發(fā)利用提供了參考。

隨著多糖在生物活性方面的重要作用逐漸被揭示，開發(fā)多糖的檢測(cè)方法成為新的研究方向。近30年來，DNS法、蒽酮-硫酸法一直是多糖的主要檢測(cè)方法，然而該方法存在檢測(cè)靈敏度低、結(jié)果易受蛋白質(zhì)干擾、操作步驟繁瑣等問題。因此，人們更傾向于發(fā)展新型的多糖檢測(cè)方法。近10年來，研究者開發(fā)了苯酚-硫酸法，其原理是利用多糖經(jīng)濃硫酸水解后生成的單糖與苯酚反應(yīng)產(chǎn)生有色化合物，其顏色深度與多糖含量呈正比。該方法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、靈敏度高等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于多糖的檢測(cè)中。

本研究采用熱水浸提法和超聲波輔助法提取樺褐孔菌多糖，利用苯酚-硫酸法對(duì)提取的多糖進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行比較。通過單因素試驗(yàn)，選取各方法的3個(gè)影響因素和水平，建立響應(yīng)面模型優(yōu)化提取條件。然后用Sevage法去除蛋白質(zhì)，用G-100柱層析法純化多糖，得到單一分子量的多糖樣品。最后測(cè)定樣品的體外抗氧化活性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

樺褐孔菌菌種：由大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院提供。

1.1.2 儀器

超聲波破碎機(jī)、pH計(jì)、96孔板、酶標(biāo)儀。

1.1.3 藥品

PDA培養(yǎng)基粉、MgSO4·7H2O、DPPH-乙醇試劑（15 mg/500 mL）、FeSO4·7H2O、水楊酸、30%過氧化氫等：均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樺褐孔菌菌絲體富集

液體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基粉26 g/L，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g。

液體擴(kuò)大培養(yǎng)條件：在真菌超凈臺(tái)中，用牙簽將馬鈴薯浸漬在培養(yǎng)基中，將含有菌絲體部分切塊（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm），并集中于裝有100 mL馬鈴薯浸漬液培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶置于26 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，過濾菌絲體并用蒸餾水反復(fù)清洗得到樺褐孔菌菌絲體。

菌絲體收集：用蒸餾水將菌絲體清洗后，用純凈水洗凈，分裝并于65 ℃干燥備用，稱重，分裝至離心管中，并依據(jù)具體試驗(yàn)條件加入一定體積純凈水。

1.2.2 樺褐孔菌胞內(nèi)多糖制備

經(jīng)過以下步驟：清洗并在恒溫65 ℃條件下烘干菌絲體→加入定量體積的超純水（按試驗(yàn)所需料液比）→超聲波輔助提取→5 000 r/min離心→保留上清液→95%乙醇沉淀→5 000 r/min離心→無水乙醇洗滌→65 ℃烘箱干燥→復(fù)溶→離心→65 ℃烘箱干燥，最終得到樺褐孔菌胞內(nèi)多糖。

精密稱取樺褐孔菌菌絲體樣品1 g，并加入定量純水，根據(jù)單因素試驗(yàn)條件需求設(shè)定超聲功率和時(shí)間，超聲波協(xié)同提取。將提取混合液靜置1 h，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心15 min，取上清液，將上清液蒸發(fā)濃縮至10 mL，加入無水乙醇溶液40 mL，形成95%濃度的乙醇沉淀體系，于4 ℃下靜置過夜，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心15 min，保留沉淀，用無水乙醇洗滌3次并烘干。最終將沉淀全部溶解離心，保留上清液，65 ℃恒溫烘干，即為樺褐孔菌粗多糖。

1.2.3 多糖測(cè)定

苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1.00 g，用超純水定容至100 mL容量瓶中，再取1 mL，再次定容至100 mL，配成 0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精密移取0，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，12.00，14.00，16.00，18.00，20.00 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于反應(yīng)管（離心管）中，每管各加25 μL 6%苯酚溶液，再加入超純水，使葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與超純水體積總和為50 μL。振蕩均勻，最終加入濃硫酸125 μL，振蕩5 min搖勻，靜置反應(yīng)30 min。以試劑空白作為空白對(duì)照體系，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)485 nm 處測(cè)定96孔板中反應(yīng)體系的吸光度，橫、縱坐標(biāo)分別為吸光值和多糖濃度，繪制成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)定樺褐孔菌胞內(nèi)多糖：將提取后的多糖溶于一定量蒸餾水中，每個(gè)樣品取出10 μL并加入蒸餾水配成50 μL體系，采用上述測(cè)定方法制成200 μL反應(yīng)液體系加至96孔板。

通過下式得出多糖得率：

Y=C×Vm。

式中：Y為多糖得率，mg/g；C為樣品所含多糖濃度，mg/mL；V為樣品的體積，mL；m為經(jīng)過烘干處理的樺褐孔菌菌絲體質(zhì)量，g。

1.2.4 超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 超聲功率對(duì)樺褐孔菌胞內(nèi)多糖提取率的影響

按每份1 g稱取樺褐孔菌菌絲體5份，分別放入離心管中，固定超聲時(shí)間為20 min、料液比為1∶20，測(cè)定不同超聲功率 450，500，550，600 W條件下樺褐孔菌胞內(nèi)多糖得率，每個(gè)條件做3次重復(fù)試驗(yàn)以平衡誤差。

1.2.4.2 超聲時(shí)間對(duì)樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響

同上取5份菌絲體，分別放入離心管中并編號(hào)，固定超聲功率為500 W、料液比為1∶20，測(cè)定不同超聲時(shí)間 10，15，20，25，30 min條件下樺褐孔菌胞內(nèi)多糖得率，每個(gè)條件做3次重復(fù)試驗(yàn)以平衡誤差。

1.2.4.3 料液比對(duì)樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響

同上取5份菌絲體，分別放入50 mL離心管中并編號(hào)，固定超聲功率為500 W、超聲時(shí)間為20 min，測(cè)定不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30條件下樺褐孔菌胞內(nèi)多糖得率，每個(gè)條件做3次重復(fù)試驗(yàn)以平衡誤差。

1.2.5 提取參數(shù)三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在最高提取率對(duì)應(yīng)的自變量周圍各選取兩個(gè)自變量參數(shù)作為三因素范圍。以樺褐孔菌胞內(nèi)多糖的得率為響應(yīng)值（Y），以影響因素超聲功率、料液比、超聲時(shí)間為自變量，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)樺褐孔菌胞內(nèi)多糖的提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平表見表1。

1.2.6 熱水浸提法提取單因素試驗(yàn)

1.2.6.1 提取溫度對(duì)樺褐孔菌胞內(nèi)多糖提取率的影響

按每份1 g稱取樺褐孔菌菌絲體5份，分別放入離心管中，固定提取時(shí)間為3.0 h、料液比為1∶30，測(cè)定不同提取溫度 70，75，80，85，90 ℃條件下樺褐孔菌胞內(nèi)多糖得率，每個(gè)條件做3次重復(fù)試驗(yàn)以平衡誤差。

1.2.6.2 提取時(shí)間對(duì)樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響

同上取5份菌絲體，分別放入離心管中并編號(hào)，固定料液比為1∶30、提取溫度為80 ℃，測(cè)定不同提取時(shí)間2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h條件下樺褐孔菌胞內(nèi)多糖提取率，每個(gè)條件做3次重復(fù)試驗(yàn)以平衡誤差。

1.2.6.3 料液比對(duì)樺褐孔菌菌絲體多糖得率的影響

同上取5份菌絲體，分別放入50 mL離心管中并編號(hào)，固定提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間為3.0 h，測(cè)定不同料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40條件下樺褐孔菌胞內(nèi)多糖提取率，每個(gè)條件做3次重復(fù)試驗(yàn)以平衡誤差。

1.2.7 提取參數(shù)三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在最高提取率對(duì)應(yīng)的自變量周圍各選取兩個(gè)自變量參數(shù)作為三因素范圍。以樺褐孔菌胞內(nèi)多糖的得率為響應(yīng)值（Y），以影響因素提取溫度、提取時(shí)間、料液比為自變量，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)樺褐孔菌胞內(nèi)多糖的提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平表見表2。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

使用Excel 2020對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)整理，使用Design Expert 13.0軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析并以響應(yīng)面圖為結(jié)果顯示，使用Origin 8.0繪制折線圖。

1.4 樺褐孔菌胞內(nèi)多糖體外抗氧化活性測(cè)定

測(cè)定抗氧化活性，需要將所提取的多糖進(jìn)行復(fù)融，利用Sevage方法，按照氯仿與正丁醇的比例為5∶1及混合液與多糖溶液的比例為1∶5進(jìn)行混合，振蕩搖勻20 min，離心取上清液進(jìn)行蛋白脫除，脫除次數(shù)為3次。

1.4.1 胞內(nèi)多糖體外清除DPPH自由基

DPPH-乙醇溶液是一種深紫色的工作液，用于測(cè)定抗氧化活性時(shí)在517 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。參考羅游[22]的方法，將15 mg/500 mL DPPH-乙醇溶液用甲醇配制成0.06 mmol/L DPPH溶液，將乙醇沉淀與65 ℃烘干的樺褐孔菌胞內(nèi)多糖配制成10 mg/mL的水溶液并配制梯度濃度。多糖溶液與DPPH測(cè)定液按1∶2混合、搖勻，并在室溫下暗室反應(yīng)30 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，以抗壞血酸作為抗氧化活性對(duì)照，不添加多糖溶液的DPPH-乙醇工作液作為陽性對(duì)照，以甲醇作為空白對(duì)照，每組測(cè)試取3組平行試驗(yàn)的平均值。

1.4.2 胞內(nèi)多糖體外清除羥基自由基（·OH）

過氧化氫與二價(jià)鐵離子反應(yīng)生成羥基自由基，該自由基與水楊酸反應(yīng)生成2，3-二羥基苯甲酸，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收峰，可用來測(cè)定抗氧化活性[23]。多糖溶液濃度同上，設(shè)置梯度濃度，F(xiàn)eSO4、水楊酸、過氧化氫以及樣品溶液以1∶1∶1∶1進(jìn)行添加，F(xiàn)eSO4及水楊酸濃度均為6 mmol/L，過氧化氫配制成濃度為0.3%。以抗壞血酸作為抗氧化活性對(duì)照，以不添加過氧化氫的去離子水作為空白對(duì)照，不添加樣品并以等體積去離子水替代樣品作為陽性對(duì)照，每組測(cè)試取3組平行試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果分析

2.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，以吸光值為橫坐標(biāo)（x），葡萄糖濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)（y），擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=0.130 98x－0.013 06（R2=0.987 7），其線性關(guān)系良好，可以進(jìn)行后續(xù)多糖的測(cè)定。

2.2 超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)分析

2.2.1 超聲功率對(duì)胞內(nèi)多糖提取的影響

超聲功率對(duì)多糖得率的影響見圖2。

由圖2可知，超聲功率對(duì)胞內(nèi)多糖得率有顯著影響。當(dāng)超聲功率在450～500 W之間時(shí)，多糖得率明顯提升；當(dāng)超聲功率在500～600 W之間時(shí)，多糖得率大幅降低。當(dāng)超聲功率為500 W時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，為（45.3±3.0） mg/g。推測(cè)原因是超聲功率在550～600 W時(shí)，功率過高，導(dǎo)致樺褐孔菌多糖受到強(qiáng)烈的空化效應(yīng)，發(fā)生斷裂或部分降解，得率下降[24]。因此，在后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)中，選擇450，500，550 W作為胞內(nèi)多糖提取的3個(gè)水平。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)胞內(nèi)多糖提取的影響

超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響見圖3。

由圖3可知，當(dāng)超聲時(shí)間從10 min增加到20 min時(shí)，多糖得率隨之上升，這是因?yàn)槌暡ㄍㄟ^水的空化效應(yīng)能夠有效地破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物。在20 min時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，為（44.5±1.5） mg/g。然而，當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)增加到30 min時(shí)，多糖得率反而降低，可能是超聲時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致多糖降解、穩(wěn)定性下降[25]。

2.2.3 料液比對(duì)胞內(nèi)多糖提取的影響

料液比對(duì)多糖得率的影響見圖4。

由圖4可知，當(dāng)料液比從1∶10增加到1∶20時(shí)，多糖得率逐漸上升，達(dá)到最大值（43.9±3.0） mg/g。這是因?yàn)榱弦罕仍龃笥欣诔暡ㄔ谒挟a(chǎn)生空化效應(yīng)，增強(qiáng)了水分子對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的碰撞作用，促進(jìn)了多糖的釋放。然而，當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，多糖得率反而降低，可能是由于超聲波在水中的空化效應(yīng)變?nèi)?，?xì)胞破碎程度降低，導(dǎo)致多糖的釋放減少。因此，確定料液比1∶20為最佳工藝參數(shù)，并選擇1∶15、1∶20、1∶25作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個(gè)水平。

2.3 Box-Behnken結(jié)果分析

2.3.1 Box-Behnken結(jié)果

基準(zhǔn)條件：料液比為1∶20，超聲時(shí)間為20 min，超聲功率為500 W，以超聲功率（A）、料液比（B）、超聲時(shí)間（C）為自變量，采用 Box-Behnken 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表3。

2.3.2 回歸模型分析

注： “***”表示差異極顯著（P＜0.001），“**”表示差異較顯著（P＜0.01），“*”表示差異顯著（P＜0.05），表6同。

由表4可知，該回歸模型極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該模型的R2=0.980 9，表明該模型是可信的。A、C、A2、B2、C2是重要的模型項(xiàng)，表明超聲功率、超聲時(shí)間及料液比對(duì)多糖的得率具有重要影響。RAdj2為0.956 2，表明數(shù)據(jù)模型與實(shí)際情況吻合度較高，該模型可以解釋95.62%響應(yīng)值的變化[26]；模型的信噪比S/N為16.885 5（>4），說明信號(hào)充足，該模型用于分析提取工藝的參數(shù)是可信的；純誤差的P=0.461 4，遠(yuǎn)大于0.05，因此外界對(duì)該模型造成的誤差很小，對(duì)模型的影響可以忽略 [27]。該模型通過擬合得到二次多項(xiàng)式回歸方程：Y=43.24+2.09A－0.776 3B－2.25C－1.25AB－0.542 5AC+0.615 8BC－7.34A2－4.54B2－3.80C2，各因素與響應(yīng)值之間是非線性關(guān)系。各因素存在交互關(guān)系，各因素影響順序?yàn)槌晻r(shí)間>超聲功率>料液比。

2.3.3 交互作用等高線圖及三維響應(yīng)面圖

由圖5可知，3個(gè)因素的交互作用均比較顯著[22]。由圖 5中a～b可知，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，超聲功率與料液比的交互作用對(duì)多糖得率的影響顯著，其中超聲功率的影響更顯著；由圖5中c～d可知，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，多糖得率受超聲功率及超聲時(shí)間的交互作用影響顯著，通過橢圓形等高線可看出超聲功率比超聲時(shí)間的影響顯著；由圖5中e～f可知，當(dāng)超聲功率為500 W時(shí)，料液比與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)多糖得率的影響顯著，其中料液比對(duì)多糖得率的影響更顯著。

2.4 熱水浸提單因素試驗(yàn)分析

2.4.1 提取溫度對(duì)胞內(nèi)多糖提取的影響

由圖6可知，提取溫度對(duì)胞內(nèi)多糖得率有顯著影響。當(dāng)提取溫度在70～80 ℃之間時(shí)，多糖得率明顯提升，這是因?yàn)楦邷赜欣谒苄远嗵菑募?xì)胞膜進(jìn)入提取液的傳質(zhì)過程。當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，為（36.6±1.6） mg/g。然而，當(dāng)提取溫度在80～90 ℃之間時(shí)，多糖得率大幅降低，可能是過高的溫度導(dǎo)致多糖降解和穩(wěn)定性下降。因此，在后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)中，選擇75，80，85 ℃作為提取溫度的3個(gè)水平，其中以80 ℃作為中心點(diǎn)。

2.4.2 提取時(shí)間對(duì)胞內(nèi)多糖提取的影響

由圖7可知，當(dāng)提取時(shí)間從2.0 h增加到3.0 h時(shí)，多糖得率隨之增加，這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)容物的擴(kuò)散效率增高，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁被充分破碎和釋放。在3.0 h時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值，為（37.3±1.9） mg/g。然而，當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加到4.0 h時(shí)，多糖提取率反而降低，可能是過長(zhǎng)的時(shí)間導(dǎo)致多糖的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或降解。

2.4.3 料液比對(duì)胞內(nèi)多糖提取的影響

由圖8可知，多糖得率在料液比從1∶10增加到1∶30的過程中逐漸增加，在1∶30時(shí)達(dá)到最大值（35.2±0.9） mg/g。這是因?yàn)槎嗵窃诹弦罕仍龃髸r(shí)更容易從細(xì)胞擴(kuò)散到提取液中。然而，當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，多糖得率反而降低，可能是由于料液比過大，多糖在胞內(nèi)逐步擴(kuò)散的過程中濃度差下降過快，導(dǎo)致擴(kuò)散率大幅度降低，多糖得率下降。因此，選擇1∶20、1∶30、1∶40作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中料液比的3個(gè)水平，其中1∶30為最佳工藝參數(shù)。

2.5 Box-Behnken結(jié)果分析

2.5.1 Box-Behnken結(jié)果

基準(zhǔn)條件：料液比為1∶30，提取時(shí)間為3.0 h，提取溫度為80 ℃，以提取溫度（D）、提取時(shí)間（E）、料液比（F）為自變量，采用Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表5。

2.5.2 回歸模型分析

由表6可知，該回歸模型極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該模型的R2=0.984 6，表明該模型是可信的。在此情況下，D、F、D2、E2、F2是重要的模型項(xiàng)，表明提取溫度、提取時(shí)間及料液比對(duì)多糖得率具有重要影響。RAdj2為0.964 9，表明數(shù)據(jù)模型與實(shí)際情況吻合度較高，該模型可以用來解釋96.49%響應(yīng)值的變化[27]；模型的信噪比S/N為17.328 1（>4），說明信號(hào)充足，該模型用于分析提取工藝的參數(shù)是可信的；純誤差的P=0.566 9，遠(yuǎn)大于0.05，因此外界對(duì)該模型造成的誤差很小，對(duì)模型的影響可以忽略。該模型通過擬合得到二次多項(xiàng)式回歸方程：Y=37.86+1.87D+1.03E+1.70F+1.06DE+0.542 5DF+1.85EF－6.70D2－5.06E2－4.15F2。各因素與響應(yīng)值之間是非線性關(guān)系。各因素存在交互關(guān)系，各因素影響順序?yàn)樘崛囟?料液比>提取時(shí)間。

2.5.3 交互作用等高線圖及三維響應(yīng)面圖

由圖9可知，3個(gè)因素的交互作用均比較顯著。由圖9中a～b可知，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，提取溫度與提取時(shí)間的交互作用對(duì)多糖得率的影響顯著，其中提取溫度的影響更顯著；由圖9中c～d可知，當(dāng)提取時(shí)間為3.0 h時(shí)，提取溫度與料液比的交互作用對(duì)多糖得率的影響顯著，通過橢圓形等高線可看出提取溫度的影響更顯著；由圖9中e～f可知，當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，料液比和提取時(shí)間的交互作用對(duì)多糖得率的影響顯著，其中提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響更顯著。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整最佳提取工藝。超聲波輔助提取模型預(yù)測(cè)結(jié)果為超聲功率508.25 W、料液比1∶19.38、超聲時(shí)間18.40 min， 多糖得率最佳值為43.81 mg/g。實(shí)際操作時(shí)調(diào)整為超聲功率500 W、料液比1∶19、超聲時(shí)間19 min，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，得到多糖得率3次試驗(yàn)的平均值為42.98 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本一致；熱水浸提法模型預(yù)測(cè)結(jié)果為提取溫度80.81 ℃、提取時(shí)間3.08 h、料液比1∶24.63，多糖得率最佳值為38.31 mg/g。實(shí)際操作時(shí)調(diào)整為提取溫度81 ℃、提取時(shí)間3.1 h、料液比1∶25，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，得到多糖得率3次試驗(yàn)的平均值為38.56 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本一致。

2.7 多糖體外抗氧化活性結(jié)果（DPPH自由基）

多糖濃度對(duì)樺褐孔菌胞內(nèi)多糖清除DPPH自由基能力的影響見圖10。

由圖10可知，多糖濃度越高，DPPH自由基清除率越高，表明清除能力與劑量呈正相關(guān)。在本試驗(yàn)中，多糖最大濃度為2.0 mg/mL，此時(shí)DPPH自由基清除率為58.6%，雖然低于同等濃度的抗壞血酸（VC），但也表明樺褐孔菌胞內(nèi)多糖具有一定的抗氧化活性。經(jīng)過計(jì)算，VC和多糖的IC50值分別為0.149 99，1.701 4 mg/mL。

2.8 多糖體外抗氧化活性結(jié)果（羥基自由基）

多糖濃度對(duì)樺褐孔菌胞內(nèi)多糖清除羥基自由基能力的影響見圖11。

羥基自由基（·OH）是一種非?；顫姷淖杂苫?，具有強(qiáng)氧化能力，可以氧化所有有機(jī)物。由圖11可知，VC和樺褐孔菌多糖都能清除羥基自由基，且清除能力隨著多糖濃度的增加而增加，表明清除能力與劑量呈正相關(guān)。在本試驗(yàn)中，多糖最大濃度為2.0 mg/mL時(shí)，VC和樺褐孔菌多糖的羥基自由基清除率分別為95.6%和51.36%。VC的清除率明顯高于樺褐孔菌多糖，但樺褐孔菌多糖也表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。經(jīng)過計(jì)算，VC和樺褐孔菌多糖的IC50值分別為0.195 94，1.98 mg/mL。

3 結(jié)論

本文采用超聲波提取法和熱水浸提法，對(duì)樺褐孔菌胞內(nèi)多糖的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化和比較，并評(píng)價(jià)了其體外抗氧化活性，主要結(jié)論如下：

超聲波輔助提取法的最佳條件為超聲功率508.25 W、超聲時(shí)間18.40 min、料液比1∶19.38，在此條件下多糖得率為43.81 mg/g；熱水浸提法的最佳條件為提取溫度 80.81 ℃、提取時(shí)間3.08 h、料液比1∶24.63，在此條件下多糖得率為38.31 mg/g。兩種方法相比，超聲波輔助提取法具有更高的多糖得率和更短的提取時(shí)間。

超聲波輔助提取的樺褐孔菌胞內(nèi)多糖具有一定的體外抗氧化活性，但與胞外多糖和子實(shí)體多糖相比，其活性較低。這可能與提取工藝對(duì)多糖結(jié)構(gòu)及抗氧化活性相關(guān)官能團(tuán)的影響或與樺褐孔菌胞內(nèi)多糖本身抗氧化活性偏低有關(guān)。

本文提供了樺褐孔菌多糖作為食品調(diào)味成分的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，這些研究將有助于提升工業(yè)化生產(chǎn)樺褐孔菌多糖產(chǎn)量以及開發(fā)出具有更好風(fēng)味、更高營(yíng)養(yǎng)和健康價(jià)值的樺褐孔菌多糖調(diào)味劑。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉雨婷.液體培養(yǎng)條件對(duì)樺褐孔菌產(chǎn)活性多糖的影響研究[D].長(zhǎng)春：東北師范大學(xué)，2021.

[2]段勝利，竇彥麗.樺褐孔菌多糖復(fù)合運(yùn)動(dòng)飲品的制備及抗氧化活性研究[J].中國(guó)食品添加劑，2023，34（2）：219-226.

[3]李亞楠，朱蘊(yùn)蘭，陳宏偉，等.樺褐孔菌復(fù)合飲料配方優(yōu)化及抗氧化能力評(píng)價(jià)[J].農(nóng)業(yè)工程，2022，12（9）：78-84.

[4]楊晨芝，郝靜，丁霄，等.樺褐孔菌多糖對(duì)乳酸菌發(fā)酵及酸奶品質(zhì)的影響[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2020，48（11）：22-25.

[5]王維靜，朱紅薇，田建霞，等.樺褐孔菌液體發(fā)酵研究進(jìn)展[J].智慧農(nóng)業(yè)導(dǎo)刊，2022，2（14）：28-30.

[6]敖珍，覃發(fā)玠，羅迎春，等.紅托竹蓀菌托多糖中試提取工藝及抗氧化能力[J].中國(guó)調(diào)味品，2022，47（10）：179-183.

[7]陳悅柏.香菇多糖提取工藝的篩選及保健功效的研究現(xiàn)狀分析[J].中國(guó)調(diào)味品，2021，46（8）：189-191.

[8]XUE D N， FARID M M. Pulsed electric field extraction of valuable compounds from white button mushroom （Agaricus bisporus）[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies，2015，29：178-186.

[9]ZHAO H J， LAI Q Q， ZHANG J J， et al. Antioxidant and hypoglycemic effects of acidic-extractable polysaccharides from Cordyceps militaris on type 2 diabetes mice[J].Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2018，2018：1-15.

[10]KHATUA S， ACHARYA K. Antioxidation and immune-stimulatory actions of cold alkali extracted polysaccharide fraction from Macrocybe lobayensis， a wild edible mushroom[J].3 Biotech，2022，12（10）：247.

[11]陳灼娟，周倩，楊志強(qiáng).黑皮雞樅菌多糖提取工藝及抗氧化活性研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2023，48（3）：199-203，215.

[12]何皎，孫曉菲，潘琳，等.微波提取香菇多糖制備微膠囊的抑菌抗氧化活性研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2023，48（2）：71-75.

[13]任昌娟，朱云龍.生姜多糖提取技術(shù)工藝優(yōu)化及效益分析[J].中國(guó)調(diào)味品，2021，46（9）：117-120.

[14]LI Y， ZHU C P， ZHAI X C， et al. Optimization of enzyme assisted extraction of polysaccharides from pomegranate peel by response surface methodology and their antioxidant potential[J].Chinese Herbal Medicines，2018，10（4）：416-423.

[15]KHASKHELI A A， KHASKHELI S G， LIU Y， et al. Optimization of enzyme assisted extraction of polysaccharides from Poria cocos[J].Journal of Medicinal Plants Research，2017，11（17）：331-337.

[16]袁巍，潘宗琴，潘攀，等.真菌菌絲多糖的提取研究進(jìn)展[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，31（6）：576-579.

[17]陳凌華，程祖鋅，楊志堅(jiān)，等．靈芝多糖熱水提取條件的優(yōu)化試驗(yàn)［J］．浙江食用菌，2009，17（4）：21-23．

[18]CHEN X Y， WANG W X， LI X B， et al． Optimization of ultrasound-assisted extraction of Lingzhi polysaccharides using response surface methodology and its inhibitory effect on cervical cancer cells［J］．Carbohydrate Polymers，2010，80（3）：944-948．

[19]阿燕.真菌胞內(nèi)多糖提取方法的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2011，31（5）：82-86.

[20]肖慧.雙孢菇多糖提取和分離純化的研究[D].濟(jì)南：山東輕工業(yè)學(xué)院，2012.

[21]劉超.液體深層發(fā)酵羊肚菌胞內(nèi)多糖提取、結(jié)構(gòu)分析及抗結(jié)腸癌作用研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2017.

[22]羅游.番石榴葉多糖活性分析及分離鑒定與發(fā)酵提升[D].廣州：華南理工大學(xué)，2020.

[23]李偉.肉色香蘑液體發(fā)酵及多糖提取、純化與抗氧化活性研究[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[24]胡濤，解洛香，徐樂，等.超聲波輔助提取樺褐孔菌子實(shí)體中多糖和三萜[J].食品科技，2012，37（2）：213-217.

[25]郭佳.超聲波輔助提取對(duì)枸杞細(xì)胞壁多糖解聚規(guī)律的研究[D].銀川：寧夏大學(xué)，2022.

[26]衛(wèi)萍，游向榮，張雅媛.響應(yīng)面法優(yōu)化火麻蛋白提取工藝研究[J].中國(guó)油脂，2016，41（5）：24-29.

[27]檀琪，阮文輝，楊官娥，等.響應(yīng)面法優(yōu)化樺褐孔菌總?cè)苹亓魈崛」に嘯J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，51（1）：99-104.

收稿日期：2023-06-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（4217711，31670604）

作者簡(jiǎn)介：金東箭（1997－），男，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)活性物質(zhì)。

*通信作者：金朝霞（1972－），女，教授，博士，研究方向：微生物資源與生物催化、生物活性物質(zhì)資源挖掘與利用。