EDTA過氧化氫修復對富含黑色素腫瘤組織染色的效果

劉 丹 劉盛均 陳 楊 柯 琦 王安群 四川省綿陽市中心醫(yī)院病理科 621000

惡性黑色素瘤是病理科日常工作中比較常見的一類腫瘤,需進行免疫組化染色輔助診斷,但部分黑色素瘤中黑色素大量沉積,形成深淺不一的棕黃色、棕褐色或棕黑色的黑色素顆粒,與免疫組化染色常用的DNA顯色劑顏色非常接近,相互干擾,難以區(qū)分,影響判讀。這就需要用一些方法來去除這些干擾,傳統的脫色素方法是用強氧化劑高錳酸鉀/草酸法去除黑色素后再進行免疫組化染色,此方法易造成組織脫片及破壞抗原,不被推薦。目前很多學者推薦免疫組織化學染色完成后,運用不同的復染液將黑色素顆粒顯色為不同程度的綠色,可改善掉片現象及抗原性的丟失,但此方法不適用于含大量黑色素的組織,存在物理遮蔽影響抗原抗體結合,造成假陰性等問題。據病理診斷的需要及染色技術的可操作性,筆者探索在EDTA(pH 9.0)抗原修復液中加入過氧化氫使過氧化氫濃度為0.75%,在修復的同時去除黑色素,此方法簡便快捷經濟,獲得滿意效果,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2021年5例本院已確診的富含黑色素的惡性黑色素瘤存檔蠟塊,其中鼻咽部1例、足根部2例;眼瞼2例,另選取1例HE染色顯示含極少黑色素的惡性黑色素瘤存檔蠟塊作為對照。試劑:抗原修復液(EDTA,pH 9.0)、PBS磷酸鹽緩沖液、一抗HMB45、S-100、MelanA、Ki-67及免疫組化Maxvision試劑盒均購自福州邁新公司;30%過氧化氫購自成都市科隆化學品有限公司。實驗分為對照組和實驗組兩組。對照組不做脫色素處理,實驗組在EDTA(pH 9.0)抗原修復液中加入過氧化氫使過氧化氫濃度為0.75%,修復的同時去除黑色素處理。

1.2 方法 所有標本均用10%中性緩沖福爾馬林固定,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟浸泡后包埋制成蠟塊,選取5例黑色素瘤組織的腫瘤且富含黑色素部分與對照組織一同制成芯片組織,連續(xù)切片10張,編號1～10,厚3μm,多聚賴氨酸包被載玻片撈片,65℃烤片2h,脫蠟至水待用。對照組:取編號為1的切片常規(guī)步驟做HE染色,再取編號為2～5的切片常規(guī)Maxvision法行免疫組織化學染色,2～5號分別標記HMB45、S-100、MelanA、Ki-67。免疫組化染色具體步驟如下:pH 9.0 EDTA高溫修復20min,3%H2O215min,一抗室溫45min,二抗室溫20min,DAB顯色室溫10min,流水沖洗,蘇木素對比染色后脫水透明封片。實驗組:取編號為6～10的切片,放入沸騰的EDTA(pH 9.0)過氧化氫溶液中高溫修復20min,自然冷卻,蒸餾水洗,取出編號為6的切片常規(guī)步驟做HE染色,7～10號切片常規(guī)Maxvision法行免疫組織化學染色,7～10號切片分別標記抗體HMB45、S-100、MelanA、Ki-67室溫45min,二抗室溫20min,DAB顯色室溫10min,流水沖洗,蘇木素對比染色后脫水透明封片。

2 結果

2.1 HE染色 對照組未做脫色素處理組織HE染色,組織中可見大量棕黃色黑色素顆粒,影響診斷(見圖1)。實驗組H2O2含量為0.75%EDTA(pH 9.0)過氧化氫溶液修復后HE染色黑色素去除干凈,組織結構完整色彩亮麗,對比鮮明,核染色質清晰(見圖2)。

圖1 未脫色素HE染色

圖2 EDTA過氧化氫溶液高溫修復脫色素后HE染色

2.2 IHC染色 對照組未脫色素常規(guī)Maxvision法免疫組化化學染色,內源性濃密的黑色素顆粒與二氨基聯苯胺(Dia-minobenzidine,DAB)染色顯示的棕黃色相互混淆,無法判讀(見圖3);實驗組H2O2含量為0.75%EDTA(pH 9.0)過氧化氫溶液修復后Maxvision法免疫組織化學染色,黑色素去除干凈,陽性著色清晰,強度尚好,定位準確(見圖4)。

圖3 未脫色素Hmb45免疫組織化學染色

圖4 EDTA過氧化氫高溫修復脫色素后Hmb45免疫組織化學染色

3 討論

黑色素瘤是來源于黑色素細胞的一種高度惡性的腫瘤,多發(fā)生于皮膚,也可見于黏膜和內臟。免疫組織化學檢測常與組織病理檢查相結合用于輔助診斷和鑒別診斷,檢測指標主要包括反映細胞增殖的相關指標Ki-67、cyclin D1等,以及黑色素細胞的特征性標志物如S-100蛋白、SOX-10、MelanA、HMB45等。

常規(guī)免疫組織化學通常采用DAB顯色,陽性區(qū)域呈棕黃色顆粒與內源性棕黃色或棕褐色黑色素顆粒顏色近似,相互干擾,難以區(qū)分,診斷困難,容易誤診。因此需要進行脫色素處理。據文獻報道,國內外學者對脫黑色素進行了多種方法的探索,大致分為五類。第一類是在常規(guī)免疫組織化學染色DAB顯色后,運用不同的染液復染將黑色素顆粒顯色為不同程度的綠色[1-3],可與棕褐色的陽性顆粒區(qū)分,但無論使用哪種染液復染,都存在有過量黑色素在組織和細胞中堆積時物理遮蔽嚴重的現象,使得組織結構和細胞的形態(tài)不清,細胞的異型性和核分裂象觀察困難,并妨礙抗體與細胞中抗原結合,造成假陰性或染色減弱的現象,影響診斷,因此此方法不適合含大量黑色素組織。第二類是運用羅氏免疫組化ultra View Universal AP Red Delection Kit(AP染色液)來標記抗原,FR顯色使陽性顆粒為玫紅色與組織原有的棕褐色色素顆粒形成對比[4],但FR顯色切片不可使用乙醇類脫水劑脫水,接觸乙醇類脫水劑可使標記的紅色陽性顆粒褪色,導致實驗失敗;也不能使用二甲苯進行透明處理,影響切片的透明度和清晰度;并且FR顯色切片需使用水性封片劑封固,不利于切片的長期保存;同時也存在細胞中堆積過量黑色素時會妨礙抗體與細胞中抗原結合,造成假陰性或染色減弱的問題。第三類是在組織脫水前進行脫黑色素處理獲得滿意結果[5],但該方法耗時太長(36～40h),脫黑色素時間與黑色素含量成正比,脫色時間難以掌握,且對是否含有黑色素難以估計。第四類是運用不同濃度的高錳酸鉀脫黑色素[6],也是目前最經典常用的方法,但組織切片經強氧化劑脫黑色素處理后進行免疫組織化學檢測存在一定的問題:(1)這種傳統的脫色素方法費時長(2～4h),脫色素的時間與色素含量成正比,且對是否含有色素難以估計,脫色時間難以掌握;(2)草酸漂白時間不易控制,草酸漂白時要根據色素多少,隨時關注切片顏色變化,至組織不再脫色時應立即水洗終止反應,若漂白時間過短,脫色不干凈,若漂白時間過長,會出現細胞核淡然不著色,組織結構不清,影響閱片;(3)需考慮抗原的敏感性和特異性存在的差異[7],切片長時間浸泡在高錳酸鉀中會出現部分抗原丟失,抗原抗體結合位點失去活性的情況,從而出現弱陽性或假陰性的結果;(4)易造成組織掉片,可能是由于強氧化劑作用于切片破壞了玻片上的涂膠多聚賴氨酸陽離子基團的結構,使載玻片黏附力下降導致的,從而無法進行后續(xù)的免疫組織化學染色。第五類是用H2O2脫黑色素,H2O2對大部分抗原均適用,室溫下對抗原性基本無影響。劉興華等[8]采用DAB顯色后再用10%H2O2浸染,37℃過夜,出片時間會延遲1d,且若機染時復染了蘇木素,蘇木素也會被H2O2氧化為無色,脫色素后需再次復染蘇木素,增加了操作步驟,稍顯煩瑣。陳永華等[9]采用PBS(pH 7.4～7.6)、NaOH(pH 10.0)配制的1.8%H2O2溶液在70℃時經70～130min,陳瓊榮等[10]采用3%H2O2加熱至40℃持續(xù)90min快速升溫至55℃持續(xù)25min,或3%H2O2過夜處理,取得較好效果,但仍需耗時2h左右,變換的溫度也不易控制。

經閱讀大量文獻發(fā)現,H2O2脫黑色素優(yōu)于高錳酸鉀及其他黑色素染色法,但費時長的問題未得到解決。H2O2脫色素的能力與溫度和處理時間密切相關,溫度越高時間越長脫色素越徹底,但對組織結構的破壞和抗原性的丟失也越嚴重,所以運用H2O2法脫黑色素時,處理好溫度時間組織結構的完整性和抗原性的關系至關重要,既要保證色素去除干凈又要保證組織結構完整和抗原性不丟失。筆者考慮在H2O2脫黑色素方法的基礎上,繼續(xù)降低H2O2濃度提高溫度驗證是否能達到滿意的效果,經反復試驗,發(fā)現EDTA(pH 9.0)本身沒有脫色素的作用,但在EDTA(pH 9.0)修復液中加入H2O2使H2O2濃度為0.75%,富含黑色素組織切片在H2O2濃度為0.75%的EDTA(pH 9.0)過氧化氫溶液中修復,修復的同時可完全去除黑色素,對組織結構和抗原性沒有明顯影響,不影響組織修復,后續(xù)免疫組化及HE染色得到滿意的效果。

在H2O2濃度為0.75%的EDTA(pH 9.0)過氧化氫溶液中修復,高溫修復的同時去除黑色素的方法操作簡單方便,黑色素脫色均勻徹底,無論黑色素含量多少都可適用;組織完整性、抗原性均保留完整,減少了弱陽性和假陰性的出現;無須額外花時間脫色素,大幅縮短操作時間,避免了脫色時間、漂白時間、變化溫度等不易控制因素的干擾;該方法還可省略3%H2O阻斷這一步驟,節(jié)約時間減少成本,并可與不需脫色素組織同步操作;染色結束后可用酒精脫水二甲苯透明保證了切片的透明度和清晰度。值得廣大病理工作者借鑒。值得注意的是過氧化氫加熱易分解為H2O和O2,0.75%H2O2濃度極低不會有爆炸風險,但加熱過程中仍應保持敞口加熱。本實驗室富含黑色素的惡性黑色素瘤標本量較少,后續(xù)還需大量實驗數據進一步驗證。