基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動物實驗探討白藜蘆醇抗脊髓損傷作用機制

王國棟 聶興國 寇海龍 李 琦

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1 急救醫(yī)學(xué)科 2 骨外科三病區(qū),河南省新鄉(xiāng)市 453000

脊髓損傷是一種嚴重的創(chuàng)傷性疾病,會導(dǎo)致脊髓受損部分以下的身體運動和感覺缺陷,伴隨著生理、生化和結(jié)構(gòu)異常。脊髓損傷嚴重危害生理系統(tǒng),如心血管和免疫系統(tǒng)[1]。病人的生活質(zhì)量往往會受到嚴重影響。脊髓損傷的全球總發(fā)病率約為750/100萬人[2]。在目前的治療方法中,甲基強的松龍是成年期脊髓損傷患者的常用治療方法,而這種治療方法因其療效和副作用有限而備受爭議[3-4]。因此,迫切需要開發(fā)有效的脊髓損傷治療方法并探索其潛在機制。

白藜蘆醇是一種廣泛用于治療腦卒中的輔助藥物。白藜蘆醇對神經(jīng)具有保護作用,不僅可以改善腦缺血再灌注的預(yù)后,還可以影響腦損傷后的學(xué)習和記憶功能[5]。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇對脊髓缺血損傷具有保護作用[6],可促進脊髓損傷后功能恢復(fù)和軸突再生,改善組織學(xué)損傷[7],可有效預(yù)防脊髓損傷的繼發(fā)性損傷[8]。然而,其作用機制及治療靶點尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個基于系統(tǒng)藥理學(xué)研究藥物與疾病之間相互作用的發(fā)展領(lǐng)域[9]。它可以提供治療該疾病的藥物機制的全貌。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中,藥物靶向網(wǎng)絡(luò)對理解藥物的作用機制起著非常重要的作用。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,對白藜蘆醇抗脊髓損傷的主要機制進行研究。

1 資料與方法

1.1 白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點的獲得 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)搜集及Swiss(http://www.swisstargetprediction.ch/)平臺預(yù)測,獲得白藜蘆醇作用靶點。使用Gene card(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、Drug bank(https://www.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫搜集脊髓損傷相關(guān)靶點,并將所得靶點合并。使用韋恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對二者取交集,所得的交集靶點即為白藜蘆醇抗脊髓損傷的作用靶點。

1.2 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)的構(gòu)建 將白藜蘆醇抗脊髓損傷的作用靶點輸入STRING網(wǎng)站(https://cn.string-db.org/),獲得蛋白質(zhì)相互作用的文件。將此文件導(dǎo)入cytoscape,即可得白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖中,各靶點蛋白的點度中心性(degree)等參數(shù)的大小篩選關(guān)鍵作用靶點,其值越大說明在網(wǎng)絡(luò)中越重要[10]。

1.3 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點的GO與KEGG通路分析 將白藜蘆醇抗脊髓損傷的作用靶點導(dǎo)入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/),網(wǎng)站對其進行GO富集分析與KEGG通路分析。GO富集分析包括分子功能(MF)、生物過程(BP)和細胞組成(CC)三個部分。

1.4 驗證實驗

1.4.1 動物。雌性SD大鼠36只(8～12周齡),SPF級,體重180～200g,購自河南省實驗動物中心[許可證號為SCXK(豫) 2017-0001]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,溫度保持在(25±1)℃,每12h改變1次光/暗周期。大鼠隨機分為三組:假手術(shù)組、溶媒組和白藜蘆醇組。

1.4.2 脊髓損傷大鼠模型的建立。利用改進的Allen技術(shù)建立脊髓損傷模型。大鼠使用10%水合氯醛(0.33ml/100g)麻醉,以俯臥姿勢固定。以T10棘突為手術(shù)區(qū)域中心,背部中間切口為3～4cm,T9～10棘突后脊髓明顯暴露,椎板被切除。脊髓損傷通過快速下落的鈍頭沖擊針(重10g,直徑2mm)從30mm的高度迅速誘發(fā)。成功沖擊的跡象包括脊髓組織水腫、出血、延遲性癱瘓和糞便失禁。假手術(shù)組麻醉后僅行椎板切除術(shù),無脊髓挫傷。在脊髓損傷后2h,通過腹腔注射將白藜蘆醇(50mg/kg)和等量蒸餾水分別給予白藜蘆醇組和溶媒組的大鼠,此后1次/d,持續(xù)給藥2周。每天進行2次膀胱按摩,以幫助脊髓損傷后的大鼠排出尿液。

1.4.3 功能分析。在術(shù)前和脊髓損傷后1、3、7、14、21、28和35d根據(jù)Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)運動評定量表評估脊髓損傷后運動功能的恢復(fù)[11]。BBB評分范圍為0～21分。最低分為0分=完全癱瘓,最高分為21分=正常。平均得分用于反映各組運動功能恢復(fù)的進展。

1.4.4 白藜蘆醇對脊髓損傷大鼠AKT1、TNF、VEGFA mRNA表達的影響。使用Trizol試劑盒從組織中提取總RNA。使用Oligo(dT)12～18引物和Superscript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶從2μg總RNA合成cDNA。SYBR Green熒光染料檢測AKT1、TNF、VEGFA和GAPDH mRNA表達。引物序列如下:AKT1,上游 5’-ACCTCTGAGACCGACACCAG-3’,下游 5’-AGGAGAACTGGGGAAAGTGC-3’;TNF,上游 5’-TACTGAACTTCGGGGTGATTGGTCC-3’,下游 5’-CAGCCT TGTCCCTTGAAGAGAACC-3’;VEGFA,上游 5’-CCACGACAGAAGGGGAGCA-3’,下游 5’-GTGCTGGCTTTGGTGAGG-3’;GAPDH,上游5’-TATGACAACTCCCTCAAGAT-3’,下游5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’。兩步法擴增條件為:95℃先預(yù)變性30s;隨后 95℃ 5s,60℃ 20s,共進行35個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)源性參照,應(yīng)用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析。

1.4.5 免疫組化檢測脊髓組織中AKT1表達。大鼠麻醉、固定后,取出T9～10脊髓組織,石蠟包埋。切片脫蠟至水后,滴加3%過氧化氫,滅活內(nèi)源酶活性。5%山羊血清封閉1h后,滴加兔抗AKT1,4℃ 過夜。PBS沖洗后,滴加辣根過氧化物酶標記的二抗,37℃孵育20min。觀察二氨基聯(lián)苯胺顯色約5min,使用PBS及時停止反應(yīng)。切片用蘇木精復(fù)染。陰性對照用PBS代替一抗。奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 7.0對數(shù)據(jù)進行分析,并以均值±標準差表示。使用單因素方差分析評估多組之間的差異。使用Mann-WhitneyU檢驗評估BBB評分。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點的獲得 由圖1可見,白藜蘆醇作用靶點148個,脊髓損傷相關(guān)靶點1 027個,二者取交集,共獲得白藜蘆醇和脊髓損傷交集靶點即白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點48個。

圖1 白藜蘆醇與脊髓損傷相關(guān)靶點交集的韋恩圖

2.2 白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖 白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖中度中心性的大小,共篩選出關(guān)鍵作用靶點8個,即AKT1、TNF、IL-1B、VEGFA、IL-6、JUN、CASP3、HIF1A。排名前三的為AKT1、TNF、VEGFA。

圖2 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點蛋白的PPI圖

2.3 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點的GO富集分析結(jié)果 由圖3 GO富集分析結(jié)果可知,生物過程(BP)主要涉及活性氧代謝過程、細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等;細胞組成(CC)主要涉及薄膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等;分子功能(MF)主要涉及細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、受體配體活性等。

圖3 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點的GO富集分析圖

2.4 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點的KEGG通路分析結(jié)果 由圖4 KEGG通路分析結(jié)果可知,富集顯著的通路主要有:TNF 信號通路、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路等。

圖4 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點的KEGG通路圖

2.5 白藜蘆醇對脊髓損傷后大鼠運動功能改善作用 由圖5可知,溶媒組和白藜蘆醇組的BBB評分在受傷后第1天為0分。從第1～7天,溶媒組和白藜蘆醇組之間的BBB評分無顯著差異(P>0.05)。然而,在脊髓損傷后14、21、28和35d,白藜蘆醇組大鼠的BBB評分顯著高于溶媒組大鼠(P<0.05)。這些結(jié)果表明,脊髓損傷后白藜蘆醇的干預(yù)顯著改善了運動功能。

圖5 白藜蘆醇對脊髓損傷后大鼠運動功能改善作用

2.6 白藜蘆醇對脊髓損傷大鼠 AKT1、TNF、VEGFA mRNA表達的影響 與假手術(shù)組相比,溶媒組TNF mRNA表達明顯升高(P< 0.01),AKT1、VEGFA mRNA表達也有所升高。與溶媒組相比,白藜蘆醇組TNF mRNA表達明顯降低(P< 0.01),AKT1、VEGFA mRNA表達明顯升高(P<0.01),見圖6。

圖6 白藜蘆醇對脊髓損傷大鼠 AKT1、TNF、VEGFA mRNA表達的影響

2.7 免疫組織化學(xué)分析結(jié)果 AKT陽性細胞棕黃色,假手術(shù)組陽性細胞較少見。與假手術(shù)組相比,溶媒組AKT1陽性表達增加,而白藜蘆醇組AKT1表達明顯強于溶媒組,見圖7。

a b

3 討論

脊髓損傷(SCI)是由創(chuàng)傷引起的脊髓神經(jīng)功能損傷,通常會導(dǎo)致受傷節(jié)段以下的肢體嚴重功能障礙。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有明確的抗脊髓損傷的作用[5-8],但作用機制尚不明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對白藜蘆醇抗脊髓損傷的作用機制進行分析。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是利用生物信息學(xué)和藥理學(xué)揭示藥物與疾病的相互作用。本研究共獲得白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點48個,篩選出關(guān)鍵作用靶點8個,即AKT1、TNF、VEGFA、IL-1B、IL-6、JUN、CASP3、HIF1A。KEGG通路分析,富集顯著的通路主要有:TNF 信號通路、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路及MAPK信號通路等。表明白藜蘆醇主要通過上述靶點和通路發(fā)揮對脊髓損傷的治療作用。另外本研究根據(jù)白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中度中心性的大小,共篩選出關(guān)鍵作用靶點8個,其中排名前三的是AKT1、TNF和VEGFA。

研究表明,脊髓損傷后,活化的膠質(zhì)細胞會產(chǎn)生多種炎癥因子,如腫瘤壞死因子(TNF-α)等。據(jù)報道,脊髓損傷后24h內(nèi),炎癥因子水平顯著增加,并且在脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷中起關(guān)鍵作用,導(dǎo)致脊髓脫髓鞘和神經(jīng)元死亡[12]。TNF-α是淋巴T細胞分泌的促炎細胞因子,在炎癥和細胞凋亡等多種過程中發(fā)揮重要作用[13]。炎癥因子的產(chǎn)生會誘導(dǎo)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活,包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)。而下調(diào)各種炎癥介質(zhì)(包括TNF-α、IL-1β和IL-6)表達可減少潛在的炎癥損傷[14]。另外,Brunet A等[15]發(fā)現(xiàn)AKT或 PI3K/Akt通路與神經(jīng)元的存活密切相關(guān)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及神經(jīng)生長因子等可以通過激活A(yù)KT而介導(dǎo)或促進神經(jīng)細胞的存活[16]。Noshita N等[17]發(fā)現(xiàn)在缺血性腦損傷或創(chuàng)傷性腦損傷后,神經(jīng)元中的AKT活性顯著增強,與此同時神經(jīng)元的凋亡明顯減少,說明AKT的激活起神經(jīng)保護作用。胡凌云等[18]發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后抑制AKT的表達可阻止脊髓損傷后自發(fā)性運動功能恢復(fù)。Li E等[19]發(fā)現(xiàn)激活A(yù)KT1可減少脊髓水腫,促進脊髓修復(fù),恢復(fù)大鼠脊髓損傷后的行為功能。所以脊髓損傷后,激活的蛋白信號AKT可能是參與脊髓損傷后神經(jīng)保護和修復(fù)的重要環(huán)節(jié)。VEGF是一種內(nèi)皮特異性生長因子,在血管生成中起著重要作用。研究證明,在神經(jīng)系統(tǒng)中,VEGF對神經(jīng)具有保護作用,促進神經(jīng)再生并刺激神經(jīng)元的生長和存活[20]。VEGF信號通路的激活誘導(dǎo)VEGF蛋白表達增加,可以改善局部缺氧微循環(huán)環(huán)境,減少脊髓損傷繼發(fā)損傷,并促進運動功能的改善。劉曉陽等[21]發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后鞘內(nèi)注射VEGF對大鼠脊髓損傷引起的神經(jīng)纖維和神經(jīng)元的變性有保護作用并可恢復(fù)損傷神經(jīng)的部分功能。

隨后,筆者復(fù)制了脊髓損傷大鼠模型,對排名前三的關(guān)鍵作用靶點:AKT1、TNF和VEGFA進行實驗驗證。結(jié)果表明,與溶媒組相比,白藜蘆醇對脊髓損傷后大鼠運動功能具有明顯改善作用,并明顯降低TNF mRNA表達(P<0.01),升高AKT1、VEGF mRNA表達(P<0.01)。表明白藜蘆醇通過這些重要靶點發(fā)揮抗脊髓損傷作用。后續(xù)還需要進行進一步的實驗和臨床驗證來證實本研究的發(fā)現(xiàn)。

總之,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析闡明了白藜蘆醇對脊髓損傷的藥理作用。共有48個靶基因,其中AKT1、TNF、VEGFA是白藜蘆醇抗脊髓損傷的關(guān)鍵靶蛋白。GO和KEGG功能富集表明,白藜蘆醇靶向蛋白主要富集于TNF 信號通路、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路等。這表明白藜蘆醇主要通過上述靶點和通路發(fā)揮對脊髓損傷的治療作用。本研究可為脊髓損傷中白藜蘆醇的進一步研究提供理論基礎(chǔ)。