阿魏酸處理對桃果實采后病害與抗病物質代謝的影響

余 銳，趙曉春，楊英軍，余義和

(河南科技大學園藝與植物保護學院 河南洛陽 471023)

桃是我國公認的特色水果之一，是典型的呼吸躍變型果實，味道香甜，富含各種維生素和礦物質，具有較高的營養(yǎng)價值[1]。桃成熟期7—8 月份，正值夏季高溫，加上桃果實采后后熟極易變軟，易受病原菌等微生物侵染而腐爛，是比較難貯藏的果品之一[2]。低溫冷藏是延長桃果采后壽命和保持其品質的主要方法，但冷藏會影響桃果實的品質，造成生理失調，以及發(fā)生褐變、風味喪失等問題[3]?；瘜W殺菌劑可以有效防治桃果實采后病害，但由于其長期使用會對環(huán)境造成污染、嚴重的將會導致病原菌產生抗藥性等因素，進而受到越來越多的限制[4]。因此，通過優(yōu)化環(huán)境條件，應用某些化學物質或生長調節(jié)劑等方法，可以延長桃果實的保質期[5]。柚皮提取物在一定程度上能保持采后桃果實的較高硬度、可溶性固形物和抗壞血酸含量，以及延緩桃果實品質的下降[6]。

活性氧是植物應對外界刺激的關鍵信號分子，在不良環(huán)境條件下，活性氧會在植物體內大量積累，加速植物衰老?；钚匝醯拿复偾宄到y(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等，對于活性氧的清除起重要作用[7-9]。在采后果實貯藏過程中，果實品質與其抗氧化活性緊密相關。水果和蔬菜的抗氧化能力與總酚的含量有關，抗氧化能力已經成為果實品質的重要指標之一。在桃果實采后處理和貯藏過程中抗氧化物質會顯著發(fā)生變化，因此探究安全高效且適宜桃果實采后的保鮮技術一直是近年來的研究熱點。

阿魏酸廣泛存在于水果和蔬菜中，是植物中最為豐富的酚酸之一，具有清除自由基、抗氧化的作用，已被多個國家批準用作食品添加劑[10]。有研究報道，阿魏酸能顯著抑制病原菌活性，可以調節(jié)植物體內滲透壓，保持植物代謝的穩(wěn)定有序性[11]。在番茄中，阿魏酸處理對青霉病病原菌有直接抑制作用，能有效增加抗性相關物質的含量，保持果實的營養(yǎng)成分[12]。阿魏酸處理黑莓果實可以顯著抑制細胞壁降解，延緩果實軟化，從而延長其貯藏期[13]。阿魏酸還可以通過促進木質素的合成，加速細胞壁木質化，阻礙病原菌的進一步入侵[14]。但阿魏酸處理對桃果實采后的品質保持以及活性氧代謝的影響還鮮有報道。筆者旨在研究不同濃度的阿魏酸對采后大久保桃果實貯藏品質的影響，探究其生理機制，以期為采后貯藏保鮮提供理論參考（圖1）。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

試驗材料桃果實品種為大久保，采自洛陽偃師周邊的果園。樹齡在6 年以上，常規(guī)田間管理。將七成熟的桃果實用紙箱包裝，運到河南科技大學筆者實驗室進行后續(xù)處理。所選果實的大小和顏色一致，且無損傷和病蟲害。

將桃果實分別用50 毫克/升、100 毫克/升、200毫克/升阿魏酸和無菌水（對照）浸泡10 分鐘，于常溫25 ℃下貯藏。分別于處理后48、72、96 小時取樣測定果實褐斑病病斑直徑與發(fā)病率，處理后0、24、48、72、96 和120 小時取樣測定各項指標。設置3個生物學處理，每個處理隨機選取10 個果實。

1.2 病斑直徑和發(fā)病率

發(fā)病率（%）=發(fā)病個數(shù)/接種個數(shù)×100，以病斑直徑≥3.5 毫米確定為發(fā)?。▓D2）。

圖2 大久保感染褐斑病病果

病斑（菌落）直徑：利用游標卡尺十字交叉測定，然后取平均值。

1.3 生理指標

果實硬度通過質構儀進行測定。將果肉混合，研磨，過濾，取濾液測定糖酸含量。可滴定酸含量是用ZD-2 型自動電位滴定儀（上海金邁儀器有限公司，中國上海），以0.1 摩爾/升NaOH 滴定至終點pH值8.2 來測量的。使用手持便攜式糖量測定儀對可溶性固形物含量進行測定。維生素C 含量采用鄰菲啰啉比色法測定[15]。

1.4 總酚和總黃酮含量

總酚含量的測定：首先稱取2.0 克桃果肉組織，加4 毫升預冷提取液（4 ℃預冷，1% HCl-甲醇）。在冰浴條件下，將其研磨至勻漿。在4 ℃避光下條件下，提取15 分鐘，高速離心30 分鐘，收集濾液待用。取上清液于280 納米波長條件下測定其吸光度，以1%HCl-甲醇溶液作空白對照，3 次重復。

總黃酮含量的測定采用硝酸鋁比色法[16]。稱取0.5 克果肉組織，加入70% 乙醇50 毫升，稱其質量，經超聲處理30 分鐘，獲得樣品溶液。其反應體系包括0.3 毫升甲醇提取液，0.6% 的亞硝酸鈉，1.3% 的硝酸鋁，0.625 摩爾/升的NaOH。在510 納米下測定其吸光度值，對照使用甲醇代替提取液，以蘆丁作為標準制作標準曲線，提取液中總黃酮含量換算為每克樣品中蘆丁的含量（微克/克）。

1.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性

參考唐如雪等的方法[17]。隨機取1 克果肉，用5 毫升冰冷的提取液勻漿。反應體系含有50 毫摩爾/升磷酸緩沖液（pH 7.8）、13 毫摩爾/升蛋氨酸、75皮摩爾/升硝基四氮唑（NBT）、10 皮摩爾/升乙二胺四乙酸、2 皮摩爾/升核黃素和0.1 毫升酶提取物。將反應體系在日光燈下照射20 分鐘后，分別在560納米波長條件下測定吸光度。SOD 酶活性以單位/克表示。

1.6 過氧化氫酶（CAT）活性

參考Wang 等[18]的方法并稍作修改。過氧化氫（CAT）活性測定反應體系包括：2 毫升磷酸緩沖液（50 毫摩爾/升，pH 7.0）、0.5 毫升H2O2（40 毫摩爾/升）、0.5 毫升粗酶液。反應溫度設置30 ℃，以每分鐘240 納米處吸光值變化為1 個活性單位，CAT 酶活性以單位/克表示。

1.7 抗壞血酸氧化物酶（APX）活性

參考Nakano 等[19]的方法并稍作修改。標準測定混合物包括0.2 毫升粗酶液、2 毫升磷酸緩沖液（100 毫摩爾/升，pH 7.5）、0.5 毫升H2O2（0.5 毫摩爾/升）和0.8 毫升抗壞血酸（3 毫摩爾/升）。在25 ℃條件下，以每分鐘吸光度變化0.01 為1 個活性單位，APX 活性以單位/克表示。

1.8 谷胱甘肽還原酶（GR）活性

參考李燦嬰等[20]的方法測定并稍作修改。谷胱甘肽（GR）測定反應體系包括：3 毫升磷酸緩沖液（100 毫摩爾/升，pH 7.5），0.1 毫升氧化型谷胱甘肽（5 毫摩爾/升）和0.03 毫升NADPH（3 毫摩爾/升）以及0.2 毫升酶液，最后加入NADPH 啟動酶促反應。在240 納米處測定吸光值，以每分鐘OD 值變化0.01 為1 個活性單位，GR 活性單位以單位/克表示。

1.9 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS17.0（IBM，Inc.)進行數(shù)據(jù)分析，所有試驗均設置3 次重復。實驗結果通過Excel 2010 軟件進行統(tǒng)計和整理。試驗差異性用標準t檢驗表示。*是p＜0.05：表示兩組數(shù)據(jù)之間顯著性差異，**是p＜0.01：表示兩組數(shù)據(jù)之間極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 不同濃度阿魏酸處理對桃果實貯藏期間褐腐病的影響

病斑直徑和發(fā)病率是衡量病原菌對采后果實危害嚴重程度的重要指標。如圖3 所示，將采后桃果實分別在0（對照）、50、100、200 毫克/升的阿魏酸溶液中浸泡10 分鐘，放置在室溫下統(tǒng)計桃果實的病斑直徑和發(fā)病率。隨著貯藏時間的延長，阿魏酸處理后的桃果實病斑直徑顯著低于對照，其中100 毫克/升的阿魏酸處理效果最好（圖3-A）。如圖3-B 所示，對照組和處理組采后桃果實發(fā)病率隨著貯藏時間的增加而升高，并且對照組的發(fā)病率始終顯著高于處理組。至貯藏96 小時，對照組與處理組發(fā)病率達到一致，果實幾乎全部發(fā)病。結果表明，阿魏酸處理能夠降低桃果實病害的發(fā)病率，其中100 毫克/升的阿魏酸處理效果最佳，能有效抑制病斑直徑的擴展。

圖3 不同濃度阿魏酸處理對采后桃病斑直徑和發(fā)病率的影響

2.2 阿魏酸處理對采后桃果實貯藏品質的影響

果實硬度是衡量果實貯藏性狀的重要指標之一，能直觀地反映果實在貯藏過程中的軟化程度。如圖4-A 所示，桃果實在貯藏過程中硬度逐漸下降，與對照組相比，阿魏酸處理后顯著延緩了桃果實貯藏期間硬度的變化?？傻味ㄋ幔═A）含量是評價采后果實風味的關鍵指標。桃果實TA 含量在貯藏期間呈下降趨勢，對照組桃果實TA 含量下降速度明顯高于阿魏酸處理（圖4-B）。可見，阿魏酸處理能在一定程度上抑制果實TA 含量下降，有效維持采后果實品質。果實的可溶性固形物（TSS)含量和維生素C（Vc)是判定果實成熟度和果實內在品質的重要指標。在貯藏期間桃果實TSS 含量變化大體呈先上升后降低趨勢，在96 小時阿魏酸處理桃果實TSS 含量顯著高于對照（圖4-C）。與對照相比，阿魏酸處理延緩Vc 含量降低，且72 和96 小時時Vc含量顯著高于對照（圖4-D）。這些結果表明，阿魏酸處理可以明顯維持采后桃果實硬度，顯著延緩TA、TSS 和Vc 含量的下降，有利于保持果實風味，防止果實品質下降。

圖4 阿魏酸處理對桃果實采后貯藏品質的影響

2.3 阿魏酸處理對桃果實采后貯藏期間總酚含量和總黃酮含量的影響

總酚和總黃酮是植物體內直接的抗菌物質，反映植物對外界刺激的應答能力，二者的含量直接影響植物抗逆性能。如圖5-A 所示，總酚含量均呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，在貯藏72 和120 小時，阿魏酸處理總酚含量明顯高于對照。如圖5-B 所示，總黃酮含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，隨著貯藏時間延長，可以看出96 和120 小時時阿魏酸處理后的桃果實總黃酮含量要高于對照組。由此可見，在采后桃果實貯藏過程中，阿魏酸處理明顯抑制總酚和總黃酮含量的下降。

圖5 阿魏酸處理對桃果實采后貯藏期間總酚含量和總黃酮含量的影響

2.4 阿魏酸處理對桃果實采后貯藏期間抗氧化酶活性的影響

如圖6 所示，在采后桃果實貯藏期間，與對照相比，阿魏酸處理桃果實后超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽還原酶（GR）活性均先升高后降低。在貯藏第48 小時，阿魏酸處理桃果實后其體內SOD、CAT 和GR 活性顯著高于對照（圖6-A，6-B，6-D）。隨著貯藏時間的延長，采后桃果實中抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性先下降、再升高、再下降，但阿魏酸處理后72 和96 小時桃果實中APX 活性顯著高于對照（圖6-C）。這些結果表明，阿魏酸可以抑制采后桃果實抗氧化酶活性降低，延緩果實品質下降。

圖6 阿魏酸處理對桃果實抗氧化酶活性的影響

3 討 論

目前植物酚類物質對采后果蔬的保鮮機制受到廣泛關注，一些研究已被證實作為植物酚類物質的阿魏酸處理可以有效提高并保持果蔬的品質，控制采后病害發(fā)生[21-22]。阿魏酸處理被用作番茄果實貯藏保鮮的新方法，可以顯著提高采后番茄品質，并有效抑制病害發(fā)展[12]。筆者在本研究中通過不同濃度的阿魏酸浸泡處理采后大久保桃果實，發(fā)現(xiàn)100 毫克/升的阿魏酸處理效果最好，有效抑制病斑直徑擴展，發(fā)病率顯著降低。酚類化合物和黃酮類化合物具有殺菌和消除自由基等生物抗逆活性，在莽吉柿中研究發(fā)現(xiàn)總黃酮含量與抗菌活性呈正相關[23]。阿魏酸處理蘋果果實后，酚類和黃酮類含量明顯高于對照組，顯著增強其抗病菌能力[14]。在本研究中，與上述研究一致，阿魏酸處理后桃果實體內的總酚和總黃酮含量大體都高于對照，在一定程度上說明阿魏酸處理可以提高果實的抑菌及抗病能力。

抗氧化酶在果實體內發(fā)揮多種作用，果實采后活性氧水平對果實衰老進程至關重要。阿魏酸處理能提高活性氧代謝酶活性以及抗氧化劑水平，降低蘋果果實體內H2O2和MDA 的含量[24]。蛋氨酸處理顯著提高采后桃果實內GR 活性、APX 活性和CAT活性，提高桃果實的抗病菌能力[25]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，阿魏酸處理采后桃果實能提高桃果實體內的SOD 和CAT 活性。果實中SOD 可以將超氧陰離子分解成H2O2，而CAT 可以專一地將H2O2分解成H2O 和O2，從而提高果實的抗病能力。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，阿魏酸處理采后桃果實能提高桃果實體內的APX 和GR 活性，進而促進桃果實清除活性氧的積累，延緩果實衰老進程。

采后桃果實在貯藏期間有多種衡量其品質的指標，包括果實硬度、TA 和TSS 含量等。1-甲基環(huán)丙烯是一種新型乙烯抑制劑，能有效增強多種果實的抗氧化能力，延緩果實硬度下降，提高果實抗逆境能力[26]。褪黑素處理有效維持了花椰菜體內的維生素C、可溶性蛋白和可溶性固形物含量，顯著提升了花椰菜采后貯藏品質[27]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，阿魏酸處理采后桃果實能有效維持果實硬度變化，延緩桃果實體內TA、TSS 和Vc 含量的下降，進而保持采后桃果實的品質。

4 結 論

筆者在本研究以采后大久保桃果實為試驗材料，通過不同濃度的阿魏酸處理果實，發(fā)現(xiàn)能有效抑制褐斑病病斑直徑的擴展，降低褐斑病病菌的發(fā)病率，其中100 毫克/升的阿魏酸處理效果最好。通過對阿魏酸處理后桃果實的生理指標測定，發(fā)現(xiàn)阿魏酸能維持采后果實硬度，延緩TA、TSS 和Vc 含量的下降，并提高果實的抗氧化酶活性。這些結果表明，阿魏酸處理可以提高桃采后果實的品質，延緩果實衰老，可以作為桃果實采后貯藏保鮮的一種新試劑。但是，阿魏酸處理誘導桃果實抗病性和提高果實抗氧化酶活性的相關機制尚待進一步研究。